申请/专利权人：南京信息工程大学

申请日：2017-01-03

公开（公告）日：2020-07-31

公开（公告）号：CN106577161B

主分类号：A01G17/02(20060101)

分类号：A01G17/02(20060101);A01G7/04(20060101);G06Q50/02(20120101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.07.31#授权;2017.05.24#实质审查的生效;2017.04.26#公开

摘要：本发明公开了一种设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，该确定方法通过寡照胁迫下，对葡萄植株不同寡照生理指标的影响，建立葡萄寡照胁迫指数的计算方法，计算实际寡照胁迫指数，最终确定实际寡照胁迫等级。根据本发明方法能够有效确定设施葡萄寡照胁迫等级，对于葡萄的栽培管理和寡照灾害防御具有重要的指导意义。

主权项：1.设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，其特征在于：所述确定方法的具体步骤如下：1将处于苗期的葡萄分别进行不同程度的寡照处理，测定处理后的叶片丙二醛含量、叶片游离脯氨酸含量和叶绿素含量，分析、比较不同处理后测定的生理指标，建立葡萄寡照胁迫指数的计算模型；所述步骤1中葡萄寡照胁迫指数的计算模型为：R＝10×fA+fB+fC31fA＝|ACK-AEACK|2fB＝|BCK-BEBCK|3fC＝|CCK-CECCK|4其中，R为寡照胁迫指数，fA、fB、fC分别为寡照胁迫后葡萄叶片的细胞膜透性修复效率、植株组织抗逆性能和光合潜在能力，细胞膜透性修复效率采用叶片丙二醛含量变化特征表示，植株组织抗逆性能采用叶片游离脯氨酸含量变化特征反映，光合潜在能力采用叶绿素含量变化表征；AE、BE、CE分别为不同程度寡照处理后的叶片丙二醛含量、叶片游离脯氨酸含量、叶片叶绿素含量；ACK、BCK、CCK分别为对照处理下的叶片丙二醛含量、叶片游离脯氨酸含量、叶片叶绿素含量；所述对照处理条件为：光照强度为600μmol·m–2·s–1，试验期间环境相对湿度为75％，昼温夜温为25℃18℃,光周期14h；2通过步骤1建立的葡萄寡照胁迫指数的计算模型，计算不同寡照处理后的胁迫指数，结合不同程度寡照胁迫后葡萄的生长状态，确定不同寡照胁迫等级下寡照胁迫指数的范围；所述寡照胁迫等级包括轻度、中度、重度和极重度；所述步骤2中不同寡照胁迫等级下寡照胁迫指数的范围确定为：当寡照胁迫指数R≤1时，为正常生长，当寡照胁迫指数1＜R≤2轻度胁迫，Ⅰ级；当寡照胁迫指数2＜R≤3，为中度胁迫，Ⅱ级；当寡照胁迫指数3＜R≤4时，为重度胁迫，Ⅲ级；R4时为极重度胁迫，Ⅳ级；3通过步骤1建立的寡照胁迫指数计算模型，计算设施葡萄实际的寡照胁迫指数，根据步骤2中确定的范围，最终确定设施葡萄实际寡照胁迫等级。

全文数据：设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法技术领域[0001]本发明涉及设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法。背景技术[0002]作为现代农作物的重要组成部分，设施作物代表着我国未来农作物的发展方向。然而，在设施环境中一个比较突出的问题就是光照强度低，寡照灾害已成为影响设施作物生产的主要障碍之一。光照是作物生长发育的重要环境因子，光照强度是作物生长、形态发育、光合及其他生理反应所必需的。研究表明，寡照会使得作物叶片净光合速率下降，干物质积累减少，最终导致产量降低。寡照会引起功能叶片叶绿体形态和超微结构发生变化，寡照下植物叶片中的叶绿素含量和光化学效率等都会存在显著的差异。丙二醛MDA在植物遭受逆境时显著增加，会破坏细胞膜的结构，是重要的降解产物。植物在遭受环境胁迫时，自身会通过代谢等一系列反应使内溶质浓度升高，渗透势下降，从而可以维持正常的生理代谢，在轻度或中度胁迫下，渗透调节才会出现，在胁迫后期，渗透调节机制将迅速下降或者消失。国内外关于寡照对植物影响的研究主要集中于生长、生理机制及光合作用等方面，并已取得了一定的进展，这对于我们进一步探讨寡照胁迫对作物伤害以及如何采取相应的防御措施具有重要的指导作用。[0003]葡萄（KiiisviniferaL.属落叶藤本植物，是世界上主要的四大水果之一，葡萄产量约占世界水果总产量的14。近年来，中国葡萄设施栽培发展十分迅速，2014年全国葡萄栽培面积已达到300余万亩。然而，由于季节性温室光照强度低，由寡照所造成的设施葡萄的损失也越来越严重。日照时间缩短、光照强度降低等寡照条件是设施栽培非耐弱光葡萄品种冬芽不能形成花芽的根本原因。国内外研究主要集中在寡照对葡萄生长、光合、生理及品质影响机理方面，而关于葡萄寡照灾害指数确定这方面的研究较少。发明内容[0004]本发明的目的是为了解决现有技术的缺陷，提供一种能够有效确定设施葡萄寡照胁迫等级的方法。[0005]为了达到上述目的，本发明提供了设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，该确定方法通过寡照胁迫下，对葡萄植株不同寡照生理指标的影响，建立葡萄寡照胁迫指数的计算模型，计算实际寡照胁迫指数，最终确定实际寡照胁迫等级。[0006]其中，寡照生理指标选用叶片丙二醛含量、叶片游离脯氨酸含量及叶片叶绿素含量。[0007]本发明设施葡萄寡照胁迫等级确定方法的具体步骤如下：1将处于苗期的葡萄分别进行不同程度的寡照处理，测定处理后的叶片丙二醛含量、游离脯氨酸含量和叶绿素含量，分析、比较不同处理后测定的生理指标，建立葡萄寡照胁迫指数的计算模型；2通过步骤1建立的葡萄寡照胁迫指数的计算模型，计算不同寡照处理后的胁迫指数，结合不同程度寡照胁迫后葡萄的生长状态，确定不同寡照胁迫等级下寡照胁迫指数的范围；3通过步骤（1建立的寡照指数计算模型，计算设施葡萄实际的寡照胁迫指数，根据步骤2中确定的范围，最终确定设施葡萄实际寡照胁迫等级。[0008]步骤1中葡萄寡照胁迫指数的计算模型为：R=10X㈧+⑶+031A=|Ack~AeAck2⑶=IBck-BeBCKI3C=ICck-AeCck⑷其中，R为寡照胁迫指数；，R为寡照胁迫指数㈧、⑶、C分别为寡照胁迫后葡萄叶片的细胞膜透性修复效率、植株组织抗逆性能和光合潜在能力，细胞膜透性修复效率可用叶片丙二醛含量变化特征表示，植株组织抗逆性能可用叶片游离脯氨酸含量变化特征反映，光合潜在能力用叶绿素含量变化表征;Ae、Be、Ce分别为不同程度寡照处理后的叶片丙二醛含量、叶片游尚脯氨酸含量、叶片叶绿素含量;Ack、Bck、Cck分别为对照处理下的叶片丙二醛含量、叶片游离脯氨酸含量、叶片叶绿素含量;所述对照处理条件为:光照强度为600μπιοίphotonm-2s-、试验期间环境相对湿度为75%，昼温夜温为25°C18°C,光周期14h〇[0009]且寡照胁迫等级包括轻度、中度、重度、极重度;步骤2中不同寡照胁迫等级下寡照胁迫指数的范围确定为：当寡照胁迫指数RS1时，为正常生长，当寡照胁迫指数14时为极重度胁迫，IV级。[0010]步骤（1中不同程度的寡照处理包括:设置2个寡照处理梯度，100μπιοίphotonm-2s-1和300μπιοίphotonm-2s-S处理时间分别为l、3、5、7、9d;处理期间，环境相对湿度为75%，昼温夜温为25°C18°C，光周期14h，每个处理设置三盆重复。[0011]叶片丙二醛含量采用硫代巴比妥酸显色法测定;叶片游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定;叶绿素含量采用叶片分光光度计法测定。[0012]本发明相比现有技术具有以下优点:寡照胁迫下，植株叶片细胞膜结构被破坏，丙二醛MDA含量增加。逆境胁迫下，植株为了维持正常的生理代谢，渗透调节会出现，从而增加了游离脯氨酸Pro的含量。同时寡照使得植株叶片叶绿素含量下降，光合速率降低。本发明通过寡照胁迫下，对葡萄植株不同寡照生理指标的影响，建立葡萄寡照胁迫指数的计算模型，通过研究葡萄在寡照下的生长发育和生理活动规律及其防御激励，确定葡萄的寡照胁迫等级对应的胁迫指数范围。同时本发明采用硫代巴比妥酸显色法测定丙二醛含量陈建勋，2006，酸性茚三酮法测定游离脯氨酸含量（陈建勋，2006，分光光度计法测定叶绿素含量Hugo，2004、张立军，2004，综合评估寡照胁迫对不同生理指标的影响，确定葡萄的寡照胁迫等级，对于葡萄的栽培管理和寡照灾害防御具有重要的指导意义。具体实施方式[0013]下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。[0014]第一步:葡萄寡照试验本实验于2015年9月开始，将处于2年生的葡萄植株移栽至塑料盆中，放入人工气候箱A1000,Conviron,Canada，试验期间，设置2个寡照处理，100ymolphotonm-2s-1L1和300μπιοίphotonm-2s-Vl^，处理时间分别为1、3、5、7、9天；以600μηιο1photonm2s1为对照CK，试验期间，环境相对湿度为75%，昼温夜温为25°C18°C，光周期14h，每个处理设置三盆重复。[0015]第二步:仪器设备与药品准备1仪器设备紫外分光光度计，日本岛津公司；电热数显恒温水浴锅，力辰科技有限公司；低速冷冻多管离心机，上海飞鸽有限公司；电子天平，奥豪斯仪器上海有限公司；10-1000yL、1000-5000yLDRAG0NLAB可调式移液枪，上海万岛仪器科技有限公司。[0016]2药品试剂磷酸二氢钾，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；石英砂，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；硫代巴比妥酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；冰醋酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；磺基水杨酸，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；茚三酮，分析纯，国药集团化学试剂有限公司，上海；第三步:葡萄生理指标的测定1丙二醛的测定称取各处理葡萄叶片〇.lg，擦净剪碎后置于预冷的研钵中，然后加入适量的石英砂和5mlPBSPBS事先配制好，浓度为0.05molL，pH=7.8，在冰浴中研磨至匀浆倒入10ml离心管中，再加入0.05molL的PBS5ml于研钵，随后一起倒入离心管中。将封闭紧实的离心管放置在4°C、9000rmin的离心机下离心20min，待离心结束后将离心管取出，离心管中的上清液用来测定丙二醛。[0017]吸取离心上清液1.5ml于离心管中，加入3ml0.5%的硫代巴比妥酸，将其混均物沸水浴中反应20min至液体呈粉红色，取出迅速放在冰浴中进行冷却处理，待冷却后在9000r离心机中离心15min。以0·5%的硫代巴比妥酸为参比液，分别在450nm、532nm和600nm处测定各处理的吸光度值。计算公式：MDAymol·g-1·FW=CVtVi1000V2W5C一6·45A532-A6QQ-0·56A45Q，ymol·L1;Vt-提取液总体积，ml;Vi-提取液与TBA反应液的总体积，ml;V2-与TBA反应的提取液体积，ml;1000一将ml换算成L的系数；W-葡萄叶片鲜重，g。[0018]根据式5，计算得到的不同程度寡照处理下葡萄叶片的丙二醛含量如表1所示：表1葡萄叶片丙二醛MDA含量随寡照胁迫时间的变化2游离脯氨酸的测定称取各处理葡萄叶片0.lg，3次重复，蒸馏水洗净、剪碎后放入10ml量程的玻璃试管中，向各试管加入5ml3%的磺基水杨酸，管口加盖后在沸水浴中反应30min。取出试管待冷却至室温，吸取各处理提取液lml于其他的试管中，分别加入lml冰醋酸、lml茚三酮和lml蒸馏水，再次于沸水浴中显色30min，取出后自然冷却至室温，以蒸馏水为参比液在520nm处进行测定。[0019]先通过标准曲线计算lml提取液中Pro的浓度，然后再计算各处理的游离脯氨酸含量。[0020]Proyg·g_1=CVxWVs6C一提取液中Pro浓度，由标准曲线查得，yg;Vs-测定液体积，ml;Vt一提取液总体积，ml;ff一匍萄叶片鲜重，g。[0021]计算得到的不同程度寡照处理下的葡萄叶片叶绿素a含量如表2所示：表2葡萄叶片游离脯氨酸Pro随寡照胁迫时间的变化3叶片叶绿素含量的测定试验处理期间摘取葡萄功能叶片，采用Hugo、张立军等的方法来测定葡萄叶片叶绿素含量。将新鲜葡萄叶片置于96%乙醇中，直至叶片变为白色，叶绿素完全提取出，用分光光度计在665、649、470nm波长下对提取液比色，从而计算得到叶绿素含量。每个处理进行3次重复实验。[0022]表3葡萄叶叶绿素含量随寡照胁迫时间的变化第四步:葡萄寡照胁迫指数的计算丙二醛在植物遭受逆境时显著增加，会破坏细胞膜的结构，是重要的降解产物。游离脯氨酸是渗透调节机制的一种，在植物遭受胁迫时，游离脯氨酸的增加可以维持正常的生理代谢。叶绿素是植株进行光合作用最重要的色素，其含量的高低直接影响光合作用的正常进行。根据实验过程中各指标受影响状况，选取丙二醛含量、游离脯氨酸含量、叶绿素含量作为确定葡萄寡照胁迫的判定指标，R为寡照胁迫指数，R=10X㈧+⑶+031A=|Ack~AeAck2⑶=IBck-BeBCKI3C=ICck-AeCck⑷式（1-⑷中：R为寡照胁迫指数，Ae、Be、Ce分别为不同程度寡照处理后的丙二醛含量、游离脯氨酸含量、叶绿素含量，Ack、BeK、C〇i分别为对照处理下的丙二醛含量、游离脯氨酸含量、叶绿素含量，据式1-4，计算计算不同程度寡照处理下的葡萄叶片寡照胁迫指数R如下表7所示：表7葡萄寡照胁迫指数随胁迫时间的变化第五步:葡萄寡照胁迫等级的划分当葡萄植株在适宜生长的光照环境下生长时，寡照胁迫指数较小，R值越大，寡照胁迫程度越深，根据R值的变化，将寡照胁迫等级划分为:轻度、中度、重度、极重度4个等级，具体如下：表8葡萄寡照胁迫等级划分标准第六步:葡萄寡照胁迫等级的确定通过测定葡萄寡照胁迫下的丙二醛含量、游离脯氨酸含量及叶绿素含量，计算葡萄的寡照胁迫指数。再根据表7划分的寡照胁迫等级划分标准，确定葡萄遭受寡照胁迫的程度。[0023]实例2:根据实例1中的方法，利用葡萄进行寡照试验，按上述步骤测定生理指标，计算出寡照胁迫指数，利用寡照指标判定受灾等级，结果见表9。在寡照胁迫下，葡萄的各项生理指标呈现显著的下降趋势，丙二醛是表征细胞膜结构最直观的指标，寡照胁迫使得丙二醛含量增加见表1，说明寡照对细胞膜结构有直接的伤害。游离脯氨酸是渗透调节机制的一种，在植物遭受胁迫时，其值得增加可以维持正常的生理代谢，寡照胁迫下，游离脯氨酸含量也随之增大，且寡照时间越长，其值也会也大表2。叶绿素是植株进行光合作用最重要的光合色素，寡照胁迫使得叶绿素的合成受到抑制，叶片组织的叶绿素含量下降（表3，从而影响葡萄植株的光合速率。由表9可知，在100μmolphotonπΓ2s^lXl处理下，胁迫处理的前Id，R值1.23，属于轻度胁迫;胁迫处理超过3d时，R值均大于3，属于重度胁迫。当葡萄在300μmolphotonm-2处理下，Τ2处理前3天，R为2.23,属于中度胁迫，当处理7天时，R=4.18,属于极重度度胁迫。[0024]表9葡萄寡照胁迫等级随胁迫时间的变化对于设施葡萄实际的寡照胁迫指数，根据式1计算寡照胁迫指数R，然后通过表8最终确定设施葡萄实际寡照胁迫等级，根据设施葡萄寡照胁迫等级进行设施葡萄的栽培管理和寡照灾害防御，例如增加光照等。

权利要求：1.设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，其特征在于:所述确定方法通过寡照胁迫下，对葡萄植株不同寡照生理指标的影响，建立葡萄寡照胁迫指数的回归方程，根据所述回归方程计算实际寡照胁迫指数，最终确定实际寡照胁迫等级。2.根据权利要求1所述的设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，其特征在于:所述寡照生理指标选用叶片丙二醛含量、叶片游离脯氨酸含量及叶片叶绿素含量。3.根据权利要求2所述的设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，其特征在于:所述确定方法的具体步骤如下：1将处于苗期的葡萄分别进行不同程度的寡照处理，测定处理后的叶片丙二醛含量、游离脯氨酸含量和叶绿素含量，分析、比较不同处理后测定的生理指标，建立葡萄寡照胁迫指数的计算模型；2通过步骤（1建立的葡萄寡照胁迫指数的计算模型，计算不同寡照处理后的胁迫指数，结合不同程度寡照胁迫后葡萄的生长状态，确定不同寡照胁迫等级下寡照胁迫指数的范围；3通过步骤（1建立的寡照胁迫指数计算模型，计算设施葡萄实际的寡照胁迫指数，根据步骤2中确定的范围，最终确定设施葡萄实际寡照胁迫等级。4.根据权利要求3所述的设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，其特征在于：所述步骤1中葡萄寡照胁迫指数的计算模型为：R=10XA+⑶+C31A=|Ack~AeAck2⑶=|Bck-BeBck|3C=ICck-AeCck⑷其中，R为寡照胁迫指数，OV、B、C分别为寡照胁迫后葡萄叶片的细胞膜透性修复效率、植株组织抗逆性能和光合潜在能力，细胞膜透性修复效率采用叶片丙二醛含量变化特征表示，植株组织抗逆性能采用叶片游离脯氨酸含量变化特征反映，光合潜在能力采用叶绿素含量变化表征;Ae、Be、Ce分别为不同程度寡照处理后的叶片丙二醛含量、叶片游尚脯氨酸含量、叶片叶绿素含量;Ack、Bck、Cck分别为对照处理下的叶片丙二醛含量、叶片游离脯氨酸含量、叶片叶绿素含量;所述对照处理条件为:光照强度为600ym〇lphotonm2s1，试验期间环境相对湿度为75%，昼温夜温为25°C18°C，光周期14h。5.根据权利要求4所述的设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，其特征在于:所述寡照胁迫等级包括轻度、中度、重度、极重度;所述步骤2中不同寡照胁迫等级下寡照胁迫指数的范围确定为：当寡照胁迫指数R4时为极重度胁迫，IV级。6.根据权利要求3所述的设施葡萄寡照胁迫等级的确定方法，其特征在于：所述步骤1中不同程度的寡照处理包括:设置2个寡照处理梯度，100μπιοίphotonm_2s1和300μπιοίphotonm-2s-S处理时间分别为l、3、5、7、9d;处理期间，环境相对湿度为75%，昼温夜温为25°C18°C，光周期14h，每个处理设置三盆重复。7.根据权利要求3所述的确定方法，其特征在于:所述叶片丙二醛含量采用硫代巴比妥酸显色法测定;所述叶片游离脯氨酸含量采用酸性茚三酮法测定;所述叶绿素含量采用叶片分光光度计法测定。

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