申请/专利权人：贵州省亚热带作物研究所

申请日：2018-11-26

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN109496849B

主分类号：A01H4/00(20060101)

分类号：A01H4/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2020.01.17#实质审查的生效;2019.03.22#公开

摘要：本发明属于澳洲坚果栽培技术领域，尤其是一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，通过外植体的采集、外植体预处理、消毒、接种、培养共五个步骤，通过本发明方案处理，使得外植体污染率为5％以下，愈伤组织诱导率达到96％以上，能够在短期内获得愈伤组织和再生芽，愈伤组织可以作为无菌芽的诱导材料，不需要进行消毒处理，再生芽生长较快，不容易出现细胞组织坏死情况。

主权项：1.一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：1外植体的采集：在澳洲坚果成年树生长萌芽期，用消毒过的剪刀截取枝条上健康且无病虫害带芽的茎段为外植体，茎段长5～10cm，直径0.1～0.2cm；2外植体预处理：将上述选好的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒过的剪刀剪成3～4cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗30～60min；3消毒：将上述预处理后的茎段置于灭菌过的超净工作台上，采用消毒剂A处理20～40s，然后用消毒剂B处理8～12min，最后用无菌水冲洗3～5次，每次冲洗4～6min；所述消毒剂A为吐温20按照2滴500mL的量加入到酒精中混合而成；所述消毒剂B为吐温20按照2滴500mL的量加入到浓度为0.05～0.15％的升汞中混合而成；4接种：用灭菌手术剪将上述消毒过的长茎段两端各剪掉0.4～0.6cm，然后将剩余的长茎段切成长度为0.8～1.2cm的带腋芽茎段，接种到培养基；5培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中进行恒温暗培养，培养温度为25～28℃，湿度65～75％；所述培养基为MS+0.5～2.0mgL6-BA，+0.1～1.0mgLNAA，+25～35gL蔗糖、+5～10gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0。

全文数据：一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法技术领域本发明属于澳洲坚果栽培技术领域，尤其是一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法。背景技术澳洲坚果MacadamiaternifoliaF.Muell.属山龙眼科ProteaceaeJuss.澳洲坚果属MacadamiaF.Muell.多年生常绿乔木果树，又名夏威夷果，昆士兰栗、澳洲胡桃等，原产于澳洲，营养物质丰富，且具较高的经济价值和药用价值，在众多坚果中享有“干果之王”的美誉；我国最早于1910年将其引入台北植物园进行种植，到1979年才开始真正进行引种试种和栽培技术等研究；近年来，我国陆续从澳大利亚引入品种在云南和广西等地推广种植；随着人们生活质量的提高，在我国热区特别是喀斯特高温干旱地区发展澳洲坚果这种特色果树具有巨大的经济、社会和生态效益。澳洲坚果一般采用无性芽接苗种植，用实生苗做砧木，培育时间较长，且目前种植上也缺乏优良的砧木进行经济高效的快繁；在苗圃，果园上主要采用嫁接、扦插等方式繁殖，而扦插、嫁接等方式繁殖出的苗根系不发达，植株生长慢，生根时间较长，同时再加上扦插繁殖需要进行修剪，整形等辅助管理，因此极大限制了我国澳洲坚果的种植和产业的发展；此外，以澳洲坚果茎段为外植体诱导愈伤组织或无菌芽时，通常采集的外植体其内生菌复杂多样，消毒困难，污染率高，组织很容易坏死，难以进行规模化的生产；近年来，贵州省农业科学院亚热带作物研究所引进一些澳洲坚果品种788、H2、OC等，具有较大的发展前景和经济效益；但是目前这些品种尚缺乏一种经济，高效的快繁体系：离体茎段具有培养周期短、繁殖快、并可脱毒、无污染，有效降低植物疫病传播风险，维持母株优良性状等优点，是实现澳洲坚果快速繁殖最可靠有效的方法；离体快繁在山龙眼科其他植物如高氏白澳山龙眼、多花银叶树、红花银桦等上已有相关的报道；目前，已有部分关于澳洲坚果的离体组织快繁的报道，如申请号为201710038704.1公开的澳洲坚果组培扩繁方法，该发明选取澳洲坚果当年生嫩茎经消毒处理后接种在启动培养基：12MS+6-BA+0.5～2.0mgL+IBA0.5～1.0mgL+蔗糖30gL+琼脂4.6gL；增殖培养基：12MS+GA0.5～1.0mgL+蔗糖30gL+琼脂4.6gL；生根培养基：14MS+IBA1～5mgL+蔗糖5～10gL+琼脂2gL+0.5％PEG上进行生根培养；再如申请号为CN201710288673.5公开的澳洲坚果组织培养快速育苗的方法，该发明将剪取的澳洲坚果枝条采用升汞浸泡后采用无菌水清洗，然后接种培养基：第一固体培养基为12MS、7gL的琼脂、15gL的蔗糖、2gL的碳粉、15gL的糖蜜发酵液、15mgL的蛋白胨，pH为5.8；第二固体培养基为12MS、2mgL的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mgL的赤霉素、15gL的琼脂、15gL的蔗糖、15gL的糖蜜发酵液、2gL的肌醇、1mgL的烟酸、80gL的多效唑，pH为5.8；第三固体培养基为12MS、2mgL的6-苄氨基腺嘌呤、1.0mgL的赤霉素、2mgL的吲哚丁酸、15gL的琼脂、15gL的蔗糖、15gL的糖蜜发酵液、1mgL的盐酸硫胺素、2mgL的盐酸吡哆醇、2gL的肌醇、1mgL的钼酸钠、5mgL的硼酸、80mgL的乙二胺四乙酸二钠，pH为5.8；此外，文献《澳洲坚果组织培养研究初报》郭凌飞中公开采用澳洲坚果有芽茎段作为外植体，用肥皂水洗净，再用流水清洗，再用75％的乙醇浸泡，再用升汞处理，用无菌水冲洗数；或者在取样地先用升汞浸泡快速浸泡，转入无菌水中，再用升汞处理，最后用无菌水冲洗数次；初代培养基为12MS培养基，每升培养基中加入琼脂7g，蔗糖30g，调整pH值至5.8，121℃、107.87kPa灭菌处理；继代培养基为12MS培养基，附加不同质量浓度的BA、GA；上述这些方法均存在消毒不彻底、污染率高、获得的愈伤组织较少、分化力弱等缺陷。发明内容为了解决现有技术中存在的上述技术问题，本发明首次采用吐温20与酒精、升汞混合使用对澳洲坚果外植体进行消毒，实现了消毒彻底、污染率低的目的，并配上适宜的培养基，进而提升外植体的生长发育，提高萌芽率。一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，具体包括以下步骤：1外植体的采集：在澳洲坚果成年树生长萌芽期，用消毒过的剪刀截取枝条上健康且无病虫害带芽的茎段为外植体，茎段长5～10cm，直径0.1～0.2cm；2外植体预处理：将上述选好的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒过的剪刀剪成3～4cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗30～60min；3消毒：将上述预处理后的茎段置于灭菌过的超净工作台上，采用消毒剂A处理20～40s，然后用消毒剂B处理8～12min，最后用无菌水冲洗3～5次，每次冲洗4～6min；4接种：用灭菌手术剪将上述消毒过的长茎段两端各剪掉0.4～0.6cm，然后将剩余的长茎段切成长度为0.8～1.2cm左右的带腋芽茎段，接种到培养基；5培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中进行恒温暗培养，培养温度为24～28℃，湿度65～75％。所述消毒剂A为吐温20按照2滴500mL的量加入到酒精中混合而成。优选地，酒精为浓度为70～80％。所述消毒剂B为升汞按照2滴500mL的量加入到浓度为0.05～0.15％的升汞中混合而成。所述培养基以MS为基本培养基，每升添加0.5～2.0mg6-BA，0.1～1.0mgLNAA，25～35gL蔗糖、5～10gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0；优选地，每升添加1.0mg6-BA，0.5mgLNAA，30gL蔗糖、8gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0。优选地，培养温度为26.5℃，湿度70％。有益效果①利用澳洲坚果成年树生长萌芽期茎段作为外植体进行组织培养，澳洲坚果在生长萌芽期时茎段具备一定程度的幼年态特性，生长旺盛且带菌较少，再生芽诱导率较高，组织不容易坏死。②采用幼嫩的茎段作为外植体，保证在不影响诱导效果和破坏外植体组织结构的情况下，对消毒剂处理的时间和浓度进行严格的筛选控制，由此将污染率控制在5％以下。③在恒温暗培养条件下进行培养后，10d诱导出愈伤组织，且愈伤组织活力较高，再生芽生长较快。④采用本发明方法，愈伤组织诱导率达到96％以上；与现有技术相比，本发明具有如下优点：1首次使用表面活性剂吐温20与酒精、升汞混合使用对外植体进行消毒，消毒彻底，污染率较小；2容易获得无菌外植体；3能够在短期内获得愈伤组织和再生芽，愈伤组织可以作为无菌芽的诱导材料，不需要进行消毒处理，再生芽生长较快，不容易出现细胞组织坏死情况。具体实施方式下面结核具体的实施方式来对本发明的技术方案做进一步的限定，但要求保护的范围不仅局限于所作的描述。实施例1一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：1外植体的采集：在澳洲坚果成年树生长萌芽期，用消毒过的剪刀截取枝条上健康且无病虫害带芽的茎段为外植体，茎段长5cm，直径0.1cm；2外植体预处理：将上述选好的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒过的剪刀剪成3cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗30min；3消毒：将上述预处理后的茎段置于灭菌过的超净工作台上，采用消毒剂A处理20s，然后用消毒剂B处理8min，最后用无菌水冲洗3次，每次冲洗4min；4接种：用灭菌手术剪将上述消毒过的长茎段两端各剪掉0.4cm，然后将剩余的长茎段切成长度为0.8cm左右的带腋芽茎段，接种到培养基；5培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中进行恒温暗培养，培养温度为25℃，湿度65％。所述消毒剂A为吐温20按照2滴500mL的量加入到酒精中混合而成。所述酒精为浓度为70％。所述消毒剂B为升汞按照2滴500mL的量加入到浓度为0.05％的升汞中混合而成。所述培养基以MS为基本培养基，每升添加0.5mg6-BA，0.1mgLNAA，25gL蔗糖、5gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0。实施例2一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：1外植体的采集：在澳洲坚果成年树生长萌芽期，用消毒过的剪刀截取枝条上健康且无病虫害带芽的茎段为外植体，茎段长10cm，直径0.2cm；2外植体预处理：将上述选好的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒过的剪刀剪成4cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗60min；3消毒：将上述预处理后的茎段置于灭菌过的超净工作台上，采用消毒剂A处理40s，然后用消毒剂B处理12min，最后用无菌水冲洗5次，每次冲洗6min；4接种：用灭菌手术剪将上述消毒过的长茎段两端各剪掉0.6cm，然后将剩余的长茎段切成长度为1.2cm左右的带腋芽茎段，接种到培养基；5培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中进行恒温暗培养，培养温度为28℃，湿度75％。所述消毒剂A为吐温20按照2滴500mL的量加入到酒精中混合而成。所述酒精为浓度为80％。所述消毒剂B为升汞按照2滴500mL的量加入到浓度为0.15％的升汞中混合而成。所述培养基以MS为基本培养基，每升添加2.0mg6-BA，1.0mgLNAA，35gL蔗糖、10gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0。实施例3一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，包括以下步骤：1外植体的采集：在澳洲坚果成年树生长萌芽期，用消毒过的剪刀截取枝条上健康且无病虫害带芽的茎段为外植体，茎段长8cm，直径0.1cm；2外植体预处理：将上述选好的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒过的剪刀剪成3cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗45min；3消毒：将上述预处理后的茎段置于灭菌过的超净工作台上，采用消毒剂A处理30s，然后用消毒剂B处理10min，最后用无菌水冲洗3次，每次冲洗5min；4接种：用灭菌手术剪将上述消毒过的长茎段两端各剪掉0.5cm，然后将剩余的长茎段切成长度为1cm左右的带腋芽茎段，接种到培养基；5培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中进行恒温暗培养，培养温度为26.5℃，湿度70％。所述消毒剂A为吐温20按照2滴500mL的量加入到酒精中混合而成。所述酒精为浓度为75％。所述消毒剂B为升汞按照2滴500mL的量加入到浓度为0.1％的升汞中混合而成。所述培养基以MS为基本培养基，每升添加1.0mg6-BA，0.5mgLNAA，30gL蔗糖、8gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0。试验例1本发明方案消毒方式与其它消毒方式对外植体的污染率、死亡率、愈伤组织诱导率影响，外植体取自于贵州省亚热带作物研究所澳洲坚果种质资源苗圃，分别采用如下消毒方式：A：吐温20+75％酒精30s—0.1％升汞8min—无菌水冲洗5次；B：吐温20+75％酒精30s—0.1％升汞10min—无菌水冲洗5次；C：吐温20+75％酒精30s—0.1％升汞12min—无菌水冲洗5次；D：吐温20+75％酒精30s—吐温20+0.1％升汞8min—无菌水冲洗5次；E：吐温20+75％酒精30s—吐温20+0.1％升汞10min—无菌水冲洗5次；F：吐温20+75％酒精30s—吐温20+0.1％升汞12min—无菌水冲洗5次；G：75％酒精30s—无菌水冲洗5次；H：0.1％升汞10min—无菌水冲洗5次；I：75％酒精30s—0.1％升汞10min—无菌水冲洗5次；上述不同消毒方法各接种60个，各重复3次，结果如下表1所示：表1组别污染率％死亡率％诱导率％A13.84.276.2B12.76.580.5C12.47.682.6D4.3096.1E2.4099.4F4.9095.2G35.73.674.6H28.518.475.4I20.112.481.3由表1中试验结果可知，采用本发明方案的消毒方法，具有外植体污染率低、死亡率低、愈伤组织诱导率高的特点。试验例2试验采用实施例3的技术方案，设定9组实验，每组的区别仅在于MS培养基中6-BA和NAA的添加量不同，其中6-BA浓度分别为0.5mgL、1.0mgL、2.0mgL，NAA浓度分别为0.1mgL、0.5mgL、1.0mgL，具体为9种搭配，即①6-BA0.5mgL，NAA0.1mgL；②6-BA0.5mgL，NAA0.5mgL；③6-BA0.5mgL，NAA1.0mgL；④6-BA1.0mgL，NAA0.1mgL；⑤6-BA1.0mgL，NAA0.5mgL；⑥6-BA1.0mgL，NAA1.0mgL；⑦6-BA2.0mgL，NAA0.1mgL；⑧6-BA2.0mgL，NAA0.5mgL；⑨6-BA2.0mgL，NAA1.0mgL；每组设定3个重复，经过12周的培养周期，对其萌芽率和每个外植体产生的芽苗数进行统计，结果如下表2所示：表2编号萌芽率％每个外植体产生的芽苗数173.96.2281.48.1368.55.9467.36.9598.59.3674.67.6771.47.4884.28.3962.76.2由表2中试验结果可知，MS培养基中6-BA加入量为1.0mgL，NAA加入量为0.5mgL时，对澳洲坚果的萌芽和增殖具有明显的促进作用，其萌芽率达到98.5％，每个外植体产生的芽苗数达到9.3。在此有必要指出的是，以上实施例和试验例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和理解，不能理解为对本发明的技术方案做进一步的限定，本领域技术人员作出的非突出实质性特征和显著进步的发明创造，仍然属于本发明的保护范畴。

权利要求：1.一种促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，其特征在于，包括以下步骤：1外植体的采集：在澳洲坚果成年树生长萌芽期，用消毒过的剪刀截取枝条上健康且无病虫害带芽的茎段为外植体，茎段长5～10cm，直径0.1～0.2cm；2外植体预处理：将上述选好的长茎段迅速带回室内，去掉叶片，用消毒过的剪刀剪成3～4cm长段，置于干净的容器中，于自来水下流水冲洗30～60min；3消毒：将上述预处理后的茎段置于灭菌过的超净工作台上，采用消毒剂A处理20～40s，然后用消毒剂B处理8～12min，最后用无菌水冲洗3～5次，每次冲洗4～6min；所述消毒剂A为吐温20按照2滴500mL的量加入到酒精中混合而成；所述消毒剂B为升汞按照2滴500mL的量加入到浓度为0.05～0.15％的升汞中混合而成；4接种：用灭菌手术剪将上述消毒过的长茎段两端各剪掉0.4～0.6cm，然后将剩余的长茎段切成长度为0.8～1.2cm左右的带腋芽茎段，接种到培养基；5培养：将上述接种后的培养基放置在无菌培养室中进行恒温暗培养，培养温度为25～28℃，湿度65～75％。2.如权利要求1所述促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述酒精为浓度为70～80％。3.如权利要求1所述促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述培养基以MS为基本培养基，每升添加0.5～2.0mg6-BA，0.1～1.0mgLNAA，25～35gL蔗糖、5～10gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0。4.如权利要求3所述促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述培养基以MS为基本培养基，每升添加1.0mg6-BA，0.5mgLNAA，30gL蔗糖、8gL琼脂，混合后的培养基pH调节至5.8～6.0。5.权利要求1所述促进澳洲坚果茎段诱导愈伤组织的方法，其特征在于，所述培养温度为26.5℃，湿度70％。

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