申请/专利权人：天津工微生物科技有限公司

申请日：2017-08-01

公开（公告）日：2020-07-24

公开（公告）号：CN107312806B

主分类号：C12P17/12(20060101)

分类号：C12P17/12(20060101);C12N9/02(20060101);C12N15/53(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.24#授权;2017.11.28#实质审查的生效;2017.11.03#公开

摘要：本发明公开了一种酶法生产5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸。本发明提供了特定蛋白质在制备5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸中的应用；所述特定蛋白质为如下a1或a2：a1醛脱氢酶；a2在a1的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。本发明首次利用特定的酶高效地实现了5‑甲基吡嗪‑2‑羧酸的一步化生产。本发明工艺简单，所有原料和酶在一个反应器内一步反应即可制备5‑甲基‑2‑吡嗪酸，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，催化氧化反应基本上不受产物5‑甲基‑2‑吡嗪酸的抑制，高浓度的转化可以获得高收率，简化了提取工艺，有利于大规模工业化生产。

主权项：1.特定蛋白质在以5-甲基-2-吡嗪醛为原料制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用；所述特定蛋白质为如下（a1）或（a2）：（a1）醛脱氢酶；所述醛脱氢酶的氨基酸序列如序列表中SEQIDNO：2所示；（a2）在（a1）的C端连接His6标签得到的融合蛋白质。

全文数据：一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。背景技术[0002]5_甲基P比嗪_2_駿酸（5-Methylpyrazine-2-carboxylicacid是一种重要的药物中间体，主要用于合成第二代磺脲类降血糖药格列吡嗪Glipizide，新一代长效降血脂药阿昔莫司Acipimox和治疗结核病的有效药物PAE。[0003]现有5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法包括化学合成法、电化学合成法和生物合成法，其中化学合成法已实现工业化。[0004]现行的化学合成法较多的是采用2,5_二甲基吡嗪为原料，经双氧水氧化得到N-氧代-2,5-二甲基吡嗪后与乙酸酐反应生成2-乙酰氧甲基-5-甲基吡嗪，然后碱水解得到2-羟甲基-5-甲基吡嗪，最后通过高锰酸钾氧化得到目标产物。该方法收率较低且操作安全性低。[0005]CN1141299C《用KMnO4—步氧化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法》公开了一种用KMnO4—步氧化制备5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。该方法以2.5-二甲基吡嗪为原料，在抑制剂的存在下，加入KMnO4溶液反应，热过滤除去MnO2的滤液经浓缩，酸析，过滤得到部分5-甲基吡嗪-2-羧酸。这种方法由于制备过程中使用大量的高价金属盐，容易生成大量废水，不符合现代化工的环保要求。[0006]本领域迫切需要开发新的高效生产5-甲基吡嗪-2-羧酸的方法。发明内容[0007]本发明的目的是提供一种酶法生产5-甲基吡嗪-2-羧酸。[0008]本发明首先保护特定蛋白质在制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用；[0009]所述特定蛋白质为如下al或a2:[0010]al醛脱氢酶；[0011]a2在al的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。[0012]所述标签见表1。[0013]表1标签的序列[0014][0015][0016]本发明还保护特定蛋白质在以5-甲基-2-吡嗪醛为原料制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用；[0017]所述特定蛋白质为如下al或a2:[0018]al醛脱氢酶；[0019]a2在al的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。[0020]以上任一所述醛脱氢酶是如下bl或b2:[0021]bl由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；[0022]b2将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。[0023]本发明还保护一种5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法，包括如下步骤:采用所述特定蛋白质催化5-甲基-2-吡嗪醛转化为5-甲基吡嗪-2-羧酸。[0024]所述催化反应体系由缓冲液、底物、特定蛋白质和NAD+组成。[0025]所述缓冲液为0·5MTris-HClpH为8·0。[0026]所述底物为5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为20mM。[0027]所述特定蛋白质在反应体系中的浓度为1000UL。[0028]所述NAD+在反应体系中的浓度为20mM。[0029]所述催化反应条件为30°C、200rpm反应12h。[0030]本发明还保护一种5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法，包括如下步骤：[0031]1将重组菌进行诱导表达，然后收集菌体并进行菌体破碎，然后收集上清液;所述重组菌为具有编码所述特定蛋白质的基因的重组菌；[0032]⑵从步骤⑴得到的上清液中纯化所述特定蛋白质；[0033]3采用步骤⑵得到的特定蛋白质催化5-甲基-2-吡嗪醛转化为5-甲基吡嗪-2-羧酸。[0034]所述“编码所述特定蛋白质的基因”为如下cl-c3中任一所述的DNA分子：[0035]cl编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；[0036]c2在严格条件下与（cl限定的DNA序列杂交且编码权醛脱氢酶的DNA分子；[0037]c3与（cl或（c2限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码醛脱氢酶的DNA分子。[0038]所述重组菌是将重组质粒导入出发菌株得到的；所述重组质粒为将pET21a+载体的NdeI和Xhd酶切位点间的小片段替换为了序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组质粒;所述出发菌为大肠杆菌。所述出发菌具体可为大肠杆菌BL21DE3。[0039]所述步骤⑴中，所述“将重组菌进行诱导表达”具体为:将所述重组菌在含氨苄青霉素的LB液体培养基中培养至菌液0D6QQnm=1-2;向培养体系中加入IPTG进行诱导。所述LB液体培养基中，氨苄青霉素的浓度为SOygmL。所述培养条件为37°C、220rpm培养。所述IPTG的浓度为30ppm。所述诱导的条件为30°C、220rpm诱导16h。[0040]所述步骤⑴中，所述“收集菌体并进行菌体破碎，然后收集上清液”具体为：收集菌体，用磷酸缓冲液重悬所述重组菌菌体后超声，将超声破碎产物离心后收集上清液。所述磷酸缓冲液为20mMpH7.5磷酸缓冲液。所述超声的功率为250W，超声时间为20min超声5s，停IOs。所述离心的条件为4°C、12000Xg离心lh。[0041]所述步骤⑵中，纯化采用镍柱GEHealthcareBio-scienceAB，货号：17-5248-01和脱盐柱抑^HealthcareBio-scienceAB，货号：17-1408-01实现。[0042]所述步骤⑶中，所述催化反应体系由缓冲液、底物、特定蛋白质和MD+组成。[0043]所述缓冲液为0·5MTris-HClpH为8·0。[0044]所述底物为5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为20mM。[0045]所述特定蛋白质在反应体系中的浓度为1000UL。[0046]所述NAD+在反应体系中的浓度为20mM。[0047]所述催化反应条件为30°C、200rpm反应12h。[0048]本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述特定蛋白质和5-甲基-2-吡嗪醛;所述试剂盒的用途为制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。所述试剂盒中还包括0.5MTris-HClpH为8.0。所述试剂盒中还包括NAD+。[0049]本发明还保护一种试剂盒，包括以上任一所述重组菌和5-甲基-2-吡嗪醛;所述试剂盒的用途为制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。所述试剂盒中还包括0.5MTris-HClpH为8.0。所述试剂盒中还包括NAD+。[0050]本发明首次利用特定的酶高效地实现了5-甲基吡嗪-2-羧酸的一步化生产。本发明工艺简单，所有原料和酶在一个反应器内一步反应即可制备5-甲基-2-吡嗪酸，不涉及中间步骤和反应，极大地简化了工艺流程，催化氧化反应基本上不受产物5-甲基-2-吡嗪酸的抑制，高浓度的转化可以获得高收率，简化了提取工艺，有利于大规模工业化生产。附图说明[0051]图1为pET21a_xylc质粒图谱。[0052]图2为5-甲基-2-吡嗪羧酸标准品液相色谱图。[0053]图3为5-甲基-2-吡嗪羧酸标准曲线。[0054]图4为核磁共振碳谱CNMR图。[0055]图5为核磁共振氢谱HNMR图。[0056]图6为产物5-甲基-2-吡嗪羧酸结构式。具体实施方式[0057]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。[0058]假单胞菌pseudomonasputida来源的xylc基因如序列表的序列1所示。假单胞菌pseudomonasputida来源的醛脱氢酶蛋白如序列表的序列2所示。序列1所示的基因编码序列2所述的蛋白质。[0059]5-甲基-2-吡嗪醛:北京伊诺凯科技有限公司，CAS:50866-30-3。[0060]pET21a+质粒:Novagen，产品目录编号：69740-3CN。[0061]大肠杆菌BL21DE3:天根生化科技北京有限公司，货号:CB105-02。[0062]实施例1、高表达假单胞菌pseudomonasputida来源xyIc基因的重组表达载体[0063]采用序列表的序列1所示的双链DNA分子取代pET21a+质粒的NdeI和XhoI酶切位点间的小片段，得到重组表达载体pET21a-xylc质粒图谱见图1。[0064]实施例2、醛脱氢酶的制备[0065]1、将实施例1制备的重组表达载体pET21a-xylc转化大肠杆菌BL21DE3，得到重组菌。重组菌表达可以得到C端融合有His6标签的醛脱氢酶蛋白。[0066]2、将步骤1得到的重组菌接种于含有50ygmL氨苄青霉素的LB液体培养基中，37°C、220rpm培养至菌液OD6QQnm=1-2，向培养体系中加入30ppmIPTG，30°C、220rpm诱导16h。[0067]3、完成步骤2后，将培养体系8000rpm离心，收集菌体沉淀。[0068]4、完成步骤3后，采用20mMpH7.5磷酸缓冲液重悬菌体后超声，超声功率为250W，超声时间为20min超声5s，停IOs。[0069]5、完成步骤4后，将超声破碎产物4°C、12000Xg离心Ih后收集上清液。[0070]6、对步骤5得到的上清采用镍柱（GEHealthcareBio-scienceAB，货号：17-5248-01进行纯化，将上清液加载到镍柱，依次采用流动相A和流动相B洗脱，收集流动相B的洗脱液;再对洗脱液采用脱盐柱GEHealthcareBio-scienceAB，货号：17-1408-01进行脱盐处理，采用流动相C洗脱，最终得到纯化后的蛋白溶液。[0071]流动相A:20mMpH7.5磷酸缓冲液（含20mM咪唑和0.5MNaCl;流动相B:20mMpH7.5磷酸缓冲液含200mM咪唑和0.5MNaCl;流动相C:20mMpH7.5磷酸缓冲液。[0072]7、对步骤6得到的纯化后的蛋白溶液进行蛋白定量，蛋白浓度为6.4mgml。[0073]8、对步骤6得到的纯化后的蛋白溶液进行醛脱氢酶酶活力检测；反应体系中加入5-甲基-2-吡嗪醛、NAD+和待测蛋白溶液IyL，H20定容至Iml。5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为IOmM，NAD+在反应体系中的浓度为5mM。[0074]待测蛋白溶液:采用20mMpH7.5磷酸缓冲液将步骤6得到的蛋白溶液稀释至浓度为lmgmL。[0075]采用分光光度计（仪器型号：UV-1800PC型）在线监测5min后，根据NADH在340nm的消光系数6.22CHT1·mmor1计算得到酶的比活力为5Umg。[0076]酶的比活力（Umg=OD34〇nmX10006.22cm—1·mmol-1X1cmX5miηX1mg·mL—1X0.OOlmL[0077]实施例3、醛脱氢酶制备5-甲基-2-吡嗪羧酸[0078]反应体系（Iml由缓冲液、底物、醛脱氢酶和NAD+组成;缓冲液:0.5MTris-HClpH为8.0;底物:5-甲基-2-吡嗪醛，5-甲基-2-吡嗪醛在反应体系中的浓度为20mM;醛脱氢酶：实施例2步骤6得到的醛脱氢酶蛋白溶液，醛脱氢酶在反应体系中的浓度为1000UL;NAD+在反应体系中的浓度为20mM。[0079]反应条件：30°C、200rpm反应12h。[0080]反应结束后将反应体系稀释10倍后HPLC检测产物浓度。[0081]HPLC色谱条件：仪器型号：Agilent1200Series;色谱柱:Nucleosil100C18,4.6X250mm，5μπι;柱温：25°C;紫外检测波长：275nm;采集时间：IOmin;进样量：5yL;流速：1.00mLmin;流动相由A相和B相组成，A相为0.1%体积百分含量TFA水溶液，B相为乙腈，A相和B相的体积比为80:20。[0082]采用5-甲基-2-吡嗪羧酸作为标准品（上海百舜生物科技有限公司，CAS:5521-55-1Ο[0083]标准品色谱图见图2，5-甲基-2-吡嗪羧酸标准品的出峰时间为3.776min;在相同条件下出峰位置为±〇.5min以内，可以认定为同一物质。[0084]5-甲基-2-吡嗪羧酸标准曲线见图3。[0085]收集5-甲基-2-吡嗪羧酸对应的洗脱峰，通过核磁一步验证产物表征。[0086]核磁共振碳谱CNMR图见图4。核磁共振氢谱HNMR图见图5。[0087]经过上述检测，结果表明，产物为5-甲基-2-吡嗪羧酸结构式如图6所示）；每个反应体系底物消耗量为88%约17.6〇11^，得到产物5-甲基-2-吡嗪羧酸的量为17.0211^。

权利要求：1.特定蛋白质在制备5-甲基P比嗪-2-羧酸中的应用；所述特定蛋白质为如下al或a2:al醛脱氢酶；a2在al的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述醛脱氢酶是如下bl或b2:bl由序列表中序列2所不的氨基酸序列组成的蛋白质；b2将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。3.特定蛋白质在以5-甲基-2-吡嗪醛为原料制备5-甲基吡嗪-2-羧酸中的应用；所述特定蛋白质为如下al或a2:al醛脱氢酶；a2在al的N端或和C端连接标签得到的融合蛋白质。4.如权利要求3所述的应用，其特征在于:所述醛脱氢酶是如下bl或b2:bl由序列表中序列2所不的氨基酸序列组成的蛋白质；b2将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且与具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。5.—种5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法，包括如下步骤:采用权利要求1或2中所述的特定蛋白质催化5-甲基-2-P比嗪醛转化为5-甲基P比嗪-2-羧酸。6.—种5-甲基吡嗪-2-羧酸的制备方法，包括如下步骤：1将重组菌进行诱导表达，然后收集菌体并进行菌体破碎，然后收集上清液;所述重组菌为具有编码权利要求1或2中所述的特定蛋白质的基因的重组菌；⑵从步骤⑴得到的上清液中纯化所述特定蛋白质；⑶采用步骤⑵得到的特定蛋白质催化5-甲基-2-吡嗪醛转化为5-甲基吡嗪-2-羧酸。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于:所述“编码权利要求1或2中所述的特定蛋白质的基因”为如下cl-c3中任一所述的DNA分子：cl编码区如序列表中序列1所示的DNA分子；c2在严格条件下与cl限定的DNA序列杂交且编码权醛脱氢酶的DNA分子；c3与cl或c2限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码醛脱氢酶的DNA分子。8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于:所述重组菌是将重组质粒导入出发菌株得到的；所述重组质粒为将pET21a+载体的NdeI和Xhd酶切位点间的小片段替换为了序列表的序列1所示的双链DNA分子得到的重组质粒;所述出发菌为大肠杆菌。9.一种试剂盒，包括特定蛋白质和5-甲基-2-吡嗪醛;所述试剂盒的用途为制备5-甲基P比嗪-2-羧酸。10.—种试剂盒，包括重组菌和5-甲基-2-吡嗪醛;所述试剂盒的用途为制备5-甲基吡嗪-2-羧酸。

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