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【发明授权】一种高胞内灵芝三萜含量的灵芝菌丝体发酵工艺_华中农业大学_201611180585.5 

申请/专利权人:华中农业大学

申请日:2016-12-20

公开(公告)日:2020-07-31

公开(公告)号:CN106497802B

主分类号:C12N1/14(20060101)

分类号:C12N1/14(20060101);C12R1/645(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.07.31#授权;2017.04.12#实质审查的生效;2017.03.15#公开

摘要:本发明公开了一种灵芝菌丝体发酵工艺,包括以下步骤:灵芝菌丝体种子培养阶段以及扩大培养阶段;所述扩大培养阶段持续5至7天;其中每天配合变温环境对灵芝菌丝体进行光照处理,具体如下:在光照条件下培养4小时至16小时,在变温条件下培养1至3小时,所述变温条件为避光且维持高温或低温。本发明由于结合光照和变温处理,实现了灵芝胞内三萜含量的高水平积累,能够在无需添加任何有害外源物质的前提下,廉价、安全、易操作,可显著提高胞内灵芝三萜含量,适用于工业化生产灵芝三萜。

主权项:1.一种灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,包括以下步骤:灵芝菌丝体种子培养阶段以及扩大培养阶段;所述扩大培养阶段持续5至7天;其中每天配合变温环境对灵芝菌丝体进行光照处理进行循环培养,具体如下:在常温光照条件下培养4小时至16小时,在变温条件下培养1至3小时,所述变温条件为避光且维持高温或低温,其他时间进行25℃至28℃避光条件下培养;所述高温在32℃至36℃之间,所述低温为8℃。

全文数据:一种高胞内灵芝三萜含量的灵芝菌丝体发酵工艺技术领域[0001]本发明属于生物技术领域,更具体地,涉及一种高胞内灵芝三萜含量的灵芝菌丝体发酵工艺。背景技术[0002]灵芝三萜是在灵芝中发现的一类三萜类化合物,也就是说灵芝三萜是灵芝的主要化学和药效成分。灵芝中所含灵芝三萜具有特别显著的生理活性。在高度竞争的社会中,过度紧张的工作,生活方式的改变或因环境污染,导致对人体健康的严重损害,灵芝三萜有巨大的应用价值。[0003]对灵芝生理生化过程的研究表明,三萜类化合物(灵芝酸)属于灵芝的二级代谢物。在灵芝生理生态和生活史研究中发现,菌丝体由一次菌丝、二次菌丝到三次菌丝后,才能纽结产生子实体。菌丝体期间只能累积足够的三萜类化合物灵芝酸)的前结构物质,而后才能出菇(即由无性繁殖转为有性繁殖),而产生子实体。在子实体的成熟过程中,三萜类物质才得以生物化合完善,成为具有生理活性的三萜类成分。可以说:灵芝三萜类是灵芝菌丝体一、二级代谢产物。所以,凡是灵芝菌丝体发酵制成的产品,由于没有经过子实体后期一一成熟过程,三萜类化合物含量几乎没有或非常非常微小。然而子实体人工大量繁殖难度较大,因此工业上量产灵芝三萜的主要问题是如何提高灵芝菌丝体液体发酵的胞内灵芝三萜含量。[0004]然而灵芝子实体培养难以大规模生产,因此开发经济、安全、容易提取、纯化从而适应工业化大规模生产的灵芝菌丝体发酵工艺,具有重要意义。发明内容[0005]针对现有技术的以上缺陷或改进需求,本发明提供了一种灵芝菌丝体发酵工艺,其目的在于采用变温控制和光照处理相结合的刺激,提高灵芝菌丝体胞内灵芝三萜含量,由此解决现有的灵芝三萜生产工艺中灵芝菌丝体发酵胞内灵芝三萜含量低、难以提取纯化、不适应大规模生产的技术问题。[0006]为实现上述目的,按照本发明的一个方面,提供了一种灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,包括以下步骤:[0007]灵芝菌丝体种子培养阶段以及扩大培养阶段;[0008]所述扩大培养阶段持续5至7天;其中每天配合变温环境对灵芝菌丝体进行光照处理,具体如下:[0009]在光照条件下培养4小时至16小时,在变温条件下培养1至3小时,所述变温条件为避光且维持高温或低温。[0010]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述高温在32°C至36°C之间;所述低温在6°:至10°:之间。[0011]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述扩大培养阶段第三天至结束,采用添加有诱导剂的培养基进行培养。[0012]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述诱导剂为木材降解物。[0013]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述诱导剂为D-半乳糖。[0014]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述扩大培养阶段采用CYM培养基。[0015]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述CYM培养基每升含有:葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克。[0016]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述扩大培养阶段第三天至结束,采用的CYM培养基含有质量份数0.25%至1%的D-半乳糖。[0017]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述种子培养阶段采用多级种子发酵培养。[0018]优选地,所述灵芝菌丝体发酵工艺,其所述多级种子发酵培养具体步骤如下:[0019]1采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养5至7天,获得一级种子液;[0020]2将步骤(1中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5,接种于第一灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养5天,获得二级种子液;[0021]3将步骤2中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10,接种于第二灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养2天,获得三级种子液。[0022]⑷将步骤⑶中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10,接种于CYM培养基中,28°:至30°:,摇床转速120-15^1^11培养1天,获得灵芝菌丝体液体发酵体系。[0023]总体而言,通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比,实现了灵芝胞内三萜含量的高水平积累,能够在无需添加任何有害外源物质的前提下,廉价、安全、易操作,可显著提高胞内灵芝三萜含量,适用于工业化生产灵芝三萜。同时本方法为菌丝体培养,相对于其他灵芝三萜生产方法,本工艺适合大规模生产,同时提纯方便,适合工业化生产。[0024]优选方案,结合诱导剂,进一步提高了灵芝菌丝体胞内灵芝三萜的含量。附图说明[0025]图1是本发明提供的实施例1效果图;[0026]图2是本发明提供的实施例2效果图。具体实施方式[0027]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白,以下结合附图及实施例,对本发明进行进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。此外,下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。[0028]本发明提供的灵芝菌丝体发酵工艺,包括:灵芝菌丝体种子培养阶段以及扩大培养阶段:[0029]种子培养阶段,优选采用多级种子发酵培养,使得灵芝菌丝体能充分生长形成长势良好适应能力强的灵芝菌丝体液体发酵体系,适应扩大培养阶段的变温处理及光照处理,具体步骤如下:[0030]1采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养5至7天,获得一级种子液;[0031]其中,每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g,115°C灭菌25至40分钟。[0032]2将步骤(1中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5,接种于第一灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养5天,获得二级种子液;[0033]每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B10.05ml,115°C灭菌25至40分钟。[0034]3将步骤2中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10,接种于第二灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养2天,获得三级种子液;[0035]每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g,蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾l.Og、七水合磷酸二氢钾〇.5g、以及维生素B10.05ml,115°C灭菌25至40分钟。[0036]⑷将步骤⑶中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10,接种于CYM培养基中,28°:至30°:,摇床转速120-15^1^11培养1天,获得灵芝菌丝体液体发酵体系。[0037]每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克,上述成分蒸馏水定容到1L,115°C灭菌25至40分钟。[0038]扩大培养阶段:采用光照和变温刺激灵芝菌丝体,培养所述灵芝菌丝体液体发酵体系,持续5至7天;[0039]其中每天配合变温环境对灵芝菌丝体进行光照处理,具体如下:[0040]在光照条件下培养4小时至16小时,在变温条件下培养1至3小时,其他时间进行25°:至28°:避光条件下培养。[0041]所述变温条件为避光维持高温或低温;所述高温在32°C至36°C之间,所述低温在6°:至10°:之间,优选8°C。[0042]扩大培养阶段,采用CYM培养基,每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克,上述成分蒸馏水定容到1L,115°C灭菌25至40分钟。[0043]优选方案,在扩大培养第三天起至发酵结束,采用添加有诱导剂的培养基进行培养,所述诱导剂优选为木材降解物,例如微晶纤维素、D-半乳糖、D-鼠李糖;优选D-半乳糖,能溶于水,便于灵芝菌丝体的分离以及灵芝三萜的提取和纯化。该阶段,优选采用的CYM培养基含有质量份数〇.25%至1%的D-半乳糖。[0044]目前一般认为灵芝菌丝体扩大培养阶段不需要光照,光照可能影响目前普遍认为食药用真菌营养生长阶段不需要光诱导,一般在黑暗中进行,如上海交通大学钟建江教授在〈〈SignificanceoffungalelicitorsontheproductionofganodericacidandGanodermapolysaccharidesbythesubmergedcultureofmedicinalmushroomGanodermalucidum》中采用暗培养,另外也在田雪梅等人的文献中涉及到光质对灵芝生长的影响,指出不论何种光质光量,都对灵芝MP-01菌株菌丝生长有一定的负面作用。仅采用光照处理对灵芝菌丝体体内灵芝三萜含量影响不明显,同时抑制菌丝体生长,因此总灵芝三萜产量增长不多,甚至不增长或者负增长。本发明结合光照和变温处理,刺激灵芝菌丝体大量积累灵芝三萜,产量增长在50%以上。优选方案,添加诱导剂的情况下,产量增长达到90%〇[0045]同时该工艺灵芝菌丝体分离容易,灵芝三萜提取纯化工艺简单,肥肠适合大规模工业化应用。[0046]以下为实施例:[0047]实施例1[0048]灵芝菌丝体发酵工艺,包括:灵芝菌丝体种子培养阶段以及扩大培养阶段:[0049]种子培养阶段,采用多级种子发酵培养,具体步骤如下:[0050]1采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养7天,获得一级种子液;[0051]其中,每升所述PDA液体培养基含有葡萄糖20g以及土豆汁200g,115°C灭菌40分钟。[0052]2将步骤(1中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5,接种于第一灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速150rmin培养5天,获得二级种子液;[0053]每升所述第一灵芝种子培养基含有葡萄糖35g、蛋白胨5g、酵母膏2.5g、磷酸二氢钾0.883g、七水硫酸镁0.5g、以及维生素B10.05ml,115°C灭菌40分钟。[0054]3将步骤2中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10,接种于第二灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速150rmin培养2天,获得三级种子液;[0055]每升所述第二灵芝种子培养基含有葡萄糖35g,蛋白胨5g、酵母膏5g、磷酸二氢钾l.Og、七水合磷酸二氢钾〇.5g、以及维生素B10.05ml,115°C灭菌25至40分钟。[0056]4将步骤⑶中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10,接种于CYM培养基中,28°C至30°C,摇床转速150rmin培养1天,获得所述灵芝菌丝体液体发酵体系。[0057]每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克,上述成分蒸馏水定容到1L,115°C灭菌40分钟。[0058]扩大培养阶段:采用光照和变温刺激灵芝菌丝体,培养所述灵芝菌丝体液体发酵体系,持续6天;[0059]其中每天配合变温环境对灵芝菌丝体进行光照处理,具体如下:[0060]在光照条件下培养4小时至16小时,在变温条件下培养1至3小时,其他时间进行25°:至28°:避光条件下培养。[0061]培养条件如表1所示,扩大培养阶段,采用CYM培养基,每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克,上述成分蒸馏水定容到1L,115°C灭菌25至40分钟。[0062]表1[0065]例如实验1的具体操作步骤为:每天3小时在8°C避光条件下发酵,8小时在光照条件、常温度即28°C至30°C条件下发酵,剩余13小时在避光、常温度即28°C至30°C条件下发酵;如此循环培养共计144小时。[0066]发酵结束后,用布氏漏斗收集菌丝球,并用蒸馏水冲洗5-6次,于60°C烘箱中烘干至恒重,分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉O.lg,置于试管中加入95%乙醇5ml,在超声破碎仪中超声破碎40min重复3次),合并上清,60°C旋蒸,3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次,合并上清,45°C旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中,70°C蒸干后依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3ml,高氯酸lml,混匀,70°C水浴25min,取出冰上冷却5min,加入5ml冰醋酸,混合后于550nm处测定吸光度,测定灵芝三砲含量。检测结果见表2、图1。与比较例相比含量增加明显,灵芝三萜含量增加百分比见表2。[0067]表2[0069]实施例2[0070]灵芝菌丝体发酵工艺,包括:灵芝菌丝体种子培养阶段以及扩大培养阶段:[0071]种子培养阶段:步骤具体同实施例1。[0072]扩大培养阶段:采用光照和变温刺激灵芝菌丝体,培养所述灵芝菌丝体液体发酵体系,持续6天;[0073]其中每天配合变温环境对灵芝菌丝体进行光照处理,具体如下:[0074]在光照条件下培养4小时至16小时,在变温条件下培养2小时,其他时间进行25°C至28°C避光条件下培养。[0075]培养条件如表3所示,扩大培养阶段,采用CYM培养基,每升所述CYM培养基含有葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克,上述成分蒸馏水定容到1L,115°C灭菌25至40分钟。第三天至结束,在所述CYM培养基中添加诱导剂D-半乳糖,质量分数如表3所示,结果如图1所示。[0076]表3[0078]例如实验1的具体操作步骤为:每天2小时在8°C避光条件下发酵,8小时在光照条件、常温度即28°C至30°C条件下发酵,剩余14小时在避光、常温度即28°C至30°C条件下发酵;在培养的第三天加入〇.5%的D-半乳糖进行发酵,如此循环培养共计144小时。[0079]发酵结束后,用布氏漏斗收集菌丝球,并用蒸馏水冲洗5-6次,于60°C烘箱中烘干至恒重,分光光度法测定灵芝三萜含量。取烘干的菌丝粉o.lg,置于试管中加入95%乙醇5ml,在超声破碎仪中超声破碎40min重复3次),合并上清,60°C旋蒸,3ml蒸馏水悬浮后用5ml氯仿萃取三次,合并上清,45°C旋蒸后用5ml甲醇溶解保存。取浸提液0.3ml于10ml具塞试管中,70°C蒸干后依次加入5%香草醛-冰醋酸溶液0.3ml,高氯酸lml,混匀,70°C水浴25min,取出冰上冷却5min,加入5ml冰醋酸,混合后于550nm处测定吸光度,测定灵芝三砲含量。检测结果见表4、图2所示。与比较例相比含量增加明显,灵芝三萜含量增加百分比见表4〇[0080]表4[0082]其中对比例种子培养阶段与本例方法相同,扩大培养阶段条件为:避光条件下常温即28°C至30°C培养144小时,采用CYM培养基。[0083]本领域的技术人员容易理解,以上所述仅为本发明的较佳实施例而已,并不用以限制本发明,凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求:1.一种灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,包括以下步骤:灵芝菌丝体种子培养阶段以及扩大培养阶段;所述扩大培养阶段持续5至7天;其中每天配合变温环境对灵芝菌丝体进行光照处理,具体如下:在光照条件下培养4小时至16小时,在变温条件下培养1至3小时,所述变温条件为避光且维持高温或低温。2.如权利要求1所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述高温在32°C至36°C之间;所述低温在6°C至10°C之间。3.如权利要求1所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述扩大培养阶段第三天至结束,采用添加有诱导剂的培养基进行培养。4.如权利要求3所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述诱导剂为木材降解物。5.如权利要求4所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述诱导剂为D-半乳糖。6.如权利要求1所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述扩大培养阶段采用CYM培养基。7.如权利要求6所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述CYM培养基每升含有:葡萄糖35克、蛋白胨5克、酵母粉5克、磷酸二氢钾0.883克、七水合硫酸镁0.5克、以及维生素B10.05克。8.如权利要求6所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述扩大培养阶段第三天至结束,采用的CYM培养基含有质量份数0.25%至1%的D-半乳糖。9.如权利要求1所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述种子培养阶段采用多级种子发酵培养。10.如权利要求7所述的灵芝菌丝体发酵工艺,其特征在于,所述多级种子发酵培养具体步骤如下:1采用PDA液体培养基活化灵芝菌丝体,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养5至7天,获得一级种子液;2将步骤(1中获得的一级种子液按照接种量体积比1:5,接种于第一灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养5天,获得二级种子液;3将步骤2中获得的二级种子液按照接种量体积比1:10,接种于第二灵芝种子培养基中,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养2天,获得三级种子液。⑷将步骤3中获得的三级种子液按照接种量体积比1:10,接种于CYM培养基中,28°C至30°C,摇床转速120-150rmin培养1天,获得灵芝菌丝体液体发酵体系。

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