申请/专利权人：南京百斯杰生物工程有限公司

申请日：2017-10-11

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN107586789B

主分类号：C12N15/80(20060101)

分类号：C12N15/80(20060101);C12N15/57(20060101);C12N9/62(20060101);C12R1/685(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2018.02.09#实质审查的生效;2018.01.16#公开

摘要：本发明公开了高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用。一种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含酸性蛋白酶基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含酸性蛋白酶基因序列、启动子、终止子、筛选标记等元件的基因片段。按照本发明所述的方法构建的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株。本发明所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。本发明通过基因工程的手段，构建了酸性蛋白酶的表达盒，并将其导入黑曲霉表达宿主菌，实现了酸性蛋白酶的高效分泌表达，获得了高产酸性蛋白酶黑曲霉表达菌株。通过对发酵条件的优化，该菌株液体发酵表达水平可达25000‑26000Uml。

主权项：1.一种产酸性蛋白酶的黑曲霉重组表达菌株的构建方法，其特征在于以黑曲霉为宿主细胞，将含有酸性蛋白酶基因的表达盒导入到宿主细胞得到；所述的酸性蛋白酶基因如SEQIDNO.1所示的白曲霉酸性蛋白酶基因，所述的宿主为敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因的黑曲霉。

全文数据：高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株及其构建方法和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程育种领域，涉及一种高产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株的构建及重组表达菌株液体发酵技术。背景技术[0002]酸性蛋白酶是一类最适pH值为2.5-5.0的天冬氨酸蛋白酶，相对分子质量为30000-40000，等电点为3.0-5.0。其主要的来源为动物的脏器（胃蛋白酶等）和微生物分泌物。由于酸性蛋白酶具有较好的耐酸性，因此被广泛地应用于食品、医药、轻工、皮革工艺以及饲料加工工业中。[0003]自1954年吉田首次发现黑曲霉可产生酸性蛋白酶以来，国内外对微生物发酵生产酸性蛋白酶进行了广泛的研究。目前酸性蛋白酶大都来源于微生物。产酸性蛋白酶菌株主要有黑曲霉Aspergillusniger、米曲霉A.oryzae、斋藤曲霉A.saitoi、泡盛酒曲霉A.awamori、宇佐美曲霉（A.usamii、微小毛霉（Mucorpusillus、青霉（Penicilliumspp·、根霉（Rhizopusspp等以及它们的变异株、突变株。此外，中华根霉（Rhizopuschinensis、陆生酵母中如酿酒酵母（Saccharomycescescerevisiae、白色假丝酵母Candidaalbicans等也分泌酸性蛋白酶。商品化的酸性蛋白酶生产菌主要是黑曲霉、宇佐美曲霉和米曲霉等为数不多的菌株。[0004]我国从上世纪60年代开始微生物产酸性蛋白酶的研制，1970年上海工业微生物研究所首先从黑曲霉筛选一株3.350产酸性蛋白酶菌株，填补了我国酸性蛋白酶制剂的空白。但3.350酸性蛋白酶菌种发酵活力较低，生产工艺较繁杂。1977年中国科学院微生物研究所和新疆生物土壤沙漠研究所共同研制的由宇佐美曲霉经诱变、筛选的537高产酸性蛋白酶菌种。目前，国内生产酸性蛋白酶的厂家，基本上都是用537及其突变菌株进行发酵生产。中国专利CN102676395A公开了一株宇佐美曲霉突变菌株及其在制备酸性蛋白酶中的应用，所述宇佐美曲霉突变菌株Aspergillussp.M1223采用液体深层发酵，该酶最适作用温度为40°C，最适作用pH为3.0，最适作用条件下，酶活性达到5600Uml。中国专利CN105316239A公开了经复合诱变筛选得到的一株产高活力酸性蛋白酶的宇佐美曲霉A.usamii801-2菌株，保藏号为CCTCCΝ0:Μ2013601该菌株发酵液酸性蛋白酶酶活可达13000-14000UmL。中国专利CN105199969A公布了一株高产酸性蛋白酶的黑曲霉突变株及其液体发酵方法，所述黑曲霉突变菌株为黑曲霉AspergillusnigerTP-235,保藏编号CGMCC10789,该菌株通过液体深层发酵在50L发酵罐上经补料发酵培养100-120h，产酶水平为21852Uml。[0005]综上所述，目前酸性蛋白酶产酶菌株主要是通过自然诱变结合大规模筛选得到的，其改造针对性差，工作量大，效率低已成为制约酸性蛋白酶进一步提高表达水平，降低生产成本的重要瓶颈。因此，通过基因工程手段高效的对酸性蛋白酶菌株进行改造，构建更高水平的表达菌株对进一步推进酸性蛋白酶的广泛应用，提高市场竞争力具有重要意义。发明内容[0006]本发明提供了一种构建酸性蛋白酶重组黑曲霉表达菌株的方法。[0007]本发明还提供了一种酸性蛋白酶重组表达载体。[0008]本发明还提供了该重组表达菌株的液体发酵工艺。[0009]本发明的目的可以通过以下技术方案实现：[0010]—种构建重组黑曲霉表达菌的方法，构建包含酸性蛋白酶基因序列的重组表达盒，该重组表达盒为包含酸性蛋白酶基因序列、启动子、终止子、筛选标记等元件的基因片段。[0011]所述的酸性蛋白酶基因为曲霉、或青霉属来源酸性蛋白酶基因；优选为白曲霉来源酸性蛋白酶基因；更进一步优选为具有如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列;所述的宿主细胞为黑曲霉。[0012]启动子可以是黑曲霉内源启动子:如黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α_葡萄糖苷酶启动子等;也可以是外源启动子:如米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子;本发明优选黑曲霉糖化酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶启动子。[0013]与启动子3’末端连接的可以是调控序列：如合适的前导序列（5’UTR，即对于宿主细胞的翻译重要的mRNA非翻译区，如米曲霉中性淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。[0014]为了分泌表达特定蛋白，需要信号肽序列介导，在黑曲霉中常用的信号肽序列有糖化酶信号肽，酸性淀粉酶信号肽，黑曲霉植酸酶信号肽，米曲霉TAKA淀粉酶信号肽，在本发明中利用的是酸性蛋白酶基因序列本身编码的信号肽。[0015]优选的终止子从如下酶的基因获得:黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白酶样蛋白酶。[0016]特定的基因在与启动子，调控序列，信号肽序列及终止子相连接后形成表达盒。通过常规方法导入到黑曲霉基因组中，可以随机插入到基因组中，也可以定点整合到某个或多个基因座上。可选的基因座有gla糖化酶），amya中性淀粉酶），amyb中性淀粉酶），aa酸性淀粉酶），agdaa葡萄糖苷酶），agdba葡萄糖苷酶）。[0017]所述表达盒优选地可以与一个或多个选择性标记连接，其允许简单选择经转化、转染、转导等的细胞或菌株。选择性标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养性prototrophytoauxotrophs等。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS乙酰胺酶）、argB鸟氨酸氨甲酰基转移酶）、bar草铵膦）乙酰转移酶）、hyg潮霉素磷酸转移酶）、niaD硝酸还原酶）（nitratereductase、pyrG乳清酸核苷_5’-磷酸脱羧酶）（orotidine-5’-phosphatedecarboxylase、sC硫酸腺苷酰转移酶和trpC邻氨基苯甲酸合酶anthranilatesynthase以及它们的等同物。优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉Aspergillusnidulans或米曲霉的amdS或hyg。[0018]所述表达盒优选地可以与一个或多个反向选择标记（负选择标记连接。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记包括但不限于amdS乙酰胺酶）、pyrG乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶），hsvTK单纯疱瘆病毒胸苷激酶）。[0019]所述的表达盒优选核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。[0020]所述的表达盒通过常规方法导入随机插入到宿主黑曲霉基因组中，或定点整合到宿主黑曲霉的某个或多个基因座上。[0021]所述的基因座选自糖化酶gla，中性淀粉酶amya，中性淀粉酶amyb，酸性淀粉酶aa，α葡萄糖苷酶agda，α葡萄糖苷酶agdb。[0022]所述的宿主为敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因的黑曲霉。[0023]按照本发明所述的方法构建的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株。[0024]—种重组表达载体，包含所述的含有酸性蛋白酶基因的表达盒。[0025]本发明所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。[0026]—种生产酸性蛋白酶的方法，将所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株种子液按照接种量10%的比例接入发酵罐培养基，初始pH5.5、35°C、风量1:1.2vvm、转速300-600rpm，当pH低于5.5时，开始通氨，并不断添加补料培养基来控制pH在5.5，当酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为120-140h;所述发酵罐培养基质量体积比组成为:淀粉8%，豆饼粉4%，硫酸铵1%，KH2P040.3%，玉米浆1.2%，CaCl20.5%，调节pH至5.5，121°C灭菌30min;所述补料瓶培养基质量体积比为:玉米淀粉20%，硫酸铵1%，KH2P040·1%，玉米楽1%，CaC120·5%，调节pH至5·5，121°C灭菌30min。[0027]本发明的有益效果[0028]本发明通过基因工程的手段，构建了酸性蛋白酶的表达盒，并将其导入黑曲霉表达宿主菌，实现了酸性蛋白酶的高效分泌表达，获得了高产酸性蛋白酶黑曲霉表达菌株。通过对发酵条件的优化，该菌株液体发酵表达水平可达25000-26000Uml。附图说明[0029]图IpHphtk质粒图谱[0030]图2pepB_pHphtk质粒图谱[0031]具体实施方法[0032]实施例IpHphtk质粒的构建[0033]该质粒包含以下3部分，由南京金斯瑞生物科技有限公司构建完成，质粒图谱见图1〇[0034]IpUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段；[0035]2hyg基因表达盒，序列见SEQIDNO.2;[0036]3Hsv-tk表达盒，序列见SEQIDN0.3。[0037]将pUC57质粒XbaI-PciI双酶切后得到的2305bp片段，hyg基因表达盒，序列见SEQIDNO.2以及Hsv-tk表达盒，序列见SEQIDNO.3,三个基因片段序列片段通过GibsonAss.eraWy®MasterMixKitE2611，NewEnglandBiolabs进行重组，得到重组质粒pHphtk〇[0038]实施例2pepB-pHphtk质粒的构建[0039]将白曲霉酸性蛋白酶表达盒整合到黑曲霉糖化酶基因座以进行表达，使用糖化酶启动子和糖化酶终止子。构建酸性蛋白酶整合表达质粒pepB-pHphtk。白曲霉来源的酸性蛋白酶序列pepBSEQIDNO.1由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。整合质粒构建方法如下:将pHphtk质粒通过vector-F与vector-R引物进行线性化；以黑曲霉购自于中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号为CICC2462基因组为模板，通过Gla-5’-F和Gla-5’-RΑία-β’-F和Gla-3’-R分别扩增糖化酶基因侧翼5’和3’序列，每个片段长2000bp。利用PepB-F和PepB-R扩增白曲霉酸性蛋白酶序列PepBSEQIDNO.1。将上述线性化的pHphtk载体、糖化酶基因侧翼5’片段（SEQIDNO.4、3’（SEQIDNO.5片段和PepB片段通过GibsonAssembJ：y®MasterMixKitE2611，NewEnglandBiolabs进行重组，得到整合质粒pepB-pHphtk，该整合质粒包含酸性蛋白酶PepB表达盒，该表达盒包含了黑曲霉糖化酶启动子序列，白曲霉来源的酸性蛋白酶序列pepB以及黑曲霉糖化酶终止子序列（SEQIDNO.6，经测序确认序列，质粒图谱见图2。[0041]实施例3酸性蛋白酶表达盒的转化整合[0042]本实施例出发菌株为AND4L，是由CICC2462菌株经敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因后获得的。黑曲霉中上述基因敲除敲入方法可参考专利CN103937766A或CN104962594A实施例中公开的技术方法实现。本实施例中pepB整合到糖化酶基因座中与CN104962594A实施例使用相同方法实现，即参照DelmasApplEnvironMicrobiol.2014，8011:3484-7等人描述的方法。具体地，利用环状DNA载体，包含有agdB5’及3’侧翼序列，选择标记，反向选择标记（或称为负向选择标记），以及大肠杆菌复制序列。将环状载体转入到黑曲霉中，通过正向选择获得重组菌株，再经过反向选择标记获得基因敲除敲入菌株。[0043]采用原生质体转化法将pepB-pHphtk质粒导入黑曲霉菌株AND4L，具体操作步骤如下:原生质体的制备:在营养丰富的TZ液体培养基牛肉膏粉0.8%;酵母浸膏0.2%;蛋白胨0.5%;NaCl0.2%;鹿糖3%;ρΗ5·8中培养黑曲霉菌丝体。通过mira-clothCalbiochem公司）从培养液中过滤菌丝体并用〇.7MNaClpH5.8洗涤，菌丝体滤干后转移至含纤维素酶1%Sigma、蜗牛酶1%Sigma和溶壁酶Sigma0.2%的酶解液ρΗ5·8中，30°C，65rpm酶解3h。然后将含有原生质体的酶解液置于冰上并用四层擦镜纸过滤，得到的滤液经300^?111，4°：温和离心101^11后，弃上清；附着在管壁上的原生质体用51'：溶液（110-Sorbitol、50mMCaCl2UOmMTris，pH7.5洗涤一次，最后把原生质体重悬于适量的STC溶液中。[0044]将环状pepB-pHphtk质粒10μ1浓度为：lOOngμΙ加入到100μ1原生质体悬浮液中混匀后室温放置25min;然后分3次共加入900μ1PEG溶液，混匀后室温放置25min;3000rpm，常温离心10min，弃上清，原生质体附着于管壁上，将其重悬于ImlSTC溶液中。把该悬浮液与预先降温至45°C左右的TB3培养基酵母浸膏0.3%、酸水解酪蛋白0.3%、蔗糖20%、琼脂0.7%混合并铺平板;待平板凝固后放入34°C培养箱中培养；24h后在平板上再铺一层含300ngAU潮霉素Hygromycin的TB3固体培养基琼脂1%，其余成分同上），继续将平板置于34°C培养箱中培养4-5天后，长出上层培养基的转化子称为整合转化子。随机挑取几个整合转化子分别传代于含300ngAU潮霉素的TB3固体培养基上，34°C恒温培养3天后，收集菌丝体用液氮冷冻后研磨粉碎，然后用真菌基因组提取试剂盒杭州博日科技有限公司）提取整合转化子基因组DNA，最后对整合转化子基因组DNA进行PCR鉴定，鉴定引物为P印-Stest-F与Pep-5test-R、Pep-3test_F与Pep_3test_R，PCR产物经测序后确认整合到糖化酶基因座。将确认的阳性转化子挑取适量碎菌丝放于含Iml无菌水的离心管中，涡旋振荡使之形成菌丝悬液，取ΙΟΟμΙ涂布于含1〇μΜ5_F2dU5-氟-2-脱氧尿嘧啶核苷，厂家:Sigma的TB3固体平板上，34°C恒温培养4-5天，即有敲除转化子长出。转化子在ΙΟμΜ5-F2dU平板上传两代防止转化子不纯）后，在300ngAU潮霉素平板上应不能生长;然后对敲除转化子基因组DNA进行PCR鉴定，引物序列及基因组提取方法同上。使用Pep-5test_F和Pep-3test_R进行PCR鉴定，阳性转化子产物应为5.5kb，而阴性转化子为6.3kb。阳性转化子经PCR产物测序后确认后得到重组表达菌株。[0046]^实施例4重组表达菌组液体发酵生产酸性蛋白酶[0047]斜面培养:将所述黑曲霉重组表达菌株取一接种环菌苔接种于TOA固体斜面，35°C下十旦温培养60h;[0048]摇瓶培养：将斜面培养得到的菌株取一接种环菌苔接入种子培养基中，在初始pH5.5、35°C、摇床转速200rpm条件下培养60h。[0049]种子罐培养:将摇瓶发酵后的种子液按照接种量10%的比例接入种子罐培养基，在初始PH5.5、35°C、转速300-600rpm条件下培养48h。[0050]发酵罐培养:将种子罐中的种子液按照接种量10%的比例接入发酵罐培养基，培养条件为初始pH5.5、35°C、风量1:1.2vvm、转速500rpm，当pH低于5.5时，开始通氨，并不断添加补料培养基来控制PH在5.5，当酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为120-140h。下表是50L发酵罐6批次的发酵产酶情况，平均产酶水平为25523UmL。[0052]所述斜面培养基如下：蔗糖20g，NaN032g，MgSk〇.5g，KCl0.5g，FeS〇4O.Olg，K2HPO4Ig，琼脂20g，将上述各组分溶于IOOOmL水中，调节pH至5.5，121°C灭菌20min，备用；[0053]所述摇瓶种子培养基如下：麦芽汁200mL，豆饼粉5g，调节pH至5.5，121°C灭菌20min，备用;所述种子罐培养基质量体积比组成为:淀粉5%，KH2P〇40.15%，CaCl20.1%，调节pH至5.5，121°C灭菌30min;[0054]所述发酵罐培养基质量体积比组成为：淀粉8%，豆饼粉4%，硫酸铵1%，ΚΗ2Ρ〇40·3%，玉米楽1·2%，CaCl20·5%，调节pH至5·5，121°C灭菌30min;[0055]所述补料瓶培养基质量体积比为：玉米淀粉20%，硫酸铵1%，KH2P〇40.1%，玉米楽1%，CaCl20·5%，调节pH至5·5，121°C灭菌30min。

权利要求：1.一种产酸性蛋白酶的黑曲霉重组表达菌株的构建方法，其特征在于以黑曲霉为宿主细胞，将含有酸性蛋白酶基因的表达盒导入到宿主细胞得到;所述的酸性蛋白酶基因选自曲霉、或青霉属来源的酸性蛋白酶基因。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的酸性蛋白酶基因为白曲霉来源酸性蛋白酶基因；进一步优选如SEQIDNO.1所示的白曲霉酸性蛋白酶基因。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的表达盒为包含酸性蛋白酶基因序列、启动子、终止子、筛选标记元件的基因片段。4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的启动子选自黑曲霉内源启动子、外源启动子;所述的黑曲霉内源启动子优选黑曲霉糖化酶启动子，中性淀粉酶启动子，酸性淀粉酶启动子，α-葡萄糖苷酶启动子;所述的外源启动子:米曲霉中性淀粉酶启动子，米根酶糖化酶启动子;所述的启动子进一步优选黑曲霉糖化酶启动子或黑曲霉中性淀粉酶启动子。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的表达盒还包含与启动子3’末端连接的调控序列，优选前导序列5’UT，进一步优选米曲霉中性淀粉酶或构巢曲霉丙糖磷酸异构酶前导序列。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的表达盒还包含信号肽序列，所述的信号肽序列选自有糖化酶信号肽、酸性淀粉酶信号肽、黑曲霉植酸酶信号肽或米曲霉TAKA淀粉酶信号肽，优选酸性蛋白酶基因序列本身编码的信号肽。7.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的终止子从如下酶的基因中获得：黑曲霉糖化酶、米曲霉TAKA淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉α-葡糖苷酶或尖镰抱膜蛋白酶样蛋白酶。8.根据权利要3所述的构建方法，其特征在于所述的筛选标记元件选自选择性标记和或反向选择标记;所述的选择性标记选自乙酰胺酶amdS、鸟氨酸氨甲酰基转移酶argB、草铵膦bar、乙酰转移酶、潮霉素磷酸转移酶hyg、硝酸还原酶niaD、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶PyrG、硫酸腺苷酰转移酶sC、邻氨基苯甲酸合酶trpC或它们的等同物，优选用在曲霉属细胞中的是构巢曲霉或米曲霉的amdS、hyg;所述的反向选择标记选自丝状真菌宿主细胞的选择性标记或hsvTK，优选乙酰胺酶amdS、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶pyrG。9.根据权利要求1-8中任一项所述的构建方法，其特征在于所述的酸性蛋白酶基因的表达盒核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。10.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于所述的表达盒通过常规方法导入随机插入到宿主黑曲霉基因组中，或定点整合到宿主黑曲霉的某个或多个基因座上。11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于所述的基因座选自糖化酶gla，中性淀粉酶amya，中性淀粉酶amyb，酸性淀粉酶aa，α葡萄糖苷酶agda，α葡萄糖苷酶agdb。12.根据权利要1所述的构建方法，其特征在于所述的宿主为敲除糖化酶基因、真菌淀粉酶基因和酸性淀粉酶基因的黑曲霉。13.按照权利要求1-8、10-12中任一项所述的方法构建的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株。14.一种重组表达载体，其特征在于包含权利要求1-8中所述的含有酸性蛋白酶基因的表达盒。15.权利要求13所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株在生产酸性蛋白酶中的应用。16.—种生产酸性蛋白酶的方法，其特征在于将权利要求13所述的产酸性蛋白酶黑曲霉重组表达菌株种子液按照接种量10%的比例接入发酵罐培养基，初始pH5.5、35°C、风量1:1.2vvm、转速300-600rpm，当pH低于5.5时，开始通氨，并不断添加补料培养基来控制pH在5.5，当酶活增长缓慢，菌体自溶严重时结束发酵，发酵周期为120-140h;所述发酵罐培养基质量体积比组成为：淀粉8%，豆饼粉4%，硫酸铵1%，KH2PO40.3%，玉米浆1.2%，CaCl20.5%，调节pH至5.5，121°C灭菌30min;所述补料瓶培养基质量体积比为:玉米淀粉20%，硫酸铵1%，ΚΗ2Ρ〇40.1%，玉米浆l%，CaCl20.5%，调节pH至5.5，121°C灭菌30min。

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