申请/专利权人：畜科生物工程有限公司

申请日：2017-11-30

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN107973849B

主分类号：C07K14/54(20060101)

分类号：C07K14/54(20060101);C12N15/24(20060101);C12N1/21(20060101);C12N15/70(20060101);A61K38/20(20060101);A61K39/39(20060101);A61P37/04(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2018.05.25#实质审查的生效;2018.05.01#公开

摘要：本发明涉及一种用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质及其应用，涉及基因工程领域。该用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质，其氨基酸序列如a或b所示：aSEQIDNO.1；b将SEQIDNO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有与SEQIDNO.1具有相同的促进免疫活性功能的衍生序列。其应用于与市售疫苗联合免疫，可提高抗原免疫活性，增强疫苗免疫效果，非常适用于猪病毒病的预防。

主权项：1.一种用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

全文数据：一种用于増强猪疫苗免疫效果的蛋白质及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程领域，且特别涉及一种用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质及其应用。背景技术[0002]由病毒、细菌等病原微生物侵染动物所引起的各种传染性疾病严重制约了各个国家和地区养殖业的健康发展，同时也对人类健康存在巨大隐患。因此，对动物传染性疾病的防治措施研究具有重大的经济价值和社会意义，疫苗免疫是当前预防和控制传染病的主要措施，但目前使用的常规疫苗并不理想，存在免疫效率低与安全性差的两大难题。因此，在安全剂量疫苗接种下增强疫苗的免疫效果，成为当今疫苗开发研究的焦点。[0003]细胞因子是由免疫效应细胞和相关细胞产生的，具有重要生物学活性的细胞调节蛋白，以其安全性、有效性、种类多、工艺简单，且能有效地增强机体的细胞免疫和体液免疫反应，作为免疫佐剂越来越受到重视。白细胞介素-33interleukin-33，IL-33是在2005年发现的一种前炎症细胞因子，属于IL-I家族新成员，主要由上皮细胞、内皮细胞、纤维母细胞和平滑肌细胞表达。IL-33不仅能激发THl免疫应答，还能激发TH2及细胞毒性T细胞CD8+免疫，这对于病原体侵入的预防和清除是非常重要的。最近有研究表明，将鼠白细胞介素-33与流感疫苗采用滴鼻免疫的方式联合免疫小鼠，IgG和SlgA抗体显著增高，Thl及Th2型细胞因子明显增多，并且能够抵抗致死性攻击。[0004]但市面上对于细胞因子作为免疫佐剂的应用较少。发明内容[0005]本发明的第一目的在于提供一种用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质，其能够与市售疫苗联合免疫，可提高抗原免疫活性，增强疫苗免疫效果，非常适用于猪病毒病的预防。[0006]本发明的第二目的在于提供一种编码上述蛋白质的核酸分子。[0007]本发明的第三目的在于提供一种包含上述核酸分子的载体。[0008]本发明的第四目的在于提供一种含有上述核酸分子的重组细胞，其中，蛋白质在重组细胞高效表达，且表达量达重组细胞总蛋白的50%以上。[0009]本发明的第五目的在于提供上述蛋白质、上述核酸分子、上述载体、或上述重组细胞在制备猪用疫苗免疫增强剂中的应用。[0010]本发明的第六目的在于提供一种猪用疫苗免疫增强剂，其与市售疫苗联合免疫，有效增强疫苗的免疫效果。[0011]本发明的第七目的在于提供一种上述蛋白质的制备方法，该方法其操作简单，周期短，成本低廉，特异性好，反应灵敏，制备的浓度较高，利于大量制备。[0012]本发明的第八目的在于提供一种猪用疫苗，其包括上述蛋白质。[0013]本发明解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。[0014]本发明提出一种用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质，其氨基酸序列如a或⑹所示：（aSEQIDNO.1;⑹将SEQIDNO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有与SEQIDNO.1具有相同的促进免疫活性功能的衍生序列。[0015]编码上述蛋白质的核酸分子。[0016]进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述核酸分子的碱基序列如SEQIDNO.2所不。[0017]一种载体，其含有上述核酸分子。[0018]—种重组细胞，其含有上述载体。[0019]上述蛋白质、上述核酸分子、上述载体、或上述重组细胞在制备猪用疫苗免疫增强剂中的应用。[0020]—种猪用疫苗免疫增强剂，其包括:上述蛋白质或上述重组细胞。[0021]—种上述蛋白质的制备方法，其包括如下步骤:培养上述重组细胞，从培养产物中分离、纯化得到蛋白质。[0022]进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述重组细胞为大肠杆菌。[0023]一种猪用疫苗，其包括上述蛋白质。[0024]与现有技术相比，本发明的有益效果是：[0025]用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质在大肠杆菌中能高效表达，表达量达菌体总蛋白的50%以上，且其制备操作简单、周期短、成本低廉、特异性好。[0026]将其应用于增强猪疫苗免疫，同时具体将其与市售疫苗联合免疫，可提高抗原免疫活性，增强疫苗免疫效果，非常适用于猪病毒病的预防，易于大范围推广应用。附图说明[0027]为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。[0028]图1为本发明实施例1提供的核酸分子的琼脂糖凝胶电泳示意图；[0029]图2为本发明实施例3提供的纯化后IL-33蛋白SDS-PAGE电泳结果示意图。具体实施方式[0030]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。[0031]以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。[0032]需要说明的是，IL-33的N末端没有明显的信号肽，IL-33作为大的前蛋白原形式产生和分泌，该前蛋白原需要充分加工以释放成熟的生物活性形式，其成熟蛋白分子量约为18kDa。猪IL-33蛋白编码276个氨基酸，全长蛋白质的第120位氨基酸被选择作为N-末端氨基酸。[0033]因此本发明用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质，发明人选择表达IL-33C端（第120-276位氨基酸），将其蛋白产物作为佐剂，与市售疫苗联合免疫，从而增强疫苗的免疫效果，该蛋白质的选择，为发明人经过创造性的劳动所得。[0034]还需要说明的是，本发明所例举的实施例中，RNA提取试剂盒、RT-PCR试剂盒均购自Promega公司；pMD-19T载体、大肠杆菌DH5a感受态细胞均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。[0035]NcoI酶、XhoI酶、pET28a+和T4DNA连接酶均购自TaKaRa公司，大肠杆菌RosettaDE3感受态细胞购自上海生工生物工程技术服务有限公司。[0036]内毒素清除树脂购自上海生工生物工程技术服务有限公司。[0037]将序列1所示的蛋白质命名为IL-33,将IL-33的编码基因命名为IL-33,将得到的含有IL-33的pMD-19T载体命名为pMD19-IL-33。[0038]实施例1[0039]获取用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质的核酸分子，方法如下：[0040]猪总RNA的提取:参照Promega公司的RNA提取试剂盒说明书，从猪脾脏或淋巴结等组织中提取猪总RNA。[0041]IL-33目的基因的反转录及PCR:根据Promega公司的RT-PCR试剂盒进行反转录，获得IL-33-mRNA的cDNA。参照猪IL-33基因序列OieneBank号:AB292180，设计如下引物：[0042]IL-33-F120:cccatatgagtatcaaagaacattctgct[0043]IL-33-R276：ccctcgagcattaagtttgagagcttaaatg[0044]以cDNA为模板，用设计的引物进行PCR扩增：[0045]PCR反应条件如下：95°C预变性5分钟，1个循环;95°C变性30秒，55°C退火30秒，72°C延伸30秒，共35个循环;72°C终延伸5分钟。[0046]并对PCR扩增产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，结果如图1所示，其中图1中泳道M为DNAMarker，泳道1为阴性对照，泳道2为目的基因，经图1可得，目的基因的大小约470bp，与实际大小相符。[0047]将PCR产物亚克隆入pMD-19T载体，转化大肠杆菌DH5a，挑取阳性单克隆进行基因测序，测序结果表明，PCR产物如序列表的序列2所示。序列2所示基因编码序列1所示的蛋白质。[0048]当然，在其他的实施例中，也可以直接采用化学合成的方式获取序列2所示的编码基因。[0049]实施例2[0050]构建大肠杆菌表达载体IL-33pET28a+，方法如下：[0051]1将实施例1得到的PCR扩增产物用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切后，回收酶切产物。[0052]2用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET28a+，回收载体骨架。[0053]3用T4DNA连接酶将步骤⑴的酶切产物和步骤2的载体骨架连接，得到连接产物。[00M]⑷将步骤⑶的连接产物转化大肠杆菌RosettaDE3感受态细胞，挑单克隆进行PCR鉴定，阳性克隆提质粒进行测序鉴定，测序结果表明，得到了重组质粒IL-33pET28a。[0055]重组质粒IL-33pET28a的结构描述:在载体pET28a+的NcoI和XhoI酶切位点之间插入了序列表的序列2所示的DNA。[0056]实施例3[0057]制备含有载体IL_33pET28a+的重组细胞，方法如下：[0058]将含有pET28a-IL_33的大肠杆菌RosettaDE3命名为Rosetta-IL_33pET28a，得到重组细胞。[0059]将得到的重组细胞Rosetta-IL_33pET28a以及实施例2得到的载体RosettapET28a分别接种于含有lOOmgmL卡那霉素的LB培养基中，于37°C、150rpm振荡培养至0D600=1，然后加入IPTG至终浓度为0.3mM，于37°C诱导4h。[0060]分别将Rosetta-IL-33pET28a以及RosettapET28a的诱导前和诱导后的菌液，在12000rpm离心IOmin，收集菌体经PBS重悬，超声破菌后，12000rpm离心15min，取上清和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳。[0061]根据SDS-PAGE电泳结果，Rosetta-IL-33pET28a检测结果显示沉淀中出现18KD左右的目的蛋白条带，而上清中没有目的蛋白条带，R〇settapET28a的上清和沉淀中都检测不到目的蛋白。[0062]分别将Rosetta-IL_33pET28a以及RosettapET28a的诱导前和诱导后的菌液，在IOOOOrpm离心IOmin，收集菌体经PBS重悬，超声破菌后12000rpm离心15miη，收集菌体，用PBS悬浮，然后进行12%SDS-PAGE电泳检测，以每平方厘米膜面积X0.65mA的恒流转膜1.5-2小时，放入用TBST配置的5%的脱脂牛奶中，脱色后弃去封闭液5g脱脂牛奶溶于IOOmL加入TBST25mMNaCl、100mMTris、0.2%Tween-20定容至IOOOmL，加入用封闭液配制的一抗，室温下孵育3小时，回收一抗后保存。[0063]将膜放入TBST溶液中脱色，加入用封闭液配制的HRP标记的二抗后脱色，加入TBST洗膜3次后脱色，进行显影、定影洗片、压片。[0064]其中，Rosetta-IL_33pET28a的westernblot检测结果表明诱导后确实产生了目的蛋白，R0settapET28a诱导前及诱导后都没有目的蛋白信号。以上结果表明IL-33在大肠杆菌中正确表达。[0065]实施例4[0066]蛋白质的分离和纯化，方法如下：[0067]培养实施例4提供的重组细胞Rosetta-IL-33pET28a，从培养产物中分离、纯化得到上述蛋白质。[0068]具体为:将诱导后培养产物，即菌液，在12000rpm离心IOmin，收集菌体经I3BS重悬，超声破菌，12000rpm离心15min，收集菌体，用PBS悬浮，超声裂解后，12000rpm离心30min，收集沉淀，加入washingbuffer0.5%Triton-100,50mMTrispH8.0,300mMNaCl，IOmMEDTA洗涤，使用移液管吹洗数次，12000rpm离心10-20min，收集沉淀，重复洗涤3次，尽量去除细菌碎片。沉淀用resuspensionbuffer50mMTrispH8·0，100mMNaCl，10mMEDTA悬浮。12000rpm离心10_20min，按30mgmL用尿素（8M溶解，4°C搅拌溶解。12000rpm离心10-20min，倒出上清，分装成2mL管，于-20°C或-80°C保存备用。[0069]取纯化后的IL-33蛋白进行SDS-PAGE电泳，检测结果如图2所示，其中，图2泳道M为分子量蛋白Marker，泳道1为纯化后的IL-33蛋白。[0070]采用稀释复性的方法以1:20倍比例稀释纯化后的蛋白（复性液配方：IOOmMTrispH8.0,400mML-ArgHCl，2mMEDTA，5mMGSH，0.5mMGSSG，20%甘油），然后用Millipore的八.111_:〖€；311#1111^3-15超滤管进行蛋白浓缩，浓缩后经仪器测定蛋白浓度为1〇11^1111^，浓缩后的蛋白于-20°C或-80°C保存备用。[0071]接着，将浓缩后的IL-33蛋白经内毒素清除树脂处理后，检测该批IL-33蛋白内毒素含量小于〇.2EUml，满足免疫动物的要求，即可。其中，去除内毒素后的蛋白于-20°C或_80°C保存备用。[0072]试验例1[0073]将实施例4制备的IL-33蛋白液用PBS缓冲液稀释至10倍体积，得到IL-33蛋白稀释液lmgmL。[0074]①用小白鼠效检[0075]采用体重14-18g的健康小白鼠10只，各腹腔注射也可皮下注射0.2mLIL-33,观察7日。在观察期间，若出现因IL-33注射导致的抽搐、死亡等不良反应，判该批IL-33为不合格;若出现非IL-33因素导致的抽搐、死亡等不良反应，判本次校检无效，应重检，若不进行重检，则判该批IL-33不合格。[0076]②用豚鼠校检[0077]用体重350-400g的健康豚鼠10只，各腹腔注射也可皮下注射）ImLIL-33,观察7日。在观察期间，若出现因IL-33注射导致的抽搐、死亡等不良反应，判该批IL-33为不合格；若出现非IL-33因素导致的抽搐、死亡等不良反应，判本次校检无效，应重检，若不进行重检，则判该批IL-33不合格。[0078]经小白鼠和豚鼠的安全性验证结果表明，实施例2得到的IL-33是安全的，没有引起任何不良反应。[0079]试验例2[0080]IL-33佐剂与猪伪狂犬疫苗免疫猪群临床试验[0081]材料包括:疫苗:猪伪狂犬病活疫苗SA215株，批号201506002,由四川华神兽用生物制品有限公司提供。[0082]实验动物:21〜28日龄断奶仔猪。[0083]细胞培养相关材料与试剂:PKl5细胞由四川华神兽用生物制品有限公司畜禽生物制品四川省重点实验室提供，胎牛血清及DMEM培养基购于ThermoFisherScientific。[0084]IL-33蛋白稀释液:将实施例4制备的IL-33蛋白液（lOmgmL用I3BS缓冲液稀释至10倍体积，得到IL-33蛋白稀释液lmgmL。[0085]①动物免疫实验操作过程[0086]1将21日龄断奶仔猪15头，随机分为3组。[0087]2免疫剂量按照疫苗说明书使用，其中第1组使用制备的IL-33蛋白稀释液;第2组使用疫苗自带稀释液;第3组不免疫，为阴性对照组。[0088]3免疫程序为免疫一次，免疫方式为滴鼻免疫，免疫前及免疫后7、14、21、28天采集猪前腔静脉血，分离血清，测定中和抗体水平。[0089]4免疫后每天观察所有猪的体温、采食、精神状况，记录相对于对照组正常的和异常的猪，并于免疫后连续七天测定猪的体温。[0090]5按照常规方法传代PK-15细胞，然后参照《中华人民共和国兽药典》2005版三部附录《中和实验法》中记录的固定病毒稀释血清法对所有样品进行中和抗体滴度的测定。以组为单位进行数据统计。[0091]②试验结果[0092]1免疫后各组临床表现情况[0093]使用不同稀释液稀释猪伪狂犬病活疫苗免疫后，每天测定仔猪体温，以及采食、饮水、精神状态，连续测定7日，统计结果表1所示。[0094]表1免疫猪伪狂犬病活疫苗后临床症状观察结果统计[0095][0096]根据表1，使用不同稀释液稀释猪伪狂犬病活疫苗免疫，测试期间所有仔猪体温均低于40.TC，未见体温异常者。所有试验猪采食、饮水、精神状态均正常。[0097]2免疫后中和抗体变化规律[0098]免疫前和免疫后均采集仔猪血清，按照《中华人民共和国兽药典》2005版要求进行猪伪狂犬病毒中和抗体测定，中和抗体测定结果如表2所示。[0099]表2免疫猪伪狂犬病活疫苗后中和抗体测定结果[0100][0101]由表2可得，使用IL-33蛋白稀释液的试验猪中和抗体平均值在免疫后7、14、21、28日均不同程度的高于普通稀释液组，免疫后28日使用IL-33蛋白稀释液的试验猪中和抗体平均值是普通稀释液组的近2倍，表明将IL-33蛋白稀释液可以有效增强猪伪狂犬病疫苗的免疫效果。[0102]综合表1以及表2的数据，表明将IL-33蛋白稀释液和猪伪狂犬病疫苗作为新疫苗使用，可显著增强疫苗的免疫效果，有效地预防猪伪狂犬病的发生，对猪群具有保护力。[0103]试验例3[0104]IL-33佐剂与猪瘟疫苗免疫猪群临床试验[0105]材料包括:疫苗:猪瘟耐热保护剂活疫苗细胞源），批号201506002，由四川华神兽用生物制品有限公司提供。[0106]实验动物:21〜28日龄断奶仔猪。[0107]猪瘟抗体阻断ELISA检测试剂盒购于IDEXXX公司。[0108]IL-33蛋白稀释液:将实施例2制备的IL-33蛋白液（lOmgmL用I3BS缓冲液稀释至10倍体积，得到IL-33蛋白稀释液lmgmL。[0109]①动物免疫实验操作过程[0110]1将21日龄断奶仔猪15头，随机分为3组。[0111]2免疫剂量按照疫苗说明书使用，其中第1组使用制备的IL-33蛋白稀释液;第2组使用疫苗自带稀释液;第3组不免疫，作为阴性对照组。[0112]3免疫程序为免疫一次，免疫方式为肌肉注射，免疫前及免疫后7、14、21、28天采集猪前腔静脉血，分离血清后进行猪瘟抗体测定。[0113]4免疫后每天观察所有猪的体温、采食、精神状况，记录相对于对照组正常的和异常的猪，并于免疫后连续七天测定猪的体温。[0114]5按照猪瘟阻断ELISA抗体试剂盒说明书进行猪瘟抗体的测定。以组为单位进行数据统计。[0115]②试验结果[0116]1免疫后各组临床表现情况[0117]使用不同稀释液稀释猪瘟耐热保护剂活疫苗（细胞源）免疫后，每日测定仔猪体温，以及采食、饮水、精神状态，连统计结果表3所示。[0118]表3免疫后临床症状观察结果统计[0119][0121]根据表3,使用不同稀释液稀释猪瘟耐热保护剂活疫苗免疫后，于测试期间所有仔猪体温均低于40.TC，未见体温异常者。且所有试验猪采食、饮水、精神状态均正常。[0122]②免疫后抗体变化规律[0123]免疫前和免疫后均采集血清，按照试剂盒说明书进行猪瘟抗体效价测定，测定结果统计数据如表4所示。[0124]表4免疫后猪瘟阻断ELISA抗体测定结果[0125][0126]由表4可得，免疫后21、28日，试验组所有猪抗体均为阳性，且使用IL-33蛋白稀释液组抗体阻断率均高于常规稀释液组，而对照组，即第3组在免疫前、以及免疫后7、14、21、28日抗体均为阴性。因此，说明使用IL-33蛋白稀释液组可以显著增强疫苗的免疫效果。[0127]综合表3以及表4的数据，表明将IL-33蛋白稀释液和现有猪瘟疫苗可以作为新疫苗使用，同时IL-33蛋白稀释液可显著增强猪瘟疫苗的免疫效果，有效地预防猪瘟的发生，对猪群具有保护力。[0128]综上所述，本发明实施例的提供的用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质及其应用，用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质在大肠杆菌中能高效表达，表达量达菌体总蛋白的50%以上，且其制备操作简单、周期短、成本低廉、特异性好。将其应用于增强猪疫苗免疫，具体将其与市售疫苗联合免疫，可提高抗原免疫活性，增强疫苗免疫效果，非常适用于猪病毒病的预防，易于大范围推广应用。[0129]以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

权利要求：1.一种用于增强猪疫苗免疫效果的蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如a或b所示：（aSEQIDNO.1;⑹将SEQIDNO.1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和或缺失和或添加且具有与SEQIDNO.1具有相同的促进免疫活性功能的衍生序列。2.编码如权利要求1所述的蛋白质的核酸分子。3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，其碱基序列如SEQIDNO.2所示。4.一种载体，其特征在于，其含有权利要求2-3任一项所述的核酸分子。5.—种重组细胞，其特征在于，其含有如权利要求4所述的载体。6.如权利要求1所述的蛋白质、如权利要求2或3所述的核酸分子、如权利要求4所述的载体、或如权利要求5所述的重组细胞在制备猪用疫苗免疫增强剂中的应用。7.—种猪用疫苗免疫增强剂，其特征在于，其包括:如权利要求1所述的蛋白质或如权利要求5所述的重组细胞。8.—种如权利要求1所述的蛋白质的制备方法，其特征在于，包括如下步骤:培养如权利要求5所述的重组细胞，从培养产物中分离、纯化得到所述蛋白质。9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述重组细胞为大肠杆菌。10.—种猪用疫苗，其特征在于，其包括如权利要求1所述的蛋白质。

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