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【发明授权】一种金磁纳米颗粒的制备及其结合表面增强拉曼光谱法快速检测河豚毒素_浙江工业大学_201710307359.7 

申请/专利权人:浙江工业大学

申请日:2017-05-04

公开(公告)日:2020-07-28

公开(公告)号:CN107271423B

主分类号:G01N21/65(20060101)

分类号:G01N21/65(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.28#授权;2017.11.17#实质审查的生效;2017.10.20#公开

摘要:本发明提供了一种基于表面增强拉曼光谱的河豚毒素快速检测方法,采用纳米Fe3O4颗粒作为磁性基底,依次用四乙氧基硅烷TEOS、3‑氨丙基三乙氧基硅烷、3‑巯丙基三乙氧基硅烷修饰Fe3O4,通过‑NH2的静电吸附和Au‑S键的作用将金纳米颗粒吸附在经修饰后的磁纳米颗粒上,将组装好的金磁纳米颗粒整体用四乙氧基硅烷TEOS,3‑氨丙基三乙氧基硅烷修饰,以免疫活性金磁纳米颗粒作为拉曼基底,RhB‑ITCanti‑TTX为拉曼信号分子,利用表面增强拉曼光谱仪对河豚毒素TTX进行快速检测,在外磁体浓缩金磁纳米颗粒的情况下检测限可达到0.01μgml,检测线性范围0.01μgmL~0.5μgmL,检测的样品回收率82.64%~92.60%,相对标准偏差2.6%~11.1%。河豚毒素的检测在食品安全及医学方面具有重要的意义。

主权项:1.一种Fe3O4SiO2AuSiO2NH2金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法,包括如下步骤:a拉曼光谱基底制备将Fe3O4SiO2AuSiO2NH2金磁纳米颗粒与NHS-PEG-NHS在pH=7.4磷酸盐缓冲液中反应,再与河豚毒素抗体反应得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体;所述NHS-PEG-NHS的质量用量以Fe3O4SiO2AuSiO2NH2金磁纳米颗粒的体积计为1mgmL~1.5mgmL;所述河豚毒素抗体的用量以Fe3O4SiO2AuSiO2NH2金磁纳米颗粒的体积计为0.1mLmL~0.2mLmL;将罗丹明B拉曼染料与河豚毒素抗体在pH=8.3的NaHCO3缓冲液反应得到RhB修饰后的河豚毒素抗体;所述罗丹明B拉曼染料的用量以河豚毒素抗体的体积用量计为0.50mgmL~0.55mgmL;b建立水中河豚毒素检测的工作曲线金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体与RhB修饰后的河豚毒素抗体混合后磁分离去除上清液,并转移至凹面载玻片上,所述RhB修饰后的河豚毒素抗体与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体的体积用量比为1:5~10;通过激光拉曼光谱仪直接照射得到空白对照的拉曼光谱图;取与上述步骤等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体,与河豚毒素配制成具有梯度的0.01~0.5μgmL浓度范围的河豚毒素溶液,测量其拉曼光谱图,与罗丹明RhB的拉曼光谱图比较得河豚毒素存在时,RhB有1510cm-1的特征峰,以1510cm-1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图,获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线;c水中河豚毒素样品的检测将样品与步骤b中等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体配置成溶液,测量其拉曼光谱图,如出现1510cm-1处的RhB特征峰,读取其峰强,代入步骤b中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度,即可计算出样品中河豚毒素的浓度;如未出现1510cm-1处的RhB特征峰,说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在;所述的Fe3O4SiO2AuSiO2NH2金磁纳米颗粒按以下方法制备:先以Fe3O4纳米颗粒为起始物,加入TEOS在Fe3O4表面形成SiO2外壳,再加入APTES以及MPTES对SiO2外壳表面进行功能化,得到表面带-NH2和-SH的Fe3O4SiO2纳米颗粒;同时用柠檬酸钠还原HAuCl4溶液得到粒径均匀分布的Au纳米颗粒;将Au纳米颗粒加入所述表面带-NH2和-SH的Fe3O4SiO2纳米颗粒,通过-NH2的静电吸附和Au-S键的作用进一步将Au纳米颗粒致密地组装在Fe3O4SiO2表面,形成具有核壳结构的Fe3O4SiO2Au金磁纳米颗粒,再加入TEOS和APTES,最终得到所述的Fe3O4SiO2AuSiO2NH2金磁纳米颗粒。

全文数据:一种金磁纳米颗粒的制备及其结合表面增强拉曼光谱法快速检测河豚毒素技术领域[0001]本发明涉及一种金磁纳米颗粒的制备方法,及其在表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素中的应用。背景技术[0002]河豚毒素(tetr〇d〇t〇xin,TTX是飩鱼类俗称河豚鱼)及其他生物体内含有的一种生物碱。其分子式为CnHi7〇sN3,分子量为319。为氨基全氢喹唑啉型化合物,是自然界中所发现的毒性最大的神经毒素之一,曾一度被认为是自然界中毒性最强的非蛋白类毒素。0.5mg即可致人于死命。河豚毒素化学性质和热性质均很稳定,只有高温加热30min以上或在碱性条件下才能被分解。[0003]目前河豚毒素的检测方法主要有小白鼠生物法、液相色谱法、薄层色谱法、免疫学方法等。小白鼠生物法虽然能准确、稳定的测出河豚毒素,并且是日本法定的测定TTX含量的方法,但是费时费力,且重复性差,缺乏特异性。而液相色谱法较多的被用于定量检测河豚毒素,但是检测之前需要对样品进行复杂耗时的前处理,不适合现场快速检测。薄层色谱法则操作简单,但灵敏度过低,无法进行定量检测分析。免疫学方法中抗血清制备方法叫简单,但因为单克隆抗体的特异性较差,可能会存在交叉反应所以会对河豚毒素的定量检测有较大影响。[0004]表面增强拉曼散射(Surface-enhancedRamanSpectroscopy,SERS是一种具有表面选择性的增强效应,在表面科学、分析科学和生物科学等领域得到广泛的应用,从而发展成一种新型的快速分析方法。Fieischmann等人于1974年对光滑银电极表面进行粗糙化处理后,第一次得到吸附在银电极表面上单分子层吡啶分子的拉曼光谱。随后Van等人通过系统实验与计算,发现此信号相比于拉曼散射信号增强约6个数量级,指出这是一种与粗糙表面相关的表面增强效应,被称为SERS效应。表面信号增强106倍相当于表面单层分子放大成为100万层,因为SERS能有效地避免溶液相中相同物种的信号干扰,轻而易举地获取高质量的表面分子信号。发明内容[0005]本发明目的在于研究制备一种新的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒,该颗粒能在外磁场中快速分离,表面包覆具良好表面增强拉曼散射效应的金纳米颗粒。以该金磁纳米颗粒作为SERS检测的基底,将检测样品快速浓缩,提高检测灵敏度。并利用该金磁纳米颗粒与表面增强拉曼光谱技术快速检测河豚毒素。[0006]本发明采用以下技术方案:[0007]—种?63〇45:[02六113;[02冊2金磁纳米颗粒,其特征在于所述?63048;1_02八11Si02NH2金磁纳米颗粒按以下方法制备:先以Fe304纳米颗粒为起始物,加入TE0S在Fe304表面形成Si02外壳,再加入APTES以及MPTES对Si02外壳表面进行功能化,得到表面带-NH2和-SH的Fe304Si02纳米颗粒;同时用柠檬酸钠还原HAuC14溶液得到粒径均匀分布的Au纳米颗粒;将Au纳米颗粒加入表面带-丽2和-SH的Fe304Si02纳米颗粒,通过-顺2的静电吸附和Au-S键的作用进一步将Au纳米颗粒致密地组装在Fe304Si02表面,形成具有核壳结构的Fe304Si02Au金磁纳米颗粒,再加入TEOS和APTES,最终得到所述的Fe304Si02AuSi02NH2金磁纳米颗粒。[0008]进一步,本发明所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒,具体制备方法包括以下步骤:[0009]1表面带-NH2和-SH的Fe3〇4Si〇2纳米颗粒的制备:将Fe3〇4纳米颗粒用含乙醇、氨水的水溶液A分散,所述含乙醇、氨水的水溶液A中乙醇、氨水与水体积比例为45〜55:1:10,所述Fe3〇4纳米颗粒在所述含乙醇、氨水的水溶液A中质量浓度为0•02%-0.04%,在pH=9〜11的条件下超声5_10min,加入TE0S,在超声下反应6〜8h,反应结束后磁分离收集颗粒,先后用无水乙醇、水洗涤,用含乙醇、氨水的水溶液A分散,超声5-10min,再加入APTES与MPTES,在超声作用下反应16-18h,反应结束后磁分离收集颗粒,得到表面带-NH2和-SH的Fe3〇4纳米颗粒,再依次用无水乙醇、水洗涤,最后分散在水中待用;所述TE0S的体积用量以Fe3〇4纳米颗粒的质量计为1•5〜2.5mLg;所述TE0S与APTES、MPTES体积比为1.5〜2.5:1:1;[0010]⑵Au纳米颗粒的制备:将水加热至95〜101°C,加入质量分数为3%〜6%柠檬酸钠溶液,15〜25s后加入10mgmL〜12mgmL氯金酸水溶液,保持100°C至反应结束后停止加热,搅拌下自然冷却,冷却至室温后离心分离,收集下层颗粒,分散至水中待用;所述柠檬酸钠溶液与水、氯金酸水溶液的体积比为1:500:10〜12;[0011]⑶Fe3〇4Si02AUSi02NH2金磁纳米颗粒的制备:取步骤⑴所得颗粒溶液与步骤⑵颗粒溶液,步骤⑴所得颗粒溶液中表面带-NH2和-SH的Fe3〇4纳米颗粒与步骤⑵中Au纳米颗粒的质量比为1:5〜6,混合后反应6〜8h,然后磁分离后弃去上清液,用水洗涤,重复上述反应再分离洗涤过程,最后分散于水中,得到Fe3〇4纳米颗粒表面完全包覆Au纳米颗粒的金磁纳米颗粒,即Fe304Si〇2Au金磁纳米颗粒;再用水洗涤后磁分离收集,用含乙醇、氨水的水溶液B分散,所述含乙醇、氨水的水溶液B中水、氨水与乙醇的体积比例为10:1:60〜80,所述Fe3〇4Si〇2Au金磁纳米颗粒在含乙醇、氨水的水溶液B中质量浓度为〇.029%-0.035%,超声震荡5-10min,缓慢加入TE0S,在超声环境下反应6〜8h,反应结束后磁分离收集颗粒,即Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒,用水洗涤,再用所述含乙醇、氨水的水溶液B分散,所述Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒在含乙醇、氨水的水溶液B中质量浓度为〇•029%-〇•038%,超声振荡5-10min,再加入APTES,在超声振荡作用下反应16〜18h,反应结束后用水洗涤,得到所述Fe304Si02AuSi02NH2金磁纳米颗粒;所述TE0S的体积用量以Fe304Si02Au纳米颗粒的质量计为2•1〜2•4mLg;所述APTES与TE0S体积比为3:1•5〜2.5。进一步,本发明步骤3中所述步骤1所得颗粒与步骤2颗粒混合推荐采用搅拌方式实现。[0012]本发明还提供所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素的应用。[0013]进一步,所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法为:[0014]a拉曼光谱基底制备[0015]将Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒与NHS-PEG-NHS在pH=7•4磷酸盐缓冲液中反应,再与河豚毒素抗体反应得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体;所述NHS-PEG-NHS的体积用量以Fe:B〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒的质量计为imLmg〜1.5mLmg.所述河豚毒素抗体的体积用量以Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒的质量计为〇.lmLmg〜0.2mLmg;[0016]将罗丹明B拉曼染料与河豚毒素抗体在pH=8.3的NaHC〇3缓冲液反应得到RhB修饰后的河豚毒素抗体;所述罗丹明B拉曼染料的用量以河豚毒素抗体的体积用量计为〇.5〇^gmL〜0.55mgmL;[0017]⑹建立水中河豚毒素检测的工作曲线[0018]金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体与RhB修饰后的河豚毒素抗体混合后磁分离,所述RhB修饰后的河豚毒素抗体与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体的体积用量比为丄:5〜10;并转移至凹面载玻片上,通过激光拉曼光谱仪直接照射得到罗丹明RhB的拉曼光谱图;[0019]取与上述步骤等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体,与河豚毒素配制成具有梯度的〇.01〜0•5ygmL浓度范围的河豚毒素溶液,测量其拉曼光谱图,与罗丹明RhB的拉曼光谱图比较得河豚毒素存在时,RhB有1510cm-1的特征峰j以1510cnf1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图,获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线;[0020]C水中河豚毒素样品的检测[0021]将样品与步骤c中等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体配置成溶液,测量其拉曼光谱图,如出现lSlOcnf1处的RhB特征峰,读取其峰强,代入步骤⑹中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度,即可计算出样品中河豚毒素的浓度;如未出现lSlOcnf1处的RhB特征峰,说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在。[0022]具体地,本发明所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法为:[0023]a称取lmgNHS-PEG-NHS,溶于lmLpH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS中,与lmLFe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒混合,振荡反应6h,反应结束后磁分离收集颗粒,用PBS洗涤金磁纳米颗粒,再次磁分离;用2mLPBS将收集到的颗粒分散,加入〇.imLlmgmL河豚毒素抗体溶液,室温下振荡反应6h;反应结束后保存在4°C冰箱中备用,得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体;[0024]取5〇yg罗丹明B拉曼染料溶于〇.2mLpH=8•3的NaHC03缓冲液中;再加入〇.lmLlmgmL的河豚毒素抗体;混匀后室温下振荡反应6h;反应结束后用NaHC03缓冲液透析混合液,除去多余的罗丹明B拉曼染料,得到RhB修饰后的河豚毒素抗体;[0025]⑹取金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体50yLRhB修饰后的河豚毒素抗体1〇此,与河豚毒素配制成浓度为〇•5ugmL、0•1ugmL、0.05ugmL、0•02ngmL、0.01ugmL时的拉曼光谱图,以1510CHT1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图,获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线;TTX浓度在〇•5iigmL至0•01ugmL范围内,1510CHT1处拉曼峰强的对数与河脉毒素浓度的对数线性关系良好,线性方程为InIi5io=9.34725InCm+0.89229,其中lnIi5io为lSlOcnT1处拉曼峰强的对数,lnCnx为河豚毒素浓度的对数,R=0.9959;[0026]c将样品与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体50uLRhB修饰后的河豚毒素抗体10uL配置成溶液,测量其拉曼光谱图,如出现1510cm_1处的RhB特征峰,读取其峰强,代入步骤〇中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度,即可计算出样品中河豚毒素的浓度;如未出现1510CHT1处的RhB特征峰,说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在。[0027]文中,TE0S为四乙氧基硅烷,APTES为3-氨丙基三乙氧基硅烷,MPTES为3-巯丙基三乙氧基硅烷,NHS-PEG-NHS为活性酯聚乙二醇活性酯,RhB为罗丹明B。[0028]从Fe3〇4磁纳米颗粒到Fe3〇4Si02AuSi02NH2金磁纳米颗粒,其质量变化很微小,因此本发明计算时认为所有磁纳米颗粒质量不变。[0029]本发明的有益效果为:[0030]1_Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2磁纳米颗粒能在外磁场中快速分离,在其表面包覆具有良好表面增强拉曼散射效应的金纳米颗粒并使用这种金磁纳米颗粒作为SERS检测的基底,且改善制备方法,使得制备的金纳米颗粒可以更好地与无定形二氧化硅包覆层表面结合,不但使样品易于分离,省去传统离心沉淀或过柱分离的复杂过程,还能将样品快速浓缩,从而提尚检测灵敏度。[0031]2.金纳米颗粒能包覆在Fe3〇4Si〇2纳米颗粒的表面,并且结合地非常紧密。从不同分辨率下Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒的TEM图像与EDX分析可以证明,Fe3〇4Si02磁性纳米颗粒的粒径较大,在颗粒的边界可以看到一层明显的无定形Si02的包覆层,且在磁性粒子的表面吸附了大量Au纳米颗粒,吸附的Au纳米颗粒十分均匀,粒径在40nm左右,呈球形。金纳米颗粒紧密的包覆在Fe3〇4Si02m米颗粒的表面,克服了传统方法中金纳米颗粒包覆不上且包覆不紧密的缺点,在检测过程中可以大大提高检测灵敏度,如图1、图2所示。[0032]3.确定了氨基修饰的最佳方案,使得金纳米颗粒能够紧密地吸附在Si〇2包覆的Fe304纳米颗粒表面,即能防止金纳米颗粒的聚集,又能使金纳米颗粒均匀的吸附在Fe3〇4表面,表现出良好的磁分离效果,如图3所示。[0033]4.确定了Fe3〇4Si〇2AU金磁纳米颗粒的最佳组装方式,使得实验制备的金磁纳米颗粒整体包覆均匀,磁纳米颗粒表面吸附的金纳米颗粒分散的较好。在相同检测情况下,能够收集到较强的SERS信号,如图4所示。[0034]5.确定TE0S的最佳用量,使得无定形Si02层的厚度适中,既能提供较大的比表面积以及保护Fe3〇4纳米颗粒不被氧化和相互聚集,又不会使二氧化硅层包覆过厚,导致Fe3〇4Si02纳米颗粒磁性降低;并且既能达到较好的包覆率增加检测时的增强效果又能达到较为高的金纳米粒子利用率,如图5所示。[0035]6.Fe3〇4Si〇2纳米颗粒溶液以及Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒溶液在室温下十分稳定,长时间放置3个月)分散性依然良好,可以利用磁浓缩效应提高其SERS检测灵敏度,如图6、图7所示。[0036]7.在检测体系中存在河豚毒素时,Fe3〇4AuantinX基底与RhBantiTTX上的TTX抗体会与河豚毒素发生抗原抗体特异性结合,将Fe304AUaritinX基底与RhBantiTTX间的距离拉近,从而使基底上的Au纳米颗粒与RhB染料分子的距离拉近,产生较强的SERS增强效应,从而提高了检测的灵敏度和选择性,降低了检测背景的干扰,相比于其它检测手段如高效液相色谱、质谱、薄层色谱等),拉曼光谱技术更加简单便捷、易应用于现场快速检测,如图8、图9所示。[0037]8.以Fe304AuantiTTX金磁纳米颗粒为拉曼基底快速检测河豚毒素。将合成的金磁纳米颗粒溶液与河豚毒素的标准溶液配制一系列不同金磁纳米颗粒浓度与河豚毒素浓度的溶液,将这些溶液用移液枪转移到凹面载玻片上,并于凹面载玻片下用一圆形钕铁硼磁铁将金磁纳米颗粒聚集成点,在激光拉曼光谱仪的照射下,读取河豚毒素的相关特征峰及谱图,并绘制快速检测河豚毒素的工作曲线,单个样品的测试时间小于10分钟,如图10所」、〇附图说明[0038]图1:不同分辨率下实施例2的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2金磁纳米颗粒的TEM图像。[0039]图2:实施例2的Fe3〇4Si02AuSi〇2金磁纳米颗粒的EDX谱图。[0040]图3:实施例3不同基团修饰后得到的Fe304Si02Au纳米颗粒的图片a、c、e与TEM图像b、d、f。图3a、(e对应实施例2的步骤⑴所得⑴表面带-和-SH的Fe3〇4Si02纳米颗粒,图3c、(d对应实施例3A所得只修饰-陋2的Fe304Si〇2磁性纳米颗粒,图3e、f对应实施例3⑻只修饰-SH的Fe3〇4Si〇2磁性纳米颗粒。[0041]图4分别为实施例4A搅拌方式、⑻振荡方式、⑹超声方式得到的Fe3〇4Si02Au纳米颗粒TEM图像a、c、e与相应拉曼图谱b、d、f。[0042]图5:实施例5不同量3yL、4.5yL、6yL的TE0S条件下得到产物Fe3〇4Si〇2AuSi〇2金磁纳米颗粒的TEM图像a、c、e与相应拉曼图谱b、d、f。此图6:实施例2制备的Fe3〇4Si〇2纳米颗粒溶液以及Fe3〇4Si02AuSi02NH2金磁纳米颗粒溶液:未分离时图示。在室温下十分稳定,长时间放置3个月)后分散性依然良好。[0043]图7:用一钕铁硼外磁体(直径25mmX厚度20mm对实施例2制备的Fe3〇4Si02、Fe304Si02Au纳米颗粒溶液进行浓缩实验,在30s之内即可完成浓缩分离,说明包覆了Au纳米颗粒的Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒仍具有良好的磁学效应,可以利用磁浓缩效应提高其SERS检测灵敏度。[0044]图8:为应用实施例1中未添加河豚毒素时的空白对照组的拉曼光谱图。[0045]图9:为Fe3〇4AuantiTTX金磁纳米颗粒为拉曼基底测得TTX浓度为0.2ugmL、0.1UgmL、0•〇5ligmL、0.〇2ligmL、0•0lygmL、0•005ygmL的拉曼图。[0046]图10:应用实施例1中以Fe3〇4AuantiTTX金磁纳米颗粒为拉曼基底检测河豚毒素的标准曲线。具体实施方式[0047]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此。[0048]实施例1[0049]i表面带_顺2和-SH的Fe3〇4Si〇2纳米颗粒的制备[0050]取4.00mgFe3〇4纳米颗粒,用蒸馏水洗涤2次,洗完之后磁分离收集,用2mL蒸馏水分散,装入15mL玻璃瓶中,同时加入llmL无水乙醇与0.2mL氨水。在pH=ll的条件下超声lOmin,加入8yLTEOS,在超声下反应8h,反应结束后磁分离收集颗粒,先后用无水乙醇、蒸馈水洗漆两次,最后在含2mL蒸馈水与1lmL无水乙醇的混合液中分散,加入〇•2mL氨水,超声lOmin,再加入5.3iiLAPTES与5.3iiLMPTES,在超声作用下反应18h。反应结束后磁分离收集颗粒,得到表面带-NH2和-SH的FesO4纳米颗粒,先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次,最后分散在12mL蒸馏水中待用。[0051]ii金纳米颗粒的制备[0052]称取12.00mg氯金酸,溶于l.OOmL蒸馏水中,备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50mL蒸馏水,500rpm磁力搅拌下加热至101°C,然后一次性加入1〇〇此质量分数为6%柠檬酸钠溶液,25s后加入1•OmL溶有10•OOmg的氯金酸水溶液,保持1〇1°C至反应结束后停止加热,搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000rmin下离心l〇min,收集下层颗粒,分散在6mL蒸馏水中待用。[0053]iii表面带-顺2的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2金磁纳米颗粒的制备[0054]取4mL步骤(1修饰后的Fe3〇4纳米颗粒,磁分离后弃去上清液,加入4tnL金纳米颗粒,混合后反应8h。然后磁分离后弃去上清液,用蒸馈水洗涤2次,重复实施例(m上述过程5次,最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe3〇4纳米颗粒表面完全包覆Au纳米颗粒的Fe304Si02Au金磁纳米颗粒。[0055]取上述制备的金磁纳米颗粒4mL,用蒸馏水洗涤两次,洗完后磁分离收集,用〇.5mL水分散,移至l〇mL玻璃瓶中,同时加入3•5mL乙醇以及50uL氨水,超声震荡lOmin,缓慢加入3.2uLTE0S,在超声环境下反应8h,反应结束后磁分离收集颗粒,g卩Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒,用蒸馏水洗涤两次,再用0•5mL水和4.OmL无水乙醇分散,加入50uL氨水,超声振荡10min,再加入2.6此APTES,在超声振荡作用下反应18h。反应结束后用蒸馏水洗涤两次,最后用蒸馏水分散成4mL,得到表面带-NH2的Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒。[0056]实施例2[0057]1表面带-冊2和-SH的Fe3〇4Si02纳米颗粒的制备[0058]取4.00mgFe3〇4纳米颗粒,用蒸馏水洗涤2次,洗完之后磁分离收集,用2mL蒸馏水分散,装入15mL玻璃瓶中,同时加入9mL无水乙醇与0.2mL氨水。在pH=10的条件下超声5min,加入8uLTE0S,在超声下反应6h,反应结束后磁分离收集颗粒,先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次,最后在含2mL蒸馈水与9mL无水乙醇的混合液中分散,加入0.2mL氨水,超声5min,再加入3.2此APTES与3.2yLMPTES,在超声作用下反应16h。反应结束后磁分离收集颗粒,得到表面带-廳和-SH的Fe3〇4纳米颗粒,先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次,最后分散在12mL蒸馈水中待用。[0059]2金纳米颗粒的制备[0060]称取1〇.〇〇mg氯金酸,溶于1.OOmL蒸馏水中,备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50tnL蒸馏水,500rpm磁力搅拌下加热至100°C,然后一次性加入lOOuL质量分数为3%柠檬酸钠溶液,20s后加入1•〇〇mL溶有10•00mg的氯金酸水溶液,保持95°C至反应结束后停止加热,搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000rmin下离心10min,收集下层颗粒,分散在6mL蒸馏水中待用。[0061]3表面带-腿2的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2金磁纳米颗粒的制备[0062]取4mL步骤(1修饰后的Fe3〇4纳米颗粒,磁分离后弃去上清液,加入4mL金纳米颗粒,混合后反应6h。然后磁分离后弃去上清液,用蒸馈水洗涤2次,重复实施例⑶上述过程5次,最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe3〇4纳米颗粒表面完全包覆Au纳米颗粒的Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒。[0063]取上述制备的金磁纳米颗粒4mL,用蒸馏水洗涤两次,洗完后磁分离收集,用0•5mL水分散,移至l〇mL玻璃瓶中,同时加入3.5mL乙醇以及50yL氨水,超声震荡5min,缓慢加入2.8yLTE0S,在超声环境下反应6h,反应结束后磁分离收集颗粒,S卩Fe3〇4Si〇2AuSi〇2金磁纳米颗粒,用蒸馏水洗涤两次,再用〇.5rnL水和3mL无水乙醇分散,加入50uL氨水,超声振荡5min,再加入1.4uLAPTES,在超声振荡作用下反应16h。反应结束后用蒸馏水洗涤两次,最后用蒸馈水分散成4tnL,得到表面带-NH2的Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒。[0064]所得Fe3〇4Si〇2AuSi02金磁纳米颗粒TEM图和EDX图如图1、2所示,Fe3〇4Si〇2磁性纳米颗粒的粒径较大(图2a、b,在颗粒的边界可以看到一层无定形的Si02包覆层,且在磁性粒子的表面吸附了大量Au纳米颗粒,吸附的Au纳米颗粒粒径均匀,大约为40nm,呈球形,且Au纳米颗粒外层还分布着一层Si〇2图2c。从图中可以看出Au纳米颗粒紧密地接合在了Fe3〇4Si〇2纳米颗粒的表面。从图3能谱分析中可以看出,Au元素的信号峰和Fe元素信号峰都十分明显,而图中C元素峰来源于铜网的超薄碳支膜,Cu元素峰来源于电镜铜网,说明Fe3〇4纳米颗粒的表面覆盖有Au元素和Si元素。[0065]实施例3[0066]A只修饰-腿2的Fe3〇4Si02磁性纳米颗粒[0067]取4.00mgFe3〇4纳米颗粒,用蒸馏水洗涤2次,洗完后磁分离收集,用2mL蒸馏水分散,装入15mL玻璃瓶中,同时加入10mL无水乙醇与0.2mL氨水。在pH=10的条件下超声5min,加入8此TE0S,在超声下反应6h,反应结束后磁分离磁分离收集颗粒,先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次,最后用2mL与10mL无水乙醇分散,加入0.2mL氨水,超声5min,再加入8iiLAPTES,在超声作用下反应16h。反应结束后磁分离收集颗粒,得到表面带-NH2的Fe3〇4纳米颗粒,先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次,最后分散在12ml蒸馏水中待用。[0068]称取lO.OOmg氯金酸,溶于l.OOmL蒸馏水中,备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50mL蒸馏水,500rpm磁力搅拌下加热至l〇〇°C,然后一次性加入100uL质量分数为5%柠檬酸钠溶液,20s后加入1•00mL溶有10.〇〇mg的氯金酸水溶液,保持l〇TC至反应结束后停止加热,搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000rmin下离心10min,收集下层颗粒,分散在6mL蒸馏水中待用。[0069]取4mL修饰后的Fe304纳米颗粒溶液,磁分离后弃去上清液,加入4mL金纳米颗粒,混合后反应7h。然后磁分离后弃去上清液,用蒸馏水洗涤2次,磁分离后弃去上清液。重复上述添加金纳米颗粒修饰操作5次,最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe3〇4纳米颗粒表面包覆金纳米颗粒的Fe3〇4Si〇2Au金磁纳米颗粒。[0070]⑻只修饰-SH的Fe3〇4Si〇2磁性纳米颗粒[0071]取4.00mgFe3〇4纳米颗粒,用蒸馏水洗涤2次,洗完后磁分离收集,用2mL蒸馏水分散,装入l5mL玻璃瓶中,同时加入10mL无水乙醇与〇.2mL氨水。在pH=10的条件下超声5min,加入8uLTE0S,在超声下反应6h,反应结束后磁分离磁分离收集颗粒,先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次,最后用2mL水与lOmL无水乙醇分散,加入〇.2mL氨水,超声5min,再加入8HLMPTES,在超声作用下反应16h。反应结束后磁分离收集颗粒,得到表面带-NH2的Fe3〇4纳米颗粒,先后用无水乙醇、蒸馏水洗涤两次,最后分散在12ml蒸馏水中待用。[0072]称取1〇•〇〇mg氯金酸,溶于1•〇〇此蒸馏水中,备用。在装有温度探头的250mL圆底烧瓶中加入50mL蒸馏水,500rpm磁力搅拌下加热至i〇TC,然后一次性加入lOOyL质量分数为5%朽1檬酸钠溶液,2〇s后加入1.〇〇mL溶有l〇.〇〇mg的氯金酸水溶液,保持l〇〇°C至反应结束后停止加热,搅拌下自然冷却。冷却至室温后12000rmin下离心lOmin,收集下层颗粒,分散在6mL蒸馏水中待用。[0073]取4mL修饰后的Fe3〇4纳米颗粒溶液,磁分离后弃去上清液,加入4mL金纳米颗粒,混合后反应7h。然后磁分离后弃去上清液,用蒸馈水洗潘2次,磁分离后弃去上清液。重复上述添加金纳米颗粒修饰操作5次,最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe3〇4纳米颗粒表面包覆金纳米颗粒的Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒。[0074]图3即为不同基团修饰后得到的Fe304Si〇2Au纳米颗粒的图片(a、c、e与TEM图像b、d、f,图3a、(e对应实施例2的步骤⑴所得⑴表面带-NH2和-SH的Fe3〇4Si02纳米颗粒,图3c、(d对应实施例3A所得只修饰-NH2的Fe3〇4Si02磁性纳米颗粒,图3e、f对应实施例3⑻只修饰-SH的Fe3〇4Si02磁性纳米颗粒。由图可知,两种基团-NH2和-SH修饰的Fe3〇4,经磁分离后上清液已澄清,表明金纳米颗粒可被完全吸附(图3a,且磁纳米颗粒表面吸附的金也比较均匀(图3b。只修饰上-NH2的Fe3〇4经磁分离后上层溶液还是比较浑浊(图3c,TEM下看到磁颗粒表面也只吸附了非常少的金纳米颗粒(图3d。而只修饰上-SH的Fe3〇4经磁分离后上层溶液也较浑浊(图3e,而且磁纳米颗粒表面吸附的金纳米颗粒也不均匀,存在金纳米颗粒的聚集情况(图3f。因此选取同时修饰了-NH2和-SH的Fe3〇4来组装金磁纳米颗粒。[0075]实施例4[0076]A搅拌反应法组装Fe3〇4Si〇2Au金磁纳米颗粒[0077]取4mL实施例2步骤(1修饰后的Fe3〇4纳米颗粒,磁分离后弃去上清液,加入4mL金纳米颗粒,搅拌反应6h。然后磁分离后弃去上清液,用蒸馈水洗涤2次。[0078]重复上述过程5次,最后分散在4mL蒸馈水中。得到Fe3〇4Si〇2Au金磁纳米颗粒。[0079]⑻振荡反应法组装Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒[0080]取4mL实施例2步骤(1修饰后的Fe3〇4纳米颗粒,磁分离后弃去上清液,加入4mL金纳米颗粒,振荡反应6h。然后磁分离后弃去上清液,用蒸馏水洗涤2次。[0081]重复上述过程5次,最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒。[0082]⑹超声反应法组装Fe304Si02Au金磁纳米颗粒[0083]取4mL实施例2步骤(1修饰后的Fe3〇4纳米颗粒,磁分离后弃去上清液,加入4mL金纳米颗粒,超声反应6h。然后磁分离后弃去上清液,用蒸馈水洗涤2次。[0084]重复上述过程5次,最后分散在4mL蒸馏水中。得到Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒。[0085]由图4可知,搅拌方式得到的金磁纳米颗粒整体包覆比较均匀,磁纳米颗粒表面吸附的金纳米颗粒分散的较好图4a,对应的拉曼峰也较为理想,151〇cm_1处的峰可达到8000以上(图4b。修饰过程采用振荡修饰时,Fe3〇4纳米颗粒表面的金纳米颗粒的密集度则不如搅拌修饰图4c。同时所测得的拉曼峰值也比前者略低,1510cm_1处的峰只有6〇〇〇左右(图4d。而采用超声方式组装得到的金磁纳米颗粒TBTF看到Fe3〇4纳米颗粒表面只吸附了少量的金纳米颗粒,大部分表面无吸附(图4e,同时对应所测得的拉曼峰也降低了很多,1510CHT1处的峰也有3000左右(图4f。这是因为超声频率过大,会使己经吸附在Fe3〇4纳米颗粒表面的金纳米颗粒脱落,而振荡频率较低,金磁组装过程不会致金纳米颗粒脱落,但却不能Fe3〇4表面完全包覆金纳米颗粒。搅拌过程相比于振荡较剧烈,但又不同于超声,使Fe3〇4表面充分吸附金纳米颗粒的同时又不致二次脱落。因此选用搅拌方式组装最为理想。[0086]实施例5不同量TE0S对Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒SERS效果的影响[0087]取实施例2步骤⑶Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒4mL,用蒸馈水洗涤两次,洗完后磁分离收集,用〇.5mL水分散,移至lOmL玻璃瓶中,同时加入3.5mL乙醇以及50yL氨水,超声震荡5min,缓慢加入TE0S,在超声环境下反应6h,反应结束后磁分离收集颗粒,用蒸馏水洗涤两次,再用0•5mL水和3•5mL无水乙醇分散。重复以上操作,做三组平行实验,其中TE0S的用量分别为3此、4.5此、6uL。得到三组修饰了不同TEOS量且未修饰-NH2与-SH的金磁纳米颗粒。将上述金磁纳米颗粒与60uLlmgmL罗丹明B染料混合,超声30s。用罗丹明染料标记后测拉曼峰型号Advantage785,激光波长785nm,功率为120mW,积分时间10s。[0088]由图5可知,TEOS添加量为3uL的金磁纳米颗粒的金外层已经有较薄的一层Si02包覆(图5a,对应的拉曼图中lSlOcm-1与1648^1处的峰值均可达到7000以上(图5b。硅烷外层随着TE0S量的增加也随之增加了一定厚度(图5c,硅烷外层的变厚使得拉曼信号也有一定程度的降低,1648^^1处的峰值降低到了6000左右(图5d。而当TE0S的添加量再次增加,可以看到硅烷外层明显变厚(图5e,导致拉曼信号大幅下降(图5f。因此当包覆金磁纳米颗粒整体时,外层硅烷层越厚,会导致测得的拉曼信号变弱。[0089]应用实施例1[0090]a拉曼基底的制备[0091]iFe3〇4Si〇2AuSi〇2金磁纳米颗粒修饰后的抗体[0092]称取lmgNHS-PEG-NHS,溶于lmLpH=7_4的磷酸盐缓冲液(PBS中。量取lmL实施例1制备得到的表面带-NH2的Fe3〇4Si〇2AuSi02金磁纳米颗粒溶液,将lmLNHS-PEG-NHS溶液与lmL金磁纳米颗粒溶液混合至玻璃瓶中,振荡反应6h。通过-NH2将-NHS基团固定在金磁纳米颗粒的表面。反应结束后磁分离收集颗粒,用PBS洗涤金磁纳米颗粒,再次磁分离。用2mLPBS将收集到的颗粒分散到玻璃瓶中,加入〇•lmLlmgmL河豚毒素抗体溶液,室温下振荡反应6h。反应结束后保存在4°C冰箱中备用。[0093]iiRhB修饰后的抗体[0094]称取5〇ug罗丹明B拉曼染料至棕色玻璃瓶中,溶于〇.2mLpH=8.3的NaHC03缓冲液中。量取0•lmLlmgmL的河豚毒素抗体加入至棕色玻璃瓶中。混匀后室温下振荡反应6h。反应结束后用NaHC03缓冲液透析混合液,除去多余的罗丹明B拉曼染料。[0095]⑹建立水中河豚毒素检测的工作曲线[0096]取FesOVSiOVAuSiOVNH2金磁纳米颗粒修饰后的抗体50此,RhB修饰后的抗体10yL,混合振荡反应3〇min,磁分离后置于凹面载玻片上,使用拉曼光谱仪(型号Advantage785,激光波长785nm,功率为l2〇mW,积分时间Is测量其拉曼图谱作为空白对照组。1376cnf1处的尖峰为玻璃板的峰,由图8可知,MlOcnf1与1648cm—1处均无明显峰值。说明缺少河豚毒素,未能连接金磁-抗体复合物与RhB-抗体复合物,金纳米颗粒与RhB相距较远,因此不出峰。[0097]取Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒修饰后的抗体50uL,RhB修饰后的抗体10iiL,再加入一定浓度的河豚毒素,配制成河豚毒素浓度分别为0•lUgmL、0•〇5ngmL、0.02ugmL、0.01ugmL、0.005ugmL的溶液,磁分离后置于凹面载玻片上,在激光拉曼光谱下得到罗丹明RhB的相关特征峰及谱图,以ISlOcnf1处的峰强对TTX浓度进行双对数作图,获得工作曲线,如图10所示,线性方程为1111151=9.34725111〇^+0_892291111151为1510^1处拉曼峰强的对数,lnCrrx为河脎毒素浓度的对数),R=〇.9959。[0098]图9为TTX浓度为0•2ngmL、0•lUgmL、0•05ygmL、0•02ygmL、0•0lUgmL、0.005ugmL的拉曼光谱图。由图可知,随着TTX浓度的降低,拉曼信号也在随之降低,当浓度达到O.OlUgmL时,拉曼信号还有一定的强度,而当浓度再降低到〇.〇〇5ygmL时,信号接近消失,说明此方法检测TTX时,可达到0•01ygmL的检测限,灵敏度非常高,已超越TTX国家检测限的20iigkg。[0099]c水中河豚毒素样品的检测[0100]配制浓度为0•5、0•05、0•01ygmL的河豚毒素水溶液样品作为待测溶液,每个浓度在同等条件下测试三次。检测结果中河豚毒素的回收率为82.64%〜92•60%,相对标准偏差RSD在2.6%〜11.1%之间。由于磁分离显著提高了检测灵敏度,显著缩短了激光拉曼光谱仪对样品的照射时间,使整个测试过程能在10分钟内完成,从而可实现对河豚毒素的快速检测。

权利要求:1.—种Fe3〇4Si02AuSi02NH2金磁纳米颗粒,其特征在于所述Fe3〇4Si02AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒按以下方法制备:先以3〇4纳米颗粒为起始物,加入呢的在巧办表面形成Si〇2外壳,再加入APTES以及MPTES对Si〇2外壳表面进行功能化,得到表面带_題2和-SH的Fe3〇4Si02纳米颗粒;同时用柠檬酸钠还原HAuC14溶液得到粒径均匀分布的Au纳米颗粒;将Au纳米颗粒加入所述表面带-和-SH的Fe3〇4Si02纳米颗粒,通过-腿2的静电吸附和Au-S键的作用进一步将Au纳米颗粒致密地组装在Fe3〇4Si02表面,形成具有核壳结构的FesCkSi02Au金磁纳米颗粒,再加入TEOS和APTES,最终得到所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒。2.如权利要求1所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒,其特征在于所述制备方法包括以下步骤:⑴表面带-Mfe和-SH的Fe3〇4Si〇2纳米颗粒的制备:将Fe304纳米颗粒用含乙醇、氨水的水溶液A分散,所述含乙醇、氨水的水溶液A中乙醇、氨水与水体积比例为45〜55:1:10,所述Fe3〇4纳米颗粒在所述含乙醇、氨水的水溶液A中质量浓度为〇•02%-0.04%,在pH=9〜11的条件下超声5-lOmin,加入TE0S,在超声下反应6〜8h,反应结束后磁分离收集颗粒,先后用无水乙醇、水洗涤,用含乙醇、氨水的水溶液A分散,超声5-10min,再加入APTES与MPTES,在超声作用下反应16-18h,反应结束后磁分离收集颗粒,得到表面带-NH2和-SH的Fe3〇4纳米颗粒,再依次用无水乙醇、水洗涤,最后分散在水中待用;所述TE0S的体积用量以Fe3〇4纳米颗粒的质量计为1.5〜2.5mLg;所述TE0S与APTES、MPTES体积比为1.5〜2.5:1:1;⑵Au纳米颗粒的制备:将水加热至95〜101°C,加入质量分数为3%〜6%梓檬酸钠溶液,15〜25s后加入10mgmL〜12mgmL氯金酸水溶液,保持100°C至反应结束后停止加热,搅拌下自然冷却,冷却至室温后离心分离,收集下层颗粒,分散至水中待用;所述柠檬酸钠溶液与水、氯金酸水溶液的体积比为1:500:10〜12;⑶Fe3〇4Si02AuSi02NH2金磁纳米颗粒的制备:取步骤⑴所得颗粒溶液与步骤2颗粒溶液,步骤(1所得颗粒溶液中表面带-NH2和-SH的Fe3〇4纳米颗粒与步骤2中Au纳米颗粒的质量比为1:5〜6,混合后反应6〜8h,然后磁分离后弃去上清液,用水洗涤,重复上述反应再分离洗涤过程,最后分散于水中,得到Fe3〇4纳米颗粒表面完全包覆Au纳米颗粒的金磁纳米颗粒,S卩Fe304Si02Au金磁纳米颗粒;再用水洗涤后磁分离收集,用含乙醇、氨水的水溶液B分散,所述含乙醇、氨水的水溶液B中水、氨水与乙醇的体积比例为10:1:60〜80,所述Fe3〇4Si02Au金磁纳米颗粒在含乙醇、氨水的水溶液B中质量浓度为〇.029%-0.035%,超声震荡5-10min,缓慢加入TE0S,在超声环境下反应6〜8h,反应结束后磁分离收集颗粒,即Fe304Si02AuSi02金磁纳米颗粒,用水洗涤,再用所述含乙醇、氨水的水溶液B分散,所述Fe3〇4Si02AuSi02金磁纳米颗粒在含乙醇、氨水的水溶液B中质量浓度为0.029%-0.038%,超声振荡5-10min,再加入APTES,在超声振荡作用下反应16〜18h,反应结束后用水洗涤,得到所述Fe3〇4Si02AuSi02NH2金磁纳米颗粒;所述TEOS的体积用量以Fe3〇4Si02Au纳米颗粒的质量计为2.1〜2.4mLg;所述APTES与TEOS体积比为3:1•5〜2•5。3.如权利要求2所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒的制备方法,其特征在于:步骤3中所述步骤1所得颗粒与步骤2颗粒混合采用搅拌方式实现。4.如权利要求1所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2懸金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素的应用。5.如权利要求4所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法为:a拉曼光谱基底制备将Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒与NHS-PEG-NHS在pH=7•4磷酸盐缓冲液中反应,再与河豚毒素抗体反应得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体;所述NHS-PEG-NHS的体积用量以Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒的质量计为lmLmg〜1.5mLmg;所述河膝毒素抗体的体积用量以Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒的质量计为〇.lmLmg〜〇.2mLmg;将罗丹明B拉曼染料与河豚毒素抗体在pH=S.3的NaHC〇3缓冲液反应得到RhB修饰后的河豚毒素抗体;所述罗丹明B拉曼染料的用量以河豚毒素抗体的体积用量计为〇.5〇mgmL〜0.55mgmL;⑹建立水中河豚毒素检测的工作曲线金磁纳米颗粒修饰后河脉毒素抗体与RhB修饰后的河豚毒素抗体混合后磁分离,所述RhB修饰后的河豚毒素抗体与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体的体积用量比为1:5〜1〇;并转移至凹面载玻片上,通过激光拉曼光谱仪直接照射得到罗丹明RhB的拉曼光谱图;’取与上述步骤等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体,与河豚毒素配制成具有梯度的0•01〜0.5ygmL浓度范围的河豚毒素溶液,测量其拉曼光谱图,与罗丹明RhB的拉曼光谱图比较得河豚毒素存在时,RhB有l5l〇cm-1的特征峰,以1510cm^处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图,获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线;c水中河豚毒素样品的检测将样品与步骤C中等量的金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体、RhB修饰后的河豚毒素抗体配置成溶液,测量其拉曼光谱图,如出现1510CHT1处的RhB特征峰,读取其峰强,代入步骤b中所得工作曲线可计算出溶液中河豚毒素的浓度,即可计算出样品中河豚毒素的浓度;如未出现lSlOcnf1处的RhB特征峰,说明样品中河豚毒素的量极微少或不存在。’、6.如权利要求5所述的Fe3〇4Si〇2AuSi〇2NH2金磁纳米颗粒结合表面增强拉曼光谱快速检测河豚毒素方法为:a称取lmgNHS-PEG-NHS,溶于lmLpH=7.4的磷酸盐缓冲液(PBS中,与lmLFe3〇4SiVAuSi〇2NH2金磁纳米颗粒混合,振荡反应6h,反应结束后磁分离收集颗粒,用PBS洗潘金磁纳米颗粒,再次磁分离;用2mLPBS将收集到的颗粒分散,加入hlmLlmgmL河豚毒素抗体溶液,室温下振荡反应6h;反应结束后保存在4-C冰箱中备用,得到金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体;取50yg罗丹明B拉曼染料溶于〇_2mLpH=8.3的NaHC03缓冲液中;再加入O.lmLlmgmL的河豚毒素抗体;混匀后室温下振荡反应6h;反应结束后用NaHC03缓冲液透析混合液,除去多余的罗丹明B拉曼染料,得到RhB修饰后的河豚毒素抗体;⑹取金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体50lliRhB修饰后的河豚毒素抗体l〇uL,与河豚毒素配制成浓度为0•5ugmL、0.lugmL、0.05ugmL、0.02ugmL、0.01ugmL时的拉曼光谱图,以lSlOcnf1处的RhB特征峰的峰强对河豚毒素浓度进行双对数作图,获得水中快速检测河豚毒素的工作曲线;TTX浓度在〇•5即此至〇•〇iygmL范围内,1510cm-1处拉曼峰强的对数与河豚毒素浓度的对数线性关系良好,线性方程为InIl51Q=9.34725InCm+0.89229,其中lnlisi。为lSlOcm—1处拉曼峰强的对数,lnC™为河豚毒素浓度的对数,r=〇.9959;c将样品与金磁纳米颗粒修饰后河豚毒素抗体5〇uL肋8修饰后的河豚毒素抗体1〇此立如出现1510cm_1处的RhB特征峰,读取其峰强,代入步骤⑹

百度查询: 浙江工业大学 一种金磁纳米颗粒的制备及其结合表面增强拉曼光谱法快速检测河豚毒素

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