申请/专利权人：贵州威门药业股份有限公司

申请日：2017-12-27

公开（公告）日：2020-07-28

公开（公告）号：CN107870216B

主分类号：G01N30/02(20060101)

分类号：G01N30/02(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.28#授权;2018.05.01#实质审查的生效;2018.04.03#公开

摘要：本发明涉及头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法。具体的，包括以下步骤：材料提供，药物提取与分离，UPLC分析与质谱分析，最低抑菌浓度的测定，头花蓼不同极性部位各峰与1MIC之间的偏最小二乘回归分析。本发明通过UPLC‑TOF‑MS质谱联用技术能够全面的分析确定头花蓼不同极性部位的化学成分并结合药效试验，采用PLSR法分析筛选、确定头花蓼中的抑菌物质，从分子化学水平阐明头花蓼在治疗大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌尿路感染药效物质基础。

主权项：1.头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析的方法，其包括以下步骤：1材料提供：提供超高效液相色谱系统和液相色谱-质谱联用仪，提供头花蓼药材，提供抑菌检测用菌株；2药物提取与分离：21取头花蓼药材加6~8倍量60~80%乙醇提取2次，每次1~2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花蓼醇提浸膏；所述60~80%乙醇中添加了0.05%硫代甘油和0.002%冰乙酸；22另取头花蓼醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用20~40%甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离；23分别用体积分数为30%、35%~40%、40%、40%~50%、50%、60%、60%~80%的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A~G共七个不同极性的部位；24精确称取A~G七个部位，分别溶于DMSO中，配成质量浓度为25mgmL的溶液，备用；3UPLC分析与质谱分析：31色谱及质谱条件：色谱条件：C18色谱柱，柱温40℃，流速0.35Lmin，进样量2μL，流动相使用流动相A和流动相B进行梯度洗脱，流动相A为0.1%甲酸水溶液、流动相B为0.1%甲酸乙腈溶液；所述梯度洗脱的洗脱程序为：0~0.5min，95%流动相A；0.5~20min，95%流动相A→81.5%流动相A；20~30min，81.5%流动相A→95%流动相A；30~32min，95%流动相A；质谱条件：电喷雾离子源，干燥气体温度180℃，毛细管电压4500eV，负离子检测模式，喷雾压力0.25MPa，干燥气氮气流速8Lmin，扫描范围mz100~2000，碰撞能量10eV；32不同极性部位指纹图谱建立：按“31色谱及质谱条件”项下条件建立不同极性部位的UHPLC-TOF-MS色谱图，并通过质谱确定不同极性部位各峰对应的化合物，从而确定各个部位中的主要化学组成；4最低抑菌浓度的测定：41按最低抑菌浓度测定方法，进行菌悬液的配制和实验用琼脂平板培养基的制备；42按最低抑菌浓度测定方法，测定步骤24所得不同极性部位的最低抑菌浓度；5头花蓼不同极性部位各峰与1MIC之间的偏最小二乘回归分析：对于每一个部位，使用SPSS16.0软件的偏最小二乘回归分析法通过其均值化进行分析，以其各物质峰的峰面积作为自变量，1MIC作为因变量，分析得到各物质峰与药效指标之间的关系，确定与试验菌株成正相关的物质峰以及这些物质所存在的部位。

全文数据：头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法技术领域[0001]本发明属于医药技术领域，具体涉及头花寥的药物分析方法，更具体涉及头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法。本发明方法能够为头花寥的深度开发打下坚实基础。背景技术[0002]头花寥PolygonumcapitatumBuch-HamexD·Don为寥科寥属多年生草本植物。具有清热利湿、利尿通淋之功效，在临床上治疗泌尿系统感染有着显著的效果。以其为原料制成的中成药制剂“热淋清颗粒”2002年进入国家基本药物目录，2004年进入国家基本医疗保险目录。[0003]头花寥是少数民族地区的常用药，主要用于肾盂肾炎、尿道感染、利尿通淋等症。相关的药理学研究少见，目前仅有任光友等几篇报道。任光友采用大鼠细菌性肾盂肾炎模型进行实验，结果头花寥水提取物组大鼠尿液中的WBC和BLD与对照组比较明显减少，显示头花寥水提物对肾盂肾炎具有一定的抗炎作用。任光友等以小鼠腹腔注射大肠杆菌菌液观察5天内小鼠死亡情况，结果对照组死亡率为100%，头花寥组死亡率分别为20%和50%，显示头花寥水提物能够对抗大肠杆菌引起的感染。任光友等以头花寥水提物灌胃给药予家兔，结果，头花寥水提物组与对照组比较，体温无显著性差异，但能降低静脉注射伤寒副伤寒菌苗引起的家兔的发热体温。任光友等，以头花寥水提物分别灌胃给药家兔、大鼠，与空白组和速尿对照组比较尿量。结果显示头花寥水提物对家兔和大鼠无明显利尿作用。徐英春等人采用琼脂稀释法检测了头花寥对10株淋病奈瑟球菌淋球菌的体外抑菌活性，结果头花寥对淋球菌有抑菌活性。其对10株淋球菌的最小抑菌浓度范围为8〜32gL，平均值为11.2gL〇[0004]中国专利申请公开说明书CN1054899A中国专利申请号90107810.7，公开日1991年10月2日）中公开了一种泌感灵冲剂、糖浆生产工艺。该生产工艺是以四季草为原料用水煎煮30-60分钟，提取液过滤浓缩，将其上清液减压浓缩成膏，再用60-70%乙醇提取，将乙醇提取液真空干燥，得四季红浸膏，进一步配制成冲剂或糖浆剂，据信该具有解毒、散瘀、利尿、通淋的功效。[0005]中华人民共和国卫生部药典委员会1998年编的中华人民共和国卫生部《药品标准一中药成方制剂》第十七册）中收载了名为“热淋清颗粒”的中成药制剂，其是通过将头花寥加水煎煮两次后过滤浓缩制成的。[0006]CN1481832A中国专利申请号02129686.3,公开日2004年3月17日）和CN1483466A中国专利申请号03146381.9，公开日2004年3月24日）公开了头花寥提取物，其基本上是由以下步骤制备的:a.由头花寥全草的鲜品或干品用水分两次煎煮或者用醇水混合物分二至三次回流提取，每次1-2小时，合并煎煮液，过滤浓缩至20°C时的相对密度为1.2，喷雾干燥或减压干燥得到；或者，b.由头花寥全草及其水提药渣经二氧化碳超临界萃取得至IJ。据信此提取物可用于抗菌、抗炎、镇痛、利尿、治疗泌尿系统结石、治疗肾盂肾炎以及前列腺炎。[0007]尽管头花寥制剂在临床上已有广泛应用，然而其各种有效部位的药效学研究仍然是有深入开展的必要的，例如头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析，仍然是指导头花寥制剂临床应用的必要手段，建立头花寥提取物中分离纯化的有效部位的指纹图谱，阐明不同部位所有峰代表的化学成分对抑菌效果的贡献值，揭示头花寥抑菌的药效物质基础，仍然是本领域技术人员迫切期待的。发明内容[0008]本发明的目的在于，对头花寥的各种有效部位的药效学研究，例如对头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析，用以指导头花寥制剂临床应用，建立头花寥提取物中分离纯化的有效部位的指纹图谱，阐明不同部位所有峰代表的化学成分对抑菌效果的贡献值，揭示头花寥抑菌的药效物质基础。通过本发明方法，出人意料的发现，已经获知头花寥对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌的主要抑菌活性部位是A、B、C、D四个强极性部位，其主要抑菌成分是6-没食子酸酰葡萄糖、3,6_二没食子酸酰葡萄糖、1，3,6_三没食子酸酰葡萄糖和davidiin。本发明基于此发现而得以完成。[0009]为此，在本发明的一个方面，提供了一种头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析的方法，其包括以下步骤：[00Ί0]⑴材料提供：[0011]提供超高效液相色谱系统和液相色谱-质谱联用仪，提供头花寥药材，提供抑菌检测用菌株；[0012]2药物提取与分离：[0013]21取头花寥药材加6〜8倍量60〜80%乙醇提取2次，每次1〜2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥醇提浸膏；[0014]22另取头花寥醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用20〜40%甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离；[0015]23分别用体积分数为30%、35%〜40%、40%、40%〜50%、50%、60%、60%〜80%的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A〜G共七个不同极性的部位；[0016]24精确称取A〜G七个部位，分别溶于DMSO中，配成质量浓度为25mgmL的溶液，备用；[0017]3UPLC分析与质谱分析：[0018]31色谱及质谱条件：[0019]色谱条件:C18色谱柱，柱温40°C，流速0.35Lmin，进样量2yL，流动相使用0.1%甲酸水溶液㈧-〇.1%甲酸乙腈溶液⑻进行梯度洗脱；[0020]质谱条件：电喷雾离子源ESI，干燥气体温度180°C，毛细管电压4500eV，负离子检测模式，喷雾压力〇.25MPa，干燥气N2流速8Lmin，扫描范围mz100〜2000,碰撞能量10eV；[0021]32不同极性部位指纹图谱建立：[0022]按“31色谱及质谱条件”项下条件建立不同极性部位的UHPLC-T0F-MS色谱图，并通过质谱确定不同极性部位各峰对应的化合物，从而确定各个部位中的主要化学组成；[0023]⑷最低抑菌浓度的测定：[0024]41按最低抑菌浓度测定方法，进行菌悬液的配制和实验用琼脂平板培养基的制备；[0025]42按最低抑菌浓度测定方法，测定步骤（24所得不同极性部位的最低抑菌浓度；[0026]5头花寥不同极性部位各峰与1MIC之间的偏最小二乘回归分析：[0027]对于每一个部位，使用SPSS16.0软件的偏最小二乘回归分析法PLSR通过其均值化进行分析，以其各物质峰的峰面积作为自变量，1MIC作为因变量，分析得到各物质峰与药效指标之间的关系，确定与试验菌株成正相关的物质峰以及这些物质所存在的部位。[0028]在本发明方法的一个实施方案中，所述超高效液相色谱系统是1290Infinity型超效高液相色谱系统。在一个实施方案中，所述液相色谱-质谱联用仪是Agilent公司的TOFLCMS联用仪。在一个实施方案中，所述头花寥药材是采自贵州的头花寥。在一个实施方案中，所述抑菌检测用菌株包括但不限于大肠埃希菌、铜绿假单胞菌。[0029]在本发明方法的一个实施方案中，其中步骤21中，取头花寥药材加7倍量70%乙醇提取2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，并回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20〜1.2560°C的稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥70%醇提浸膏。在本发明方法的一个实施方案中，其中步骤21中，取头花寥药材所用乙醇溶液中添加了0.05%硫代甘油和0.002%冰乙酸。[0030]在本发明方法的一个实施方案中，其中步骤22中，取头花寥70%醇提浸膏样品45g，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心5min3000rpm，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用30%甲醇溶解载入MCI型大孔树脂柱（IBV=IL层析分离。[0031]在本发明方法的一个实施方案中，其中步骤23中，分别用体积分数为30%、35%〜40%、40%、40%〜50%、50%、60%、60%〜80%的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A〜G共七个部位。[0032]在本发明方法的一个实施方案中，其中步骤（24中，精确称取A〜G七个部位各25.OOmg溶于ImL的DMSO中，配成质量浓度为25mgmL的溶液。[0033]在本发明方法的一个实施方案中，其中所述色谱柱是ACQUITYBEHC18色谱柱，其规格是2·ImmX100mm,1·7μηι〇[0034]在本发明方法的一个实施方案中，其中所述梯度洗脱的洗脱程序为:0〜0.5min，95%A，0.5〜20min，95%A481.5%A;20〜30min，81.5%A—95%A;30〜32min，95%A。[0035]在本发明方法的一个实施方案中，其中所述菌悬液的配制的操作过程为:实验用菌种首先接种于平板上，在37°C恒温恒湿培养箱中培养24h;挑选特征菌种接于液体培养基中，于37°C条件下，振摇24h;采用麦氏比浊法将其稀释至0.5麦氏浓度，即得KT6-1T8CFUmL菌悬液，备用。[0036]在本发明方法的一个实施方案中，其中所述实验用琼脂平板培养基的制备过程为：向IL营养肉汤培养基中加入20g纯化琼脂粉，加入IL双蒸水并调节PH=7.4;于121°C条件下，灭菌30min后取出；待培养基冷却至45°C左右时，在超净工作台上将培养基倒入无菌培养皿中冷凝，即得实验用琼脂平板培养基。[0037]在本发明方法的一个实施方案中，测定不同极性部位的最低抑菌浓度的过程为：在超净工作台上，先向无菌的96孔板每孔中加入50yL液体培养基和50yL的菌悬液，将待测药物用移液枪精确量取IOOyL加入到96孔板中的第一孔混匀，并吸取IOOyL移至第二孔混匀，以此类推至最后一孔混匀吸取IOOyL弃掉，使每孔保持IOOyL;以硫酸庆大霉素为阳性对照，DMSO为阴性对照；37°C培养24h，分别转种至琼脂平板培养基，24h后无细菌生长的微孔中药物的浓度则为最低抑菌浓度。[0038]在本发明上述方法的步骤中，虽然其描述的具体步骤在某些细节上或者语言描述上与下文具体实施方式部分的制备例中所描述的步骤有所区别，然而，本领域技术人员根据本发明全文的详细公开完全可以概括出以上所述方法步骤。[0039]本发明的任一方面的任一实施方案，可以与其它实施方案进行组合，只要它们不会出现矛盾。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，任一技术特征可以适用于其它实施方案中的该技术特征，只要它们不会出现矛盾。下面对本发明作进一步的描述。[0040]本发明所引述的所有文献，它们的全部内容通过引用并入本文，并且如果这些文献所表达的含义与本发明不一致时，以本发明的表述为准。此外，本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义，即便如此，本发明仍然希望在此对这些术语和短语作更详尽的说明和解释，提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。[0041]本发明的目的在于建立头花寥提取干膏中分离纯化的若干个有效部位的指纹图谱，阐明不同部位所有峰代表的化学成分对抑菌效果的贡献值，揭示头花寥抑菌的药效物质基础。本发明采用UPLC-T0F-MS建立头花寥不同极性部位的指纹图谱，并对各峰进行化学成分分析，通过96孔板法测得各头花寥不同极性部位对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌的最低抑菌浓度MIC，利用偏最小二乘回归分析法PLSR建立头花寥指纹图谱与抑菌作用的谱效关系。结果显示，本发明建立了头花寥不同极性部位指纹图谱，并通过谱效学关系分析确定了头花寥对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌抑菌效果成正相关的峰分别是9个和13个，其主要抑菌成分为1〜5和15、19所代表的化合物。本发明的研究结果表明，头花寥对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌的主要抑菌活性部位是A、B、C、D四个强极性部位，其主要抑菌成分是6-没食子酸酰葡萄糖、3,6_二没食子酸酰葡萄糖、1，3,6_三没食子酸酰葡萄糖和davidiin。本发明研究结果为深入研究头花寥的抑菌机制奠定了基础。[0042]头花寥Polygonumcapitatum为寥科Polygonace-ae寥属PoIygonum多年生草本植物，其主要分布于江西、湖北、广西、四川、贵州、云南和西藏地区（王洪平，曹芳，杨秀伟.头花寥地上部分的化学成分研究[J].中草药，2013，441:24-30.。以全草入药，具有清热利湿、利尿通淋、活血止痛的功效，是贵州苗族地区的常用药材，并收入了2003版贵州省地方标准，贵州威门药业股份有限公司的以头花寥为原料的单方制剂“热淋清颗粒”在治疗大肠埃希菌等细菌引起的泌尿系统感染疗效显著，且作者在前期研究发现头花寥对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌有较好的抑制作用，且目前文献报道中主要是针对头花寥的化学成分及其含量进行研究分析潘雯婷，张丽艳，谢宇，等.主成分及聚类分析法对不同产地头花寥的综合质量评价[J].中国实验方剂学杂志，2012，1810:153-157，此外还发现有以标准品比对法探究其抑菌成分其分析结果仍然不明确胡露，张锦，蔺良才，等.基于谱效关系的头花寥抑菌作用物质基础研究[J].中药材，2016,399:2037-2040。[0043]本发明实验通过UPLC-T0F-MS质谱联用技术能够全面的分析确定头花寥不同极性部位的化学成分并结合药效试验，最后采用PLSR法分析筛选、确定头花寥中的抑菌物质，从分子化学水平阐明头花寥在治疗大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌尿路感染药效物质基础。本发明采用的PLSR法是一种集多元线性回归、主成分分析和典型相关分析的优点于一身，可以较好的揭示各色谱峰与药效指标之间的相关性相美容，王孝霞，孙启慧，等.细辛不同极性部位HPLC指纹图谱与其镇痛抗炎活性的谱效关系研究[J].辽宁中医杂志，2016，4312:2603-2607;吕邵娃，董书羽，郭玉岩，等.数据分析技术在中药谱效关系中的应用进展[J].中国实验方剂学杂志，2015,2115:226-230。同时作者认为对于成分复杂且有效成分不确定的中药而言，采用合适的评价方法分析中药谱效关系以便确定其有效成分，同时也可为头花寥替代抗生素的应用提供研究基础。附图说明[0044]图1:头花寥不同极性部位UHPLC。具体实施方式[0045]通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。[0046]实施例1:头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法[0047]1、材料[0048]1290Infinity型超效高液相色谱系统和6230型TOFLCMS联用仪美国Agilent公司），HWS-150型恒温培养箱北京科伟永兴仪器有限公司）。[0049]头花寥，采自贵州水城，经贵阳中医学院药用植物栽培与鉴定教研室魏升华教授鉴定为寥科寥属植物头花寥Polygonumcapitatum的干燥全草。[0050]大肠埃希菌CMCC44102批号44102-3a24-2和铜绿假单胞菌CMCC10104批号10104-2a21_l购于中国食品药品检定研究院。[0051]MCI型大孔树脂柱（日本三菱化学公司），营养肉汤培养基（上海博微科技有限公司，批号3103627，营养琼脂上海博微科技有限公司，批号160825，二甲基亚砜DMSOjk京索莱宝科技有限公司，批号520C0314，甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯，其他试剂均为分析纯。[0052]2、方法与结果[0053]2.1、药物提取与分离[0054]取头花寥药材加7倍量70%乙醇（内加0.05%硫代甘油和0.002%冰乙酸）提取2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，并回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20〜1.2560°C的稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥70%醇提浸膏；[0055]另取头花寥70%醇提浸膏样品45g，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心5min3000rpm，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用30%甲醇溶解载入MCI型大孔树脂柱（1BV=IL层析分离；[0056]分别用体积分数为30%、35%〜40%、40%、40%〜50%、50%、60%、60%〜80%的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A〜G共7个部位；[0057]精确称取A〜G各25.OOmg溶于ImL的DMSO中，配成质量浓度为25mgmL的溶液，备用。[0058]2.2、头花寥不同部位的UPLC分析与质谱分析[0059]2.2.1、色谱及质谱条件[0060]ACQUITYBEHCi8色谱柱（2.1mmX100mm，1.7ym，柱温40°C，流速0.35Lmin，进样量2yL，流动相0.1%甲酸水溶液A-0.1%甲酸乙腈溶液⑻梯度洗脱0〜0.5min，95%A，0.5〜20min，95%A481.5%A;20〜30min，81.5%A—95%A;30〜32min，95%A。[0061]质谱条件为电喷雾离子源ESI，干燥气体温度180°C，毛细管电压4500eV，负离子检测模式，喷雾压力〇.25MPa，干燥气N2流速8Lmin，扫描范围mz100〜2000，碰撞能量IOeV0[0062]2.2.2、不同极性部位指纹图谱建立[0063]按2.2.1项下条件建立不同极性部位的UHPLC-T0F-MS色谱图；结果见图1和表1;并通过质谱确定不同极性部位各峰对应的化合物，结果见表2。[0064]表1:不同极性部位所含化合物及其峰面积[0065][0067]表2:不同极性部位所有化合物的质谱分析数据[0068][0069][0070]由表1与图1中可以明显的看到，由甲醇分离得到的七个极性部位分离的较为彻底，且不同极性部位的主成分也得到了有效富集，特别是D部位首次分离得到的davidiin其纯度达到90%以上。[0071]由表2中的质谱分析得到各峰分子式及其二级质谱数据，因此可以确定头花寥中的化学组成，同时也可以分析得到各部位的主要成分，A主要为二没食子酰可水解鞣质;B主要为三没食子酰可水解鞣质;C主要为三没食子酰可水解鞣质及原花青素类成分;D90%以上是可水解鞣质davidiin;E主要含有黄酮苷及木脂素类成分;F主要含有黄酮苷类成分，特别是黄酮C-苷类成分;G主要含有黄酮单糖苷及苷元类成分。[0072]如上文所述，在郃位E中，主要物质成分是20号的撇皮素-3-0-B-D-卩比喃匍糖苷，其保留时间约为10.48min。本发明人在试验中发现，本试验对头花寥药材进行醇提浸膏的提取过程中向提取液即乙醇溶液中加入微量硫代甘油和冰乙酸时，所得部位E呈现20号物质的显著富集。但是，在补充的试验中而当提取液中（a不添加硫代甘油、⑹不添加冰乙酸、或者c硫代甘油冰乙酸二者均不添加时，（a〜c三种情形分别得到的七个部位，照本实施例1的方法进行试验，显示三种情形所得A、B、C、D、F、G六者在图1、表1、表2方式所提供的图谱和数据中与本实施列1上述图1、表1、表2中的结果基本一致，例如三种情形所得D部位在表1表征的数据中8号峰与19号峰的峰面积分别在59730〜60825范围内以及在1382340〜1385630范围内；但是未同时添加硫代甘油和冰乙酸的三种情形所得部位E中20号物质量显著减少，例如三种情形所得E部位在表1表征的数据中20号峰的峰面积在22730〜26825范围内，仅有同时添加上述两种物质时20号峰峰面积的11%左右，并且此时20号峰在图1之E中的保留时间仍然在10.48min处。这一结果表明，仅有在头花寥药材提取溶剂中同时添加硫代甘油和冰乙酸时，部位E才能有效富集20号物质。[0073]2.3、MIC测定[0074]2.3.1、菌悬液配制与平板制备[0075]实验用菌种首先接种于平板上，在37°C恒温恒湿培养箱中培养24h。挑选特征菌种接于液体培养基中，于37°C条件下，振摇24h。采用麦氏比浊法将其稀释至0.5麦氏浓度，即lT6-lT8CFUmL菌悬液备用；向IL营养肉汤培养基中加入20g纯化琼脂粉，加入IL双蒸水并调节PH=7.4。于121°C条件下，灭菌30min后取出。待培养基冷却至45°C左右时，在超净工作台将培养基倒入无菌培养皿中冷凝，即得实验用琼脂平板培养基。[0076]2.3.2MIC测定[0077]在超净工作台先向无菌的96孔板中每孔中加入50yL液体培养基和50yL的菌悬液，将待测药物用移液枪精确量取IOOyL加入到96孔板中的第一孔混匀，并吸取IOOyL移至第二孔混匀，以此类推至最后一孔混匀吸取IOOyL弃掉，使每孔保持100yL。即得浓度为12.5〜0.012mgmL;以硫酸庆大霉素为阳性对照，DMSO为阴性对照;37°C培养24h，分别转种至琼脂平板培养基，24h后无细菌生长的微孔则为药物最低抑菌浓度MIC试验方法可参考：胡露，张锦，蔺良才，等.基于谱效关系的头花寥抑菌作用物质基础研究[J].中药材，2016，39⑼：2037-2040，见表3。结果显示各部位对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌抑菌效果分别为ABC=D=FE=G；B=C=DA=F=GE〇[0078]表3:不同极性部位对大肠埃希菌、铜绿假单胞菌的MICgL[0079][0080]2.4:头花寥不同组分各峰与1MIC的PLSR分析[0081]采用SPSS16.0软件的PLSR通过其均值化进行分析，以其各峰峰面积作为自变量，1MIC作为因变量分析得到各峰与药效指标之间的关系结果，见表4。从表4中可以得到与大肠埃希菌抑菌效果成正相关的峰有9个，主要存在A部位，其中贡献较大的峰是1-5号峰;对铜绿假单胞杆菌抑菌效果成正相关的峰有13个，主要集中存在B、C、D部位，贡献较大的峰是19、15号峰。结合质谱分析结果可以得到6-没食子酸酰葡萄糖和3，6_二没食子酸酰葡萄糖对大肠埃希菌的贡献值最大；1，3，6-三没食子酸酰葡萄糖和davidiin对铜绿假单胞杆菌的贡献值较大。[0082]表4:各峰与大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌的偏相关系数[0083][0084][0085]实施例2:头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法[0086]基本上参照实施例1进行，不同的是:在步骤21中，取头花寥药材加8倍量60%乙醇提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥醇提浸膏;在步骤22中：取头花寥醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用40%甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离。[0087]实施例3:头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法[0088]基本上参照实施例1进行，不同的是:在步骤21中，取头花寥药材加6倍量80%乙醇提取2次，每次2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥醇提浸膏;在步骤22中：取头花寥醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用20%甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离。[0089]实施例4:头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法[0090]基本上参照实施例1进行，不同的是:在步骤21中，取头花寥药材加7倍量75%乙醇提取2次，每次1小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥醇提浸膏;在步骤22中：取头花寥醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用30%甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离。[0091]以上实施例2至实施例4三个实例各得三批A、B、C、D、E、F、G不同极性部分，三批七个部位分别在图1、表1、表2、表3、表4方式所提供的图谱和数据中与实施列1的图1、表1、表2、表3、表4中的结果基本一致，例如所得D部位在表1表征的数据中8号峰与19号峰的峰面积分别在59160〜60786范围内以及在1381825〜1385743范围内。[0092]本发明研究中通过UHPLC-T0F-MS和液体稀释法得到头花寥不同极性部位指纹图谱与对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌的抑菌效果，并采用PLSR法揭示头花寥不同极性部位各化学成分对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌的谱效关系分析，从而得到不同极性部位各峰与抑菌的相关性，由谱效分析结果显示，头花寥的抑菌活性贡献较大的峰存在于A、B、C、D等极性较大部位，同时也确定了头花寥对大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌抑菌作用中其主要作用物质为极性强的1-5和15、19所代表的化合物6-没食子酸酰葡萄糖、3,6_二没食子酸酰葡萄糖、1，3,6_三没食子酸酰葡萄糖和davidiin四种化合物及其同分异构体）。本发明通过质谱联用技术明确了头花寥中化学成分及其量的关系结合药效试验并通过PLSR法得到峰面积与1MIC的简单相关系数矩阵，其相关性越大对药效指标的贡献越大，其中首次分离得到的davidiin化合物在对铜绿假单胞杆菌的抑制作用贡献最大;通过本发明明确的得到头花寥及其制剂在临床上治疗大肠埃希菌、铜绿假单胞杆菌等引起的尿路感染的主要有效成分，也为其质量标准提供相关的依据与指导。

权利要求：1.头花寥不同极性部位抑菌作用的谱效学分析的方法，其包括以下步骤：1材料提供:提供超高效液相色谱系统和液相色谱-质谱联用仪，提供头花寥药材，提供抑菌检测用菌株；⑵药物提取与分离：21取头花寥药材加6〜8倍量60〜80%乙醇提取2次，每次1〜2小时，滤过，合并滤液，回收乙醇并浓缩成稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥醇提浸膏；22另取头花寥醇提浸膏样品，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用20〜40%甲醇溶解后，载入MCI型大孔树脂柱，进行层析分离；23分别用体积分数为30%、35%〜40%、40%、40%〜50%、50%、60%、60%〜80%的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A〜G共七个不同极性的部位；24精确称取A〜G七个部位，分别溶于DMSO中，配成质量浓度为25mgmL的溶液，备用；⑶UPLC分析与质谱分析：31色谱及质谱条件：色谱条件:C18色谱柱，柱温40°C，流速0.35Lmin，进样量2yL，流动相使用0.1%甲酸水溶液㈧-〇.1%甲酸乙腈溶液⑻进行梯度洗脱；质谱条件：电喷雾离子源ESI，干燥气体温度180°C，毛细管电压4500eV，负离子检测模式，喷雾压力〇.25MPa，干燥气（N2流速8Lmin，扫描范围mz100〜2000,碰撞能量10eV；32不同极性部位指纹图谱建立:按“31色谱及质谱条件”项下条件建立不同极性部位的UHPLC-T0F-MS色谱图，并通过质谱确定不同极性部位各峰对应的化合物，从而确定各个部位中的主要化学组成；⑷最低抑菌浓度的测定：41按最低抑菌浓度测定方法，进行菌悬液的配制和实验用琼脂平板培养基的制备；42按最低抑菌浓度测定方法，测定步骤24所得不同极性部位的最低抑菌浓度；5头花寥不同极性部位各峰与1MIC之间的偏最小二乘回归分析:对于每一个部位，使用SPSS16.0软件的偏最小二乘回归分析法PLSR通过其均值化进行分析，以其各物质峰的峰面积作为自变量，IMIC作为因变量，分析得到各物质峰与药效指标之间的关系，确定与试验菌株成正相关的物质峰以及这些物质所存在的部位。2.根据权利要求1的方法，所述超高效液相色谱系统是1290Infinity型超效高液相色谱系统。3.根据权利要求1的方法，所述液相色谱-质谱联用仪是Agilent公司的TOFLCMS联用仪。4.根据权利要求1的方法，所述头花寥药材是采自贵州的头花寥。5.根据权利要求1的方法，所述抑菌检测用菌株包括但不限于大肠埃希菌、铜绿假单胞菌。6.根据权利要求1的方法，其中步骤21中，取头花寥药材加7倍量70%乙醇提取2次，每次1.5h，滤过，合并滤液，并回收乙醇并浓缩至相对密度为1.20〜1.2560°C的稠膏，减压干燥、粉碎成细粉，即得头花寥70%醇提浸膏；例如其中步骤21中，取头花寥药材所用乙醇溶液中添加了〇.05%硫代甘油和0.002%冰乙酸。7.根据权利要求1的方法，其中步骤22中，取头花寥70%醇提浸膏样品45g，加甲醇适量，超声提取3次，滤液合并，离心5min3000rpm，取上清液减压蒸馏除去溶剂，用30%甲醇溶解载入MCI型大孔树脂柱（IBV=IL层析分离。8.根据权利要求1的方法，其中步骤（23中，分别用体积分数为30%、35%〜40%、40%、40%〜50%、50%、60%、60%〜80%的甲醇进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液，并挥干，得到A〜G共七个部位。9.根据权利要求1的方法，在本发明方法的一个实施方案中，其中步骤24中，精确称取A〜G七个部位各25.OOmg溶于ImL的DMSO中，配成质量浓度为25mgmL的溶液。1〇.根据权利要求1的方法，其中：所述色谱柱是ACQUITYBEHCi8色谱柱，其规格是2.ImmX100mm，1.7μπι;所述梯度洗脱的洗脱程序为：〇〜〇.5min，95%A，0.5〜20min，95%A481.5%A;20〜30min，81.5%A—95%A;30〜32min，95%A;所述菌悬液的配制的操作过程为:实验用菌种首先接种于平板上，在37°C恒温恒湿培养箱中培养24h;挑选特征菌种接于液体培养基中，于37°C条件下，振摇24h;采用麦氏比浊法将其稀释至0.5麦氏浓度，即得lT6-lT8CFUmL菌悬液，备用；所述实验用琼脂平板培养基的制备过程为：向IL营养肉汤培养基中加入20g纯化琼脂粉，加入IL双蒸水并调节PH=7.4;于121°C条件下，灭菌30min后取出；待培养基冷却至45°C左右时，在超净工作台上将培养基倒入无菌培养皿中冷凝，即得实验用琼脂平板培养基；和或测定不同极性部位的最低抑菌浓度的过程为:在超净工作台上，先向无菌的96孔板每孔中加入50yL液体培养基和50yL的菌悬液，将待测药物用移液枪精确量取IOOyL加入到96孔板中的第一孔混匀，并吸取IOOyL移至第二孔混匀，以此类推至最后一孔混匀吸取IOOyL弃掉，使每孔保持IOOwL;以硫酸庆大霉素为阳性对照，DMSO为阴性对照;37°C培养24h，分别转种至琼脂平板培养基，24h后无细菌生长的微孔中药物的浓度则为最低抑菌浓度。

百度查询： 贵州威门药业股份有限公司 头花蓼不同极性部位抑菌作用的谱效学分析方法

免责声明
1、本报告根据公开、合法渠道获得相关数据和信息，力求客观、公正，但并不保证数据的最终完整性和准确性。
2、报告中的分析和结论仅反映本公司于发布本报告当日的职业理解，仅供参考使用，不能作为本公司承担任何法律责任的依据或者凭证。

阅读全文 双屏查看 官方信息 专利公告 收藏专利 下载PDF 下载WORD