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【发明授权】从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法_浙江大学_201710628074.3 

申请/专利权人:浙江大学

申请日:2017-07-28

公开(公告)日:2020-07-28

公开(公告)号:CN107287158B

主分类号:C12N5/0775(20100101)

分类号:C12N5/0775(20100101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.28#授权;2017.11.24#实质审查的生效;2017.10.24#公开

摘要:本发明涉及间充质干细胞获取方法,旨在提供一种从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法。提供一种高效获取小鼠间充质干细胞的方法,包括小鼠间充质干细胞的分离、原代培养、小鼠间充质干细胞的扩增培养等步骤。本发明极大程度缩短了细胞培养所用时间,获取的细胞量极大提升,更少的非MSCs贴壁细胞的污染的优势。本发明首次建立多次骨片贴片培养法,使细胞得率提高3‑5倍。本发明通过对小鼠致密骨MSCs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研究,证实了经体外10次扩增培养以后,细胞仍具有较强的干细胞特性,可满足实验研究的需要。不但能快速高效获取干细胞,而且获得的干细胞具有较快的增殖生长速度,及较强的分化潜能。

主权项:1.一种高效获取小鼠间充质干细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:(1)小鼠间充质干细胞的分离:将注射器针头插入小鼠肱骨、胫骨或股骨的骨髓腔,在MEM培养液中反复抽吸、推注多次,冲洗骨髓腔直到骨髓腔变白;然后剪碎成骨片,将骨片转移到含有2mgmlII型胶原酶和含10%(vv)胎牛血清的MEM培养液中,37℃下振荡消化;吸弃上层消化液,用含10%(vv)胎牛血清的MEM培养液反复清洗骨片,将其接种到盛有完全培养液的塑料平皿中,在37℃、5%二氧化碳培养箱中静置培养3天;在第三个培养日更换新鲜的完全培养液,在37℃、5%二氧化碳培养箱中继续培养2天,骨片周围爬出来的细胞集落即为原代MSCs细胞;(2)原代培养:继续上一步骤的培养,第5个培养日吸弃细胞培养液;滴加磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次,吸弃洗涤液,加胰蛋白酶,室温消化至80%以上贴壁细胞脱落;加入含10%(vv)胎牛血清的MEM培养液终止消化,经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬,接种到细胞培养瓶中,在37℃、5%二氧化碳培养箱中静置培养;每48小时更换培养液,每天观察细胞的生长状态;培养至3-4天后,将骨片再次接种到含完全培养液的塑料平皿中,在37℃、5%二氧化碳培养箱中静置培养;骨片周围再次爬出来的细胞集落重复本步骤的操作;重复接种骨片的操作共3-5次;(3)小鼠间充质干细胞的扩增培养:当原代培养的细胞密度达到90%以上时,吸弃细胞培养液,磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次,吸弃洗涤液,加胰蛋白酶室温消化至80%以上贴壁细胞脱落,加入完全培养液终止消化;经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬,并进行分瓶传代扩增培养;所述完全培养液是含有终浓度2mmolLL-谷氨酰胺、100μgml青霉素、100μgml链霉素、3.7gL碳酸氢钠和10%(vv)胎牛血清的MEM培养液。

全文数据:从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法发明领域[0001]本发明涉及间充质干细胞获取方法,特别是涉及一种从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法。背景技术[0002]间充质干细胞mesenchymalstemcells,MSCs是干细胞中的一类,是一群贴壁生长的成纤维细胞样细胞,具有多向分化能力,能够产生多种细胞因子和生长因子;具有造血支持、免疫调节和抗炎功能,在再生医学领域具有重大的科学和实用价值。[0003]MSCs—般被认为不是单一种类细胞,而是一种混杂细胞群体,故其表面的抗原表达也不具有专一性特点。MSCs标志物包括Sca-1、CD29、CD44和CD105等表面标志阳性。不包括CD31、CD:34、CD45和MHC-1A。此外,还需进行分化能力鉴定,包括成骨和成脂能力鉴定。[0004]当前对千细胞的研究多集中于骨髓来源的MSCs,但由于获取大量小鼠骨髓细胞十分困难,培养过程中易受非MSCs贴壁细胞的污染,且随着小鼠年龄增长其细胞数量和分化能力出现明显下降趋势。故寻找一种能高效获取小鼠间充质干细胞的方法迫在眉睫。[0005]目前已发现小鼠致密骨中存在MSCs,致密骨组成包括骨细胞、成骨细胞、破骨细胞、骨软骨祖细胞MSCs组成)、血管和神经细胞。骨细胞存在于骨基质,成骨细胞和破骨细胞存在骨表面,MSCs存在于骨膜、骨内膜和包含血管的骨通道中。从致密骨中分离出的MSCs,其在形态学和免疫表型上均类似于骨髓来源的MSCs。此外,致密骨来源的MSCs具有培养用时短,获取细胞量多,更少的非MSCs贴壁细胞的污染等优势。[0006]目前分离小鼠致密骨MSCs的方法主要是酶消化法。酶消化法由于损失了一些骨表面的MSCs,去除了成骨细胞和破骨细胞,所以得到的主要是骨基质中的MSCs。酶消化可以使骨结构变疏松,在血清中的某些成分生长因子刺激下,促使骨细胞和MSCs从骨片迁移到培养液中。骨细胞有增殖限制性,MSCs在传代培养中逐渐成为主要细胞。但酶的浓度和消化时间对MSCs的分离和培养十分重要。因此,如何稳定、高效地从致密骨中获取[Cs是其能否成为理想MSCs来源的关键。发明内容[0007]本发明要解决的技术问题是,克服现有技术中的不足,提供一种从小鼠致密骨中高效获取间充质干细胞的方法。[0008]为实现上述目的,本发明的解决方案是:[0009]提供一种高效获取小鼠间充质干细胞的方法,包括以下步骤:[0010]⑴小鼠间充质干细胞的分离:[0011]将小鼠肱骨、胫骨和股骨冲洗骨髓腔后,剪碎成骨片;将骨片转移到含有2mgmlII型胶原酶和含10%vv的胎牛血清的MEM培养液中,37。:下振荡消化;吸弃上层消化液,用含10%vv的胎牛血清的MEM培养液反复清洗骨片,将其接种到盛有完全培养液的塑料平皿中,在3TC、5%二氧化碳培养箱中静置培养3天;在第三个培养日更换新鲜的完全培养液,在37°C、5%二氧化碳培养箱中继续培养2天,骨片周围爬出来的细胞集洛叫乃保八MbLs细胞;[0012]⑵原代培养:[0013]继续上一步骤的培养,第5个培养日吸弃细胞培养液;滴加磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次,吸弃洗涤液,加胰蛋白酶,室温消化至80%以上贴壁细胞脱落;加入含10%vv胎牛血清的MEM培养液终止消化,经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬,接种到细胞培养瓶中,在37-C、5%二氧化碳培养箱中静置培养;每48小时更换培养液,每天观察细胞的生长状态;[0014]培养至3-4天后,将骨片再次接种到含完全培养液的塑料平皿中,在37°C、5%二氧化碳培养箱中静置培养;骨片周围再次爬出来的细胞集落重复本步骤的操作;重复接种骨片的操作共3-5次;[0015]3小鼠间充质干细胞的扩增培养:[0016]当原代培养的细胞密度达到90%以上时,吸弃细胞培养液,PBS浸洗贴壁细胞多次,吸弃洗涤液,加胰蛋白酶室温消化至80%以上贴壁细胞脱落,加入完全培养液终止消化;经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬,并进行分瓶传代扩增培养;[0017]所述完全培养液是含有终浓度2mmolLL-谷氨酰胺、100ugml青霉素、100ugml链霉素、3.7gL碳酸氢钠和10%vv胎牛血清的MEM培养液。[0018]本发明中,所述冲洗骨髓腔的操作是:将注射器针头插入小鼠肱骨、胫骨或股骨的骨髓腔,在MEM培养液中反复抽吸、推注多次,冲洗骨髓腔直到骨髓腔变白。[0019]与现有技术相比,本发明的有益效果在于:[0020]1、本发明极大程度缩短了细胞培养所用时间,获取的细胞量极大提升,更少的非MSCs贴壁细胞的污染的优势。[0021]2、本发明首次建立多次骨片贴片培养法,使细胞得率提高3-5倍。[0022]3、本发明通过对小鼠致密骨MSCs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研宄,证实了经体外10次扩增培养以后,细胞仍具有较强的干细胞特性,可满足实验研究的需要。不但能快速高效获取干细胞,而且获得的干细胞具有较快的增殖生长速度,及较强的分化潜能。附图说明[0023]图1为常规方法小鼠骨髓MSCs贴壁培养方法获取的细胞P0代40倍形态学照片;[0024]图2为常规方法小鼠骨髓MSCs贴壁培养方法获取的细胞p7代4〇倍形态学^片:[0025]图3为本发明从小鼠致密骨中获取的细胞P〇40倍形态学照片。_’[0026]图4为本发明从小鼠致密骨中获取的细胞P7代40倍形态学照片。[0027]可以看到,图3、4中与图1、2相比杂细胞少,细胞形态更一致;[0028]图5为本发明用小鼠致密骨骨片第一次贴壁的40倍形态学照片;[0029]图6为本发明用小鼠致密骨骨片第二次贴壁的40倍形态学照片;[0030]图7为本发明用小鼠致密骨骨片第三次贴壁的40倍形态学照片.[0031]可以看到,大量细胞从贴壁骨片中爬出;^’[0032]图8为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,成脂诱导第12天,对诱导出的细胞进行特异性油红染色的照片;[0033]图9为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,成骨诱导第18天,对矿化结节进行茜素红染色的照片。[0034]图10为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,高表达细胞表面标志CD29,采用流式细胞术检测显示⑶29阳性率为99.9%。[0035]图11为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,高表达细胞表面标志CD44,采用流式细胞术检测显示⑶44阳性率为95.52%。[0036]图12为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,高表达细胞表面标志SCA-1,采用流式细胞术检测显示SCA-1阳性率为98.29%。[0037]图13为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,中表达细胞表面标志CD105,采用流式细胞术检测显示⑶105阳性率为52.15%。[0038]图14为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,低表达细胞表面标志CD34,采用流式细胞术检测细胞表面标志,CD34阳性率为6•15%。[0039]图15为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,低表达细胞表面标志CD31,采用流式细胞术检测细胞表面标志,CD31阳性率为1.11%。[0040]图16为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,低表达细胞表面标志CD45,采用流式细胞术检测细胞表面标志,CD45阳性率为4.9%。[0041]图17为本发明从小鼠致密骨中高效获取的MSCs,低表达细胞表面标志MHC-1A,采用流式细胞术检测细胞表面标志,MHC-1A阳性率为1.89%。具体实施方式[0042]首先对本发明所用小鼠肱骨、胫骨和股骨的来源进行说明:[0043]本发明所用的小鼠胧骨、胫骨和股骨均取自实验室废弃的自然死亡的小鼠:选择其中2-3周龄的体重6-8g的BALBc幼鼠尸体或C57BL6幼鼠尸体,用100ml70%乙醇清洗后,在生物安全柜内取出肱骨、胫骨和股骨供后续试验。本发明的实施过程中,不存在杀死存活小鼠的操作,也不存在对小鼠活体采取剖开、切除等创伤性或者介入性处置。[0044]本发明中,所述MEM培养液为市购商品,系HyCloneTM生产的MEMAlphaModificationlX培养基,商品目录号SH30265.01试剂商官方网站:www.gelifescience.comhyclone〇[0045]下面结合具体实施例子,对本发明的技术方案详细描述。[0046]1小鼠间充质干细胞的分离:[0047]取小鼠肱骨、胫骨和股骨,的将〇.45mm注射器针头插入骨髓腔,在10mlMEM培养液中反复抽吸,推注三次,冲洗骨髓腔直到骨髓腔变白,置于25cm2塑料平皿中,滴加lml含100ygml青霉素、100ugml链霉素的PBS,浸没后用眼科剪剪成l-3mm3骨片。用眼科镊将骨片转移到15ml离心管内,加入3ml含有2mgmlII型胶原酶和10%胎牛血清的MEM培养液中,置于37°C摇床上消化2小时,摇床转速是200转分钟。吸弃上层消化液,加5ml含10%胎牛血清vv的MEM培养液反复清洗骨片三次后,将骨片接种到盛有5ml含有终浓度2mmolL的L-谷氨酰胺,l〇〇ygml青霉素和100ugml链霉素,3•7glNaHC03和10%胎牛血清的MEM培养液的25cm2塑料平皿中,在37°C,5%二氧化碳培养箱中静置培养3天。在第三个培养日,更换新鲜的元全培养液,在37°C,5%二氧化碳培养箱中继续培养2天,骨片周围爬出来的细胞集落即为原代MSCs细胞;[0048]⑵原代培养:[0049]继续上一步骤的培养,在第5个培养日,小心吸弃细胞培养液,滴加PBS浸洗贴壁细胞两次,小心吸弃洗涤液,加lml〇.25%胰蛋白酶,室温消化(18-25°C消化3分钟以内)至80%以上贴壁细胞脱落,加入3倍含1〇%胎牛血清vv的MEM培养液终止消化,经4°C,1200转分钟,离心4分钟分离,所得的细胞沉淀用5ml完全培养液重悬,接种到T25细胞培养瓶中,在37°C,5%二氧化碳培养箱中静置培养,每48小时更换培养液,每天观察细胞的生长状态。培养3-4天后,将骨片再次接种到含完全培养液的塑料平皿中,在37°C,5%二氧化碳培养箱中静置培养,骨片周围再次爬出来的细胞集落重复以上操作。重复接种骨片的操作共3-5次;[0050]⑶小鼠间充质干细胞的扩增培养:[0051]当上述原代培养的细胞密度达到90%以上时,吸弃细胞培养液,PBS浸洗贴壁细胞2次,吸弃洗涤液,加lml0.25%胰蛋白酶室温消化至80%以上贴壁细胞脱落,加入3倍消化液体积的完全培养液终止消化,经4°C,1200转分钟,离心4分钟分离所得的细胞沉淀用5ml完全培养液重悬,以1:2传代,每48小时更换培养液,每周传代2次。[0052]本发明首次建立多次骨片贴片培养法,使每只小鼠获得的MSCs得率至少提高5倍,能缩短一半细胞培养所用时间。[0053]本发明通过对小鼠致密骨MSCs生物学特性如生长状态、表面标志物、多向分化潜能等方面的系统研宄,证实了经体外1〇次扩增培养以后,细胞仍具有较强的千细胞特性,可满足实验研宄的需要。不但能快速高效获取干细胞,而且获得的干细胞具有较快的增殖生长速度,及较强的分化潜能。

权利要求:1.一种高效获取小鼠间充质干细胞的方法,其特征在于,包括以下步骤:1小鼠间充质干细胞的分离:将小鼠肱骨、胫骨和股骨冲洗骨髓腔后,剪碎成骨片;将骨片转移到含有2mgmlII型胶原酶和含10%vv胎牛血清的MEM培养液中,37。:下振荡消化;吸弃上层消化液,用含10%vv胎牛血清的MEM培养液反复清洗骨片,将其接种到盛有完全培养液的塑料平皿中,在3rc、5%二氧化碳培养箱中静置培养3天;在第三个培养日更换新鲜的完全培养液,在37°c、5%二氧化碳培养箱中继续培养2天,骨片周围爬出来的细胞集落即为原代MSCs细胞;⑵原代培养:继续上一步骤的培养,第5个培养日吸弃细胞培养液;滴加磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次,吸弃洗涤液,加胰蛋白酶,室温消化至80%以上贴壁细胞脱落;加入含10%vv胎牛血清的MEM培养液终止消化,经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬,接种到细胞培养瓶中,在37°C、5%二氧化碳培养箱中静置培养;每48小时更换培养液,每天观察细胞的生长状态;培养至3-4天后,将骨片再次接种到含完全培养液的塑料平皿中,在37°C、5%二氧化碳培养箱中静置培养;骨片周围再次爬出来的细胞集落重复本步骤的操作;重复接种骨片的操作共3-5次;⑶小鼠间充质干细胞的扩增培养:当原代培养的细胞密度达到90%以上时,吸弃细胞培养液,磷酸盐缓冲液浸洗贴壁细胞多次,吸弃洗涤液,加胰蛋白酶室温消化至80%以上贴壁细胞脱落,加入完全培养液终止消化;经离心分离所得的细胞沉淀用完全培养液重悬,并进行分瓶传代扩增培养;所述完全培养液是含有终浓度2mmolLL-谷氨酰胺、100ugml青霉素、100ugml链霉素、3•7gL碳酸氢钠和10%vv胎牛血清的MEM培养液。2.根据权利要求1所述方法,其特征在于,所述冲洗骨髓腔的操作是:将注射器针头插入小鼠肱骨、胫骨或股骨的骨髓腔,在MEM培养液中反复抽吸、推注多次,冲洗骨髓腔直到骨髓腔变白。

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