申请/专利权人：中国科学院植物研究所

申请日：2018-03-21

公开（公告）日：2020-07-24

公开（公告）号：CN108179222B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101);C12N15/61(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.24#授权;2018.07.13#实质审查的生效;2018.06.19#公开

摘要：本发明公开了一种与水稻高产相关的分支酸变位酶核苷酸序列及其应用。本发明所提供的筛选具有不同产量性状的水稻的方法，可包括如下步骤：1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OSCM3，存在OSCM3_a和OSCM3_b两种等位形式，所述OSCM3_a如序列表的序列1所示，所述OSCM3_b如序列表的序列2所示；2进行如下判定：在毗邻生长条件下比较两个基因型，为OSCM3_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OSCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量。实验证明，本发明提供的方法可有效筛选具有不同单株产量性状的水稻，且操作简单，准确率高，在水稻育种中具有重要的应用价值。

主权项：1.一种筛选高产水稻的方法，为方法甲或方法乙；所述方法甲包括如下步骤：（1）检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsCM3，存在OsCM3_a和OsCM3_b两种等位形式，所述OsCM3_a如序列表的序列1所示，所述OsCM3_b如序列表的序列2所示；（2）进行如下判定：在邻近生长条件下，基因型为OsCM3_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OsCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量；所述方法乙包括如下步骤：（1）以待测水稻的基因组DNA为模板，采用特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为OsCM3_a纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsCM3_b纯合型；所述特异引物对，由引物1和引物2组成；所述引物1为序列表的序列3所示的单链DNA分子；所述引物2为序列表的序列4所示的单链DNA；（2）进行如下判定：在邻近生长条件下，基因型为OsCM3_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为OsCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量。

全文数据：与水稻高产相关的分支酸变位酶核苷酸序列及其应用技术领域[0001]本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种与水稻高产相关的分支酸变位酶核苷酸序列及其应用。背景技术[0002]随着全球人口的增长，培育高产作物的需求与日倶增。水稻OryzasativaL.是地球上多数人依赖的主食来源之一。在水稻中寻找影响高产的基因组片段，并建立有效评估该基因组片段对产量影响的具体方法，对分子育种的发展有重要推动作用。育种过程中有针对性地选取亲本材料对最终培育出具高产性状的水稻品种有重要的价值。目前科学和技术的发展已经为获得水稻中影响高产性状的基因组成分、深度利用水稻基因的自然变异提供了可能。[0003]在实践中，育种方法大多依赖可见性状或和分子标记。对与产量相关基因的鉴定目前大多局限于对突变体的分析等手段。由于影响水稻产量性状的因子较为复杂，多种基因的作用和环境对它们的影响均可能使有效评价基因组片段对产量的影响变得困难。显然对产量而言，分子育种的一个制约因素是在大田条件下采取有效的实验设计，以便确定哪些基因或分子片段适合作为选择条件。结合水稻在大田的表现与其功能基因的定量研究对农业育种可以起到指导作用。发明内容[0004]本发明提供了一个被证明可以增加水稻产量的基因序列及其专用特异引物对，并以此为例建立了一个有效评价基因序列影响产量的方法。[0005]本发明所提供的筛选方法适于选择高产的水稻方法甲），包括如下步骤：[0006]1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，存在至少0SCM3_a*0SCM3_b两种等位形式，所述05010_如序列表的序列1所示，所述0SCM3_t^n序列表的序列2所不；[0007]2进行如下判定:在邻近生长条件下，基因型为0SCM3_Mi合型的水稻群体的平均产量高于基因型为〇SCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量。[0008]所述邻近生长条件为同一地理区域内相邻且同等生长条件。[0009]本发明所提供的筛选方法适于选择高产的水稻方法乙），可包括如下步骤：[0010]1以待测水稻的基因组DNA为模板，采用下述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为0301〇_纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为0SCM3J^合型；[0011]2进行如下判定:在邻近生长条件下，基因型为0SCM3_Mi合型的水稻群体的平均产量高于基因型为〇SCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量。[0012]本发明还可以提供一种高产水稻的筛选方法，为方法A或方法B;[0013]所述方法A包括如下步骤：[0014]1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为0sCM3，存在0sCM3_a*0sCM3_b两种等位形式，所述〇8〇10_如序列表的序列1所示，所述0sCM3J^n序列表的序列2所示；[0015]2进行如下判定：同等生长条件下，基因型为0sCM3_b纯合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为〇sCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量；[0016]所述方法B包括如下步骤：[0017]1以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求4所述特异引物对进行PCR扩增;如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为合型;如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为0sCM3_b纯合型；[0018]2进行如下判定：同等生长条件下，基因型为0sCM3_b纯合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为〇sCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量。[0019]上述同等生长条件可以为相同地理区域的同等生长条件或不同地理区域的同等生长条件。[0020]生长条件指自然环境土壤、温度、湿度和养分等和人工管理施肥、农药使用、驱鸟和驱病虫害等）。[0021]本发明还提供了一种水稻选育方法方法丙），可包括如下步骤：[0022]1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为0SCM3，存在0SCM3_a*0SCM3_b两种等位形式，所述03010_如序列表的序列1所示，所述0SCM3J^n序列表的序列2所示；[0023]2基因型为0SCM3_b纯合型的水稻为选育的目的水稻。[0024]本发明还提供了一种水稻选育方法方法丁），可包括如下步骤：[0025]1以待测水稻的基因组DNA为模板，采用下述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为0301〇_纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为0SCM3J^合型；[0026]2基因型为0SCM3_b纯合型的水稻为选育的目的水稻。[0027]所述目的水稻为产量高的水稻。[0028]本发明还保护一种DNA片段，为0sCM3_b;[0029]所述〇^^13」3可为如下（dl或（d2:[0030]dl序列表的序列2所示的DNA分子；[0031]d2将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。[0032]0sCM3_a基因和0sCM3_b基因为等位基因。[0033]上述中的，“取代和或缺失和或添加”发生的位置位于序列表的序列1所示的0sCM3_a基因与序列表的序列2之间的差异以外的区域。[0034]本发明所提供的用于扩增上述DNA片段的引物对，由引物1和引物2组成；[0035]所述引物1可为如下al或a2:[0036]al序列表的序列3所示的单链DNA分子；[0037]a2将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；[0038]所述引物2可为如下bl或b2:[0039]bl序列表的序列4所示的单链DNA;[0040]b2将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。[0041]上述DNA片段或上述特异引物对的应用也是本发明保护的范围，为如下（el或e2或e3或e4:[0042]el筛选高产水稻；[0043]e2筛选具有不同产量性状的水稻；[0044]e3鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；[0045]e4鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。[0046]为解决上述技术问题，本发明还提供了一种试剂盒，包括所述特异引物对。所述试剂盒中还可包括用于提取水稻基因组DNA的常规试剂和或用于进行PCR扩增的常规试剂和或用于进行测序的常规试剂。[0047]所述试剂盒的用途为如下el或e2或e3或e4:[0048]el筛选高产水稻；[0049]e2筛选具有不同产量性状的水稻；[0050]e3鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；[0051]e4鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。[0052]所述试剂盒的制备方法也属于本发明的保护范围。所述试剂盒的制备方法包括将所述试剂盒中各条引物分别单独包装的步骤。[0053]所述DNA片段、所述特异引物对、所述试剂盒或以上任一所述方法在水稻育种中的应用也属于本发明的保护范围。所述水稻育种的育种目标为获得产量高的水稻。[0054]上述任一所述产量可为单株产量。上述任一所述产量可为籽粒产量。[0055]本发明还提供一种鉴定优势等位基因的方法，包括如下步骤:通过比较不同群体的生物性状差异，确定具有优势性状的等位基因；所述不同群体中，每个群体均由所述等位基因纯合的个体组成。[0056]所述生物可为有性繁殖生物，具体可为植物，更具体可为水稻。[0057]所述性状可为可测量性状，具体可为产量性状，更具体可为籽粒产量性状。[0058]实验证明，利用本发明提供的方法可筛选具有不同单株产量性状的水稻，操作简单，准确率高，在水稻育种中具有重要的应用价值。具体实施方式[0059]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。[0060]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0061]下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。[0062]实施例1、引物的设计与合成[0063]分支酸是水稻体内的重要中间物质。在水稻基因组中，已经有若干个基因被注释为编码分支酸变位酶^EC5.4.99.5。如编码分支酸变位酶3chorismatemutase3，CT829390.1;0SCM3的基因（以下简称为0SCM3基因）。位于水稻的第一号染色体上。通过大量预实验和序列比对，本发明的发明人发现0SCM3基因中存在两种等位基因片段一种等位基因片段如序列表的序列1所示，命名为等位基因片段〇SCM3_a;另一种等位基因片段如序列表的序列2所示，命名为等位基因片段0SCM3_b，它们和水稻单株产量具有相关性。[0064]根据上述两种等位基因片段设计特异引物对，由引物1和引物2组成。[0065]引物1序列表中序列3:5’-CTGTTGCCACCTCTCCAGT-3’；[0066]引物2序列表中序列4:5’-TCTCCTCAGCAAGTAGGCTACT-3’。[0067]实施例2、水稻中基于所述等位基因片段的分型方法的建立[0068]建立的方法如下：[0069]1、以待测水稻的基因组DNA约10〜IOOng为模板，采用引物1和引物2组成的特异引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。[0070]PCR扩增的反应程序:95°C5分钟；95°C30秒、60°C1分钟、72°C1分钟，35个循环；72°C8分钟。[0071]2、完成步骤1后，对PCR扩增产物进行测序，根据测序结果进行如下判定:如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为0301〇_纯合型;如果PCR扩增产物只有一种，且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为0SCM3J^合型；如果PCR扩增产物为两种，一种如序列表中序列1所示，另一种如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为03013_03013」3杂合型。[0072]由于水稻品种均为栽培种或农家种，因此基因型为纯合型的个体比例高。[0073]实施例3、水稻中基于所述等位基因片段的基因型与水稻单株产量的关联分析[0074]—、按照实施例2建立的分型方法，检测各试用水稻品种的基因型（结果见表1、表2和表3,第4列）。[0075]表1[0078]二、统计不同水稻品种的单株产量[0079]于2017年在北京市香山地区分别种植多个水稻品种具体见表1，水稻品种名称见第2列，水稻品种的产地见第3列）。待水稻成熟后，水稻植株按单株收种，重复至少三次，称量，取平均值，得到该品种的单株产量结果见表1、第5列）。[0080]表1的结果显示：37个水稻品种中17个品种的基因型为0SCM3_a纯合型，这17个品种的平均单株产量为26.23±2.17克；37个水稻品种中20个品种的基因型为0SCM3_b纯合型，这20个品种的平均单株产量为31.75±2.18克;两种纯和型的平均显著性检验P=O.03;成对t-测试显著度P=O.019N=12。[0081]三、建立筛选具有不同单株产量性状的水稻的方法[0082]筛选具有不同单株产量性状的水稻的方法为：[0083]1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型；所述特异基因片段位于水稻基因组中，为0SCM3,存在0SCM3_aAP003239.3和0SCM3_bCP018157.1两种等位形式，所述05010_如序列表的序列1所示，所述0SCM3J^n序列表的序列2所示；[0084]2进行如下判定:在邻近生长条件下，基因型为0SCM3J^合型的水稻群体的平均单株产量高于基因型为0501〇_纯合型的水稻群体的平均单株产量。

权利要求：1.一种筛选高产水稻的方法，为方法甲或方法乙；所述方法甲包括如下步骤：1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型;所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsCM3，存在0sCM3_a*0sCM3_b两种等位形式，所述〇8〇10_如序列表的序列1所示，所述OsCM3_t^n序列表的序列2所不；2进行如下判定：在邻近生长条件下，基因型为OsCM3_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为0sCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量；所述方法乙包括如下步骤：⑴以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求4所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为0^^3_纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsCM3_b纯合型；2进行如下判定：在邻近生长条件下，基因型为OsCM3_b纯合型的水稻群体的平均产量高于基因型为0sCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量。2.—种高产水稻的筛选方法，为方法A或方法B;所述方法A包括如下步骤：1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型;所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsCM3，存在0sCM3_a*0sCM3_b两种等位形式，所述〇8〇10_如序列表的序列1所示，所述OsCM3_t^n序列表的序列2所不；2进行如下判定：同等生长条件下，基因型为OsCM3_Mi合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为0sCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量；所述方法B包括如下步骤：⑴以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求4所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为0^^3_纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsCM3_b纯合型；2进行如下判定：同等生长条件下，基因型为OsCM3_Mi合型的水稻群体的平均产量均高于基因型为0sCM3_a纯合型的水稻群体的平均产量。3.—种水稻选育方法，为方法丙或方法丁；所述方法丙包括如下步骤：1检测待测水稻基于特异基因片段的基因型;所述特异基因片段位于水稻基因组中，为OsCM3，存在0sCM3_a*0sCM3_b两种等位形式，所述〇8〇10_如序列表的序列1所示，所述OsCM3_t^n序列表的序列2所不；⑵基因型为0sCM3_b纯合型的水稻为选育的目的水稻；所述方法丁包括如下步骤：⑴以待测水稻的基因组DNA为模板，采用权利要求2所述特异引物对进行PCR扩增；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列1所示，则待测水稻的基因型为0^^3_纯合型；如果PCR扩增产物只有一种且如序列表中序列2所示，则待测水稻的基因型为OsCM3_b纯合型；⑵基因型为0sCM3_b纯合型的水稻为选育的目的水稻。4.0嫩片段，为〇8〇10_13;所述OsCM3_b为如下dl或d2:dl序列表的序列2所示的DNA分子；d2将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列2具有相同功能的DNA分子。5.特异引物对，由引物1和引物2组成；所述引物1为如下al或a2:al序列表的序列3所示的单链DNA分子；a2将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列3具有相同功能的单链DNA分子；所述引物2为如下bl或b2:bl序列表的序列4所示的单链DNA;b2将序列4经过一个或几个核苷酸的取代和或缺失和或添加且与序列4具有相同功能的单链DNA分子。6.—种试剂盒，包括权利要求5所述特异引物对；所述试剂盒的用途为如下el或e2或e3或e4:el筛选尚广水稻；e2筛选具有不同产量性状的水稻；e3鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；e4鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。7.权利要求6所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求6所述试剂盒中各条引物分别单独包装的步骤。8.权利要求4所述DNA片段或权利要求5所述特异引物对的应用，为如下（el或（e2或e3或e4:el筛选尚广水稻；e2筛选具有不同产量性状的水稻；e3鉴定或辅助鉴定水稻的产量性状；e4鉴定或辅助鉴定具有不同产量性状的水稻。9.权利要求1-3中任一所述方法，或，权利要求4所述DNA片段，或，权利要求5所述特异引物对，或，权利要求6所述试剂盒，在水稻育种中的应用。10.—种鉴定优势等位基因的方法，包括如下步骤:通过比较不同群体的生物性状差异，确定具有优势性状的等位基因；所述不同群体中，每个群体均由所述等位基因纯合的个体组成。

百度查询： 中国科学院植物研究所 与水稻高产相关的分支酸变位酶核苷酸序列及其应用

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