申请/专利权人：东南大学

申请日：2017-01-13

公开（公告）日：2020-07-31

公开（公告）号：CN107058166B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);C12P19/04(20060101);C02F1/28(20060101);C12R1/25(20060101);C02F101/22(20060101);C02F101/20(20060101);C02F101/30(20060101);C02F101/36(20060101);C02F101/38(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.01.23#未缴年费专利权终止;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开

摘要：本发明公开了一株产胞外多糖的植物乳杆菌，其分类命名为Lactobacillusplantarum，菌株号为LCC‑605，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016491，保藏日期为2016年9月18号。与现有菌株相比，本发明的植物乳杆菌LCC‑605所产胞外多糖首次发现能自组装形成纳米颗粒，且吸附重金属与亚甲基蓝能力最强，对亚甲基蓝、Pb2+、Cd2+和Cu2+的吸附量分别为3029mgg、1513mgg、2097mgg和2987mgg，可用于生物修复以治理环境中的重金属和染料污染，具有环境友好性和可持续发展性。

主权项：1.一株产胞外多糖的植物乳杆菌，其分类命名为Lactobacillusplantarum，菌株号为LCC-605，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016491，保藏日期为2016年9月18号。

全文数据：一株产胞外多糖的植物乳杆菌技术领域[0001]本发明属于生物技术和食品发酵领域，具体涉及一株产胞外多糖的植物乳杆菌。背景技术[0002]乳酸菌胞外多糖是由乳酸菌产生的高分子多糖聚合物，可分为荚膜多糖和胞外多糖。荚膜多糖一般分布在菌体的细胞壁上，而胞外多糖通常被释放到培养液中。乳酸菌胞外多糖在提高发酵乳制品的流变学特性、质构以及适口性方面有着极好的应用（FEMSmicrobiologyreviews，1999，232:153-177。乳酸菌胞外多糖可以在肠道内长时间存在进而增加益生菌在肠道内的定植（Internationaldairyjournal,2002,122:163-171。此外，人们发现乳酸菌胞外多糖对重金属离子和染料分子也有一定的吸附效果Bioresourcetechnology，2014，160:15-23;Plosone，2016，ll2:e0148430。乳酸菌胞外多糖根据其组成和结构可以分为同多糖和异多糖。同多糖主要有葡聚糖和果聚糖。相比之下，异多糖则由多个重复的低聚糖组成，每个重复单元通常含有两个或两个以上单糖并具有不同的连接方式Biotechnologyadvances，2001，198:597-625。乳酸菌胞外多糖带有一些带电基团，如羧基，磷酸根以及羟基。这些基团有助于胞外多糖吸附重金属。[0003]自然环境中存在着许多金属离子或金属颗粒，包括有毒的重金属离子如Pb、Cd、Cr等，一些稀有金属元素如4118、？1、？丨等，和一些辐射性元素如1]、111、1^^111等。环境以及食品的重金属污染导致的生物体内重金属富集的现象对人类健康具有极大的威胁。同时，重金属污染毒性较大且广泛存在。除了人类的自然活动之外，其他的人类生产活动也会产生重金属离子如采矿业、精炼行业、工业加工过程、食品加工过程、个人护理产品、工业排放、药业以及化妆品废弃物。除了重金属污染外，染料污染也不容忽视。染料的排放带来的颜色不仅令人不愉悦，而且还会阻碍光线渗透，危害水生物的生长。同时，大部分染料都是有毒的甚至是致癌的，对生物体具有较大的毒害作用。传统的重金属，染料去除方法包括凝聚和絮凝作用、氧化和臭氧化、膜分离技术以及生物吸附技术。被染料污染的废水很难处理，因为染料分子属于顽固分子，对有氧消化有一定的抵抗性;另外，染料分子在废水中含量比较低，不容易进行大规模、低成本的处理。近年来发现生物吸附法可以解决这些问题，并且成本较低，已经被证实有效可行（Biotechnologyadvances，2008,26⑶：266-291。也有人用生物吸附法回收贵金属资源HydrometalIurgy103，180-189。因此，选择绿色环保，可持续发展的吸附材料对重金属以及染料污染进行处理是非常必要的。[0004]胞外多糖用来吸附重金属已有报道，像来源于BaciIlussubtilis和Pseudomonasputida的EPS能显著增加Cu2+的吸附（Bioresourcetechnology,2011，1022:1137-1141;InternationalbiodeteriorationBiodegradation，2010，648:734-741〇BacilluslicheniformisEnvironmentalpollution,2011，1595:1369-1374的EPS对重金属吸附的选择性也有报道。Arthrobacterps_5胞外多糖可以吸附Cu2+、Pb2+和CM2+Carbohydratep〇lymerS，2014，101:50-56。总之，EPS对重金属的吸附能力与EPS的种类，重金属离子的种类以及环境条件有很大关系。然而现有的大多数吸附材料或者不具有较好的吸附效果，或者是需要较长时间才能吸附。因此，需要开发一种吸附时间较短且吸附效果较好的具有可持续发展性的生物吸附剂，用于重金属和染料的治理。发明内容[0005]本发明要解决的技术问题是提供一种产胞外多糖的植物乳杆菌，以解决现有技术存在的吸附效果不佳和吸附时间较长等问题。[0006]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：[0007]一株产胞外多糖的植物乳杆菌，其分类命名为Lactobacillusplantarum，菌株号为LCC-605,已保藏于中国典型培养物保藏中心，，地址为中国武汉市武汉大学，邮编为430072,保藏编号为CCTCCM2016491，保藏日期为2016年9月18号。[0008]上述产胞外多糖的植物乳杆菌LCC-605是2015年1月15日从云南省富源县富源酸菜中筛选得到的。[0009]上述产胞外多糖的乳酸菌LCC-605为革兰氏阳性菌，触酶反应阴性;经API鉴定为植物乳杆菌;经分子生物学鉴定，其与植物乳杆菌亲缘关系最近;在NCBI上申请基因登录号为KX443590未公开）。[0010]一种胞外多糖，它是由权利要求1所述的植物乳杆菌LCC-605产生的，命名为[0011]EPS-605。[0012]其中，它能自组装成直径50〜300nm的球形纳米颗粒。[0013]上述胞外多糖EPS-605在吸附重金属和染料中的应用也在本发明的保护范围内。[00M]其中，所述的重金属为Pb2+、Cd2+和Cu2+。[0015]其中，所述的染料为亚甲基蓝。[0016]其中，所述的重金属为污水中的重金属。[0017]其中，所述的染料为污水中的染料。[0018]其中，吸附温度为15〜40°C;[0019]其中，[0020]在Pb2+的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为1513mgg，饱和吸附时间为6〜8h;[0021]在Cd2+的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为2097mgg，饱和吸附时间为18〜24h;[0022]在Cu2+的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为2987mgg，饱和吸附时间为8〜12h;[0023]在亚甲基蓝的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为3029mgg，饱和吸附时间为18〜24h。[0024]上述应用方法包括如下步骤：[0025]1通过植物乳杆菌LCC-605制备并提纯胞外多糖EPS-605;[0026]⑵利用步骤⑴中制备得到的胞外多糖EPS-605吸附染料。[0027]其中，可采用如下方法通过植物乳杆菌制备并提纯胞外多糖：[0028]取植物乳杆菌LCC-605的菌体样本，用MRS培养基活化三次。4°C，14000g离心30min，以去除菌体。离心后将上层清液倒入烧杯，剩下的菌体再次离心一次，上层清液再次倒入烧杯。然后在烧杯里倒入80%的三氯乙酸，直至三氯乙酸终浓度为4%，放入4°C冰箱过夜，沉淀蛋白。隔天，将烧杯里的溶液再次离心，以分离沉淀的蛋白质。去除沉淀，倒出上层清液，再加入三倍体积的无水乙醇，放入4°C冰箱过夜，以沉淀胞外多糖。隔天，将烧杯里的溶液离心，沉淀即为多糖。将多糖取出并加少量超纯水溶解，装入透析袋中，放入大烧杯使其透析三天，每4h换一次水，以去除其中的单糖。三天后，置于真空冷冻干燥机中冻干，即得植物乳杆菌LCC-605的胞外多糖EPS-605。[0029]有益效果：[0030]与现有技术相比，本发明具有如下优势：[0031]1、该新分离鉴定到的植物乳杆菌LCC-605具有生物安全性，不产生毒素。[0032]2、该胞外多糖EPS-605吸附重金属与亚甲基蓝能力强，为国内外文献报道中最高。其对亚甲基蓝、Pb2+Xd2+和Cu2+的吸附量分别为3029mgg、1513mgg、2097mgg、和2987mgg°[0033]3、胞外多糖来源于植物乳杆菌发酵，因此具有环境友好性和可持续发展性。[0034]4、首次发现非葡聚糖胞外多糖EPS-605能自组装形成80〜300nm的纳米球形结构。附图说明[0035]图IA为实施例1中乳酸菌平板筛选示意图；[0036]图IB为实施例1中产多糖乳酸菌的发酵液粘度示意图；[0037]图IC为实施例1中拉丝实验结果示意图；[0038]图ID为实施例2中革兰氏染色结果示意图；[0039]图2为实施例2中植物乳杆菌LCC-605的扫描电镜图；[0040]图3为实施例3中不同碳源条件下产生的胞外多糖对Pb2+、Cd2+、Cu2+的吸附对比图；[0041]图4为实施例3中产生的胞外多糖不同吸附时间对Pb2+、Cd2+、Cu2+的吸附对比图；[0042]图5为实施例3中不同碳源条件下产生的胞外多糖对Pb2+吸附后的扫描电镜对比图；[0043]图6为实施例4中胞外多糖吸附亚甲基蓝前以及吸附甲基蓝后胞外多糖的结果示意图；[0044]图7为实施例4中胞外多糖吸附甲基蓝随时间变化的示意图。图8为实施例4中溶液中的Mb残留量变化示意图。具体实施方式[0045]实施例1[0046]植物乳杆菌LCC-605的分离筛选，包括以下步骤：[0047]1发酵样品液样品取自曲靖当地家庭自制酸菜发酵液。[0048]2样品液的稀释：用无菌的ImL移液管吸取ImL样品液于无菌的的小试管中用无菌生理盐水稀释成稀释度为10—\10—2、10—3、10—4、10—5、10—6、10—7、10—8、10—9、10—1、10—η、10一12。选择稀释度为HT4至KT12备用。[0049]3平板分离:首先在超净台上在无菌操作的条件下，将已经灭菌的含有碳酸钙的MI«固体培养基倒平板，待温度为室温后吸取以上稀释度为HT4至HT12的发酵液O.lmL。分别用倾注法和涂布法倾注和涂布到含有碳酸钙的MRS固体培养基的培养皿上，每个稀释度做两个重复，并用保鲜膜装好至于37°C的恒温箱中培养48h。如图1所示，筛选出有透明圈的菌落，并进行液体培养，得到产胞外多糖的植物乳杆菌LCC-605的菌体样本图1A。[0050]4对获得的植物乳杆菌进行拉丝实验确定产多糖，如图IB和图IC所示，该菌株产生粘性多糖。[0051]实施例2菌株的鉴定和胞外多糖的制备[0052]1菌体形态观察及革兰氏染色[0053]在超净台中用接种环挑去少量实施例1中制备的搭配的菌体样本均匀涂抹在载玻片上，再用酒精灯加热杀死细菌，滴加草酸铵结晶紫，染色lmin。用水冲掉洗载玻片上多余的染色液，再用吸水纸吸干。滴加少量碘-碘化钾溶液，静置Imin后水洗，用吸水纸吸干，连续滴加乙醇进行脱色，直至流出的液体无色，然后水洗。最后用蕃红染液复染30s。染色结束后，用显微镜进行观察，革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。鉴定结果表明分离的乳酸菌为革兰氏阳性菌图1D。[0054]⑵API实验[0055]取实施例1中得到的产胞外多糖的植物乳杆菌LCC-605的菌体样本，在MRS培养皿中划线，放入37°C培养箱培养24〜48h。从培养皿中挑选单菌落，置入API50CHL培养基中，接入鉴定试剂条，在37°C培养箱中再培养24〜48h，记录样品菌株在24h和48h时对于碳水化合物发酵的结果，将所得数据输入APILABPLUS软件进行鉴定。API检测结果见表ULCC-605能够利用多种碳源，如葡萄糖、半乳糖、木糖、赤藓糖醇、蔗糖、鼠李糖等。[0056]表IAPI实验结果[0057][0058][0059]2胞外多糖制备[0060]取实施例1中得到的产胞外多糖的植物乳杆菌LCC-605的菌体样本，用MRS养液活化三次，4°C，HOOOg离心30min，以去除菌体。离心后将上层清液倒入烧杯，剩下的菌体再次离心一次，上层清液再次倒入烧杯。然后在烧杯里倒入80%的三氯乙酸，直至三氯乙酸终浓度为4%，放入4°C冰箱过夜，沉淀蛋白。隔天，将烧杯里的溶液再次离心，以分离沉淀的蛋白质。去除沉淀，倒出上层清液，再加入三倍体积的无水乙醇，放入4°C冰箱过夜，以沉淀胞外多糖。隔天，将溶液离心，多糖沉淀。将多糖取出并加少量超纯水溶解，装入透析袋中，放入大烧杯使其透析三天，每4h换一次水，以去除其中的单糖。三天后，置于真空冷冻干燥机中冻干，即得产胞外多糖的植物乳杆菌LCC-605的胞外多糖。[0061]3LCC-605扫描电镜结果可以看出乳酸菌为短杆状且分泌出呈球形的胞外多糖颗粒图2。[0062]实施例3重金属吸附能力的检测：[0063]1不同碳源对生物吸附效果的影响[0064]为了探究使得乳酸菌胞外多糖产生最好的生物吸附效果的碳源，使用含有不同碳源MRS培养基进行发酵。用不含碳源和分别含葡萄糖、甘露糖、蔗糖、乳糖的MRS培养基培养乳酸菌，发酵、提取胞外多糖后，将这六种多糖分别配置成〇.8mgmL的溶液，分成18份，装入透析袋中。配置l〇mgL的硝酸铅、硝酸镉和硝酸铜溶液各6份，将6个不同碳源培养的胞外多糖透析袋分别装入3种离子溶液中，静置24h后对离子溶液取样进行金属离子浓度检测。实验结果见图3,以葡萄糖为碳源产生的胞外多糖对Pb2+的吸附能力最强。[0065]2吸附时间对生物吸附作用的影响[0066]配制10mgL的硝酸铅、硝酸镉、硝酸铜溶液，倒入9个烧杯中。将乳酸菌包外多糖样品用去离子水配成0.8mgmL的溶液，装入9个透析袋中，分别放入9个烧杯使其开始生物吸附作用。每隔〇、4、8、12、24、28、48h各取一次重金属离子溶液的样品进行浓度检测，结果如图4所示，对Cd2+和Cu2+的吸附到12h几乎达到稳定，对Pb2+的吸附24h几乎达到稳定。[0067]3pH对生物吸附作用的影响[0068]配制10mgL的硝酸铅、硝酸镉、硝酸铜溶液，倒入10个烧杯中，将pH调成3、5、7、9和11。每组两个平行。将乳酸菌胞外多糖样品用去离子水配成0.8mgmL的溶液，装入10个透析袋中，分别放入10个烧杯使其开始生物吸附作用。吸附24h后取重金属离子溶液的样品进行浓度检测。结果如图5，Pb2+在pH5-11范围内吸附量最高。[0069]⑷温度对生物吸附作用的影响[0070]配制l〇mgL的硝酸铅、硝酸镉、硝酸铜溶液。将乳酸菌包外多糖样品用去离子水配成0.8mgmL的溶液，装入透析袋中，分别放入烧杯分别在25、28、31、34和37°C进行生物吸附作用。24h后取重金属离子溶液的样品进行浓度检测。结果如图6所示，温度对重金属离子的吸附影响不大。[0071]实施例4亚甲基蓝吸附能力检测。[0072]将亚甲基蓝配成20mgL的溶液，取50mL置于小烧杯中；将实施例2中制备得到的胞外多糖配成〇.8mgmL，取5mL放于7KDa的透析袋中，将其放入到含有甲基蓝溶液的小烧杯中于25°C静止24h，每隔2h取一次样，测定溶液中剩余的甲基蓝含量，实验结果见图7和8，EPS吸附后溶液中亚甲基蓝的颜色明显减弱，吸附在12h时几乎达到稳定。

权利要求：I·一株产胞外多糖的植物乳杆菌，其分类命名为LactobaciIlusplantarum，菌株号为LCC-605,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016491，保藏日期为2016年9月18号。2.—种胞外多糖，其特征在于，它是由权利要求1所述的植物乳杆菌LCC-605产生的，命名为EPS-605。3.根据权利要求2所述的胞外多糖，其特征在于，它能自组装成直径50〜300nm的球形纳米颗粒。4.权利要求2所述的植物乳杆菌LCC-605产生的胞外多糖EPS-605在吸附重金属和染料中的应用。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的重金属为Pb2+Xd2+和Cu2+。6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的染料为亚甲基蓝。7.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的重金属为污水中的重金属。8.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的染料为污水中的染料。9.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，吸附温度为15〜40°C;其中，在Pb2+的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为1513mgg，饱和吸附时间为6〜8h;在Cd2+的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为2097mgg，饱和吸附时间为18〜24h;在Cu2+的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为2987mgg，饱和吸附时间为8〜12h;在亚甲基蓝的起始浓度为0〜1000mgL时，胞外多糖EPS-605的饱和吸附量为3029mgg，饱和吸附时间为18〜24h。

百度查询： 东南大学 一株产胞外多糖的植物乳杆菌

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