申请/专利权人：四川农业大学

申请日：2016-12-26

公开（公告）日：2020-08-21

公开（公告）号：CN106636406B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.03.18#未缴年费专利权终止;2017.06.06#实质审查的生效;2017.05.10#公开

摘要：本发明提供一种与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207，标记R207位于小麦2D染色体长臂上，核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明提供的分子标记R207与寡分蘖基因Ltn3共分离，可用于分子标记辅助选择，检测结果表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦寡分蘖基因，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。利用本发明提供的分子标记及检测方法能够加强分蘖预测的准确性，提高特异株型育种的成功率，加速实现增加小麦单产的目标。

主权项：1.与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207，其特征在于，标记R207位于小麦2D染色体长臂上，核苷酸序列如下：5’-GGCATCTACATTCGCGTTCNTGCCTGCAGCGGTCAGTCTGATCACCAG-3’；其中，N为C或T；C对应于寡分蘖表型。

全文数据：与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用技术领域[0001]本发明涉及分子生物学及遗传育种领域，具体地说，涉及一种与小麦寡分蘖基因Ltn3共分尚的分子标记R207及其应用。背景技术[0002]小麦是我国仅次于水稻的第二大粮食作物，历年种植面积分别占耕地面积的22%~30%，粮食作物总面积的22%~27%，主要分布在河南、河北、山东、山西、陕西、江苏、四川、安徽等省份；总产量为1亿吨以上，约占粮食作物产量的22%，是我国约一半人口的主食，因此尚广小麦品种的选育一直是育种家关注的重点。[0003]小麦粮食产量主要由三大要素构成，产量=穗数*穗粒数*粒重。分蘖是禾本科作物中最重要的组成成分之一，它影响着分蘖的发生和形成，从而最终影响粮食的产量Kebrometal.Grassesprovidenewinsightsintoregulationofshootbranching.TrendsPlantSci.2013,18:41-48;Hussienetal.Geneticsoftilleringinriceandbarley.PlantGenome·2014,7:1-20。，同时又是单子叶植物的一种特殊的分枝现象，具有重要的研究意义。[0004]小麦分蘖遗传研究总体进展相对缓慢，现阶段国内外工作主要围绕分蘖基因QTL的分子标记定位及其遗传效应开展。部分分蘖突变体由单基因控制，因而一些学者将其作为质量性状来研究（RichardsRA.Atillerinhibitiongeneinwheatanditsaffectonplantgrowth.AustrJAgricRes.1988,39:749-757；DugganBL1RichardsRA,TsuyuzakiH.Environmentaleffectsontheexpressionofthetillerinhibitiontingeneinwheat.FunctPlantBiol,2002,29:45-53。同时，也有很多学者将分蘖作为多基因控制的数量性状来研究（ShahaMM，GillaKS，BaenzigerPS，YenY,KaepplercSM,AriyarathneHM.MoIecularmappingoflociforagronomictraitsonchromosome3Aofbreadwheat.CropSci.1999,39:1728-1732;谢ί月，龙海，侯永翠，郑有良.小麦寡分蘖材料Η461分蘖性状的遗传分析.麦类作物学报.2006，26:21-23;王岩.小麦永久F2群体构建及株高和分蘖特性的QTL定位.山东农业大学硕士学位论文，2009;温明星.望水白多分蘖、矮杆突变体的鉴定及相关QTL定位.南京农业大学硕士学位论文，2010;JinpengZhang1JunWu1WeihuaLiu,XiangLu,XinmingYang,AinongGao,XiuquanLi,YuqingLu,LihuiLi.Geneticmappingofafertiletillerinhibitiongene,ftin,inwheat.MolBreeding.2013,31:441-449。迄今为止，已报道的分蘖相关主效基因QTL位于1A，2A，3A，6A染色体，微效基因位于5六，38,78，10、50染色体，其中仅^和3六上的^11基因研究较深入，完成了精细定位工作。[0005]小麦材料H461相对于小麦品种川农16国审品种具有寡分蘖、多穗粒数、多小穗数、高千粒重和高穗粒重等特性侯永翠，郑有良，蒲至恩，魏育明，李伟.穗数型小麦新品种川农16与大穗型寡分蘖品系財61遗传差异研究初报.四川农业大学学报.2003,21:94-9，已定位到一个显著降低分蘖数量且稳定遗传的基因位于2D染色体长臂上Wang,Zhiqiang,etal·''Identificationandvalidationofnovellow-tillernumberQTLincommonwheat."TheoreticalandAppliedGenetics129.32016:603-612.。利用杂合自交家族法，结合表型和基因型成功创制Ltn3近等基因系B95-1B95-2,近等基因系杂交构建次级F2群体，开发目标区间内的多态性分子标记，进一步缩小基因区间，寻找共分离的分子标记，促进分蘖基因的图位克隆，同时为小麦特异分蘖材料的创制及株型育种提供新基因资源，进一步利用分子标记辅助选择，将增强分蘖预测的准确性，提高株型育种效率，加速实现增加小麦单产的目标。[0006]分子标记辅助选择，不依赖于表现型选择，即不受环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素的影响，而是直接对基因型进行选择，因而能大大提高育种效率。竞争性等位基因特异性PCRKompetitiveAlleleSpecificPCR，可在广泛的基因组DNA样品中，对SNP和特定位点上的Indel进行精准的双等位基因检测。这种检测方法具有操作简便、特异性好、高通量、快速、检测成本低、结果准确等优势，并且实现了真正的闭管操作而受到普遍的关注。因此，筛选出与分蘖基因共分离的，且适用于荧光定量PCR平台KASP技术的分子标记，不仅能对小麦分蘖基因进行选择，有效调控小麦分蘖发生，塑造合理的分蘖发生群体，同时提高了选择通量、速度和准确性，解决了大规模推广应用的技术瓶颈，对规模化改良小麦育种群体质量和产量具有重要意义。发明内容[0007]本发明的目的是提供一种与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207及其应用。[0008]为了实现本发明目的，本发明提供的与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207，标记R207位于小麦2D染色体长臂上，核苷酸序列如下：5'-;其中，N为C或T。[0009]本发明还提供所述分子标记R207在小麦育种中的应用。[0010]本发明还提供所述分子标记在鉴定寡分蘖小麦品种中的应用。包括以下步骤：[0011]1提取待测小麦的基因组DNA;[0012]2以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；[0013]3采用荧光检测仪分析PCR产物，进行基因分型。[0014]其中，步骤2的引物序列如下：[0018]并且，引物R207-1和R207-2的5'端分别连有不同的荧光探针；[0019]所述荧光探针的序列如下：[0020]F探针（可结合FAM荧光基团）[0021]H探针（可结合HEX荧光基团）[0022]荧光定量PCR扩增反应体系：2XKASPMastermix5yL，KASPAssayMix0·HyL，模板DNA50ng、DnaseRNase_free去离子水加至总量为IOyL;其中，KASPAssayMix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，体积比为2:2:5。即，在KASPAssayMix中，将浓度为100μΜ的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5体积比混合。[0023]荧光定量PCR程序:95°C活化15min;95°C变性20s，65°C退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低TC;94°C变性20s，57°C退火延伸60s，循环30次;37°C60s，采集荧光信号。[0024]步骤3分析PCR产物的具体方法如下：[0025]含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461相同的焚光信号，而不含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的焚光信号。[0026]本发明还提供一套基于KASP技术检测所述分子标记R207的引物组合，所述引物组合包括：[0030]并且，引物R207-1和R207-2的5'端分别连有不同的荧光探针；[0031]所述荧光探针的序列如下：[0032]F探针（可结合FAM荧光基团）[0033]H探针（可结合HEX荧光基团）[0034]本发明还提供所述引物组合在小麦分子标记辅助育种中的应用。[0035]本发明还提供一种鉴定小麦寡分蘖基因Ltn3的分子标记的方法，以待测植株样品的基因组DNA作为模板，用荧光定量PCR引物进行荧光定量PCR扩增，利用扩增结果进行基因型分型，将与近等基因系-寡分蘖植株分为同一类型的植株鉴定为含有小麦寡分蘖基因Ltn3的植株。[0036]本发明还提供所述分子标记R207在制备转基因植物中的应用，其中，所述基因为寡分蘖基因Ltn3。[0037]本发明还提供上述方法在小麦品种改良中的应用。[0038]本发明首次公开了基于竞争性等位基因特异性PCRKASP平台精确检测小麦H461寡分蘖基因Ltn3的分子标记R207，其为共显性标记，检测准确高效，通量高，扩增方便稳定。[0039]本发明提供的分子标记R207与寡分蘖基因Ltn3共分离，可用于分子标记辅助选择，检测结果表明，该分子标记能准确跟踪所述小麦寡分蘖基因，预测小麦的分蘖特性，进而方便进行分子设计育种。利用本发明提供的分子标记及检测方法能够加强分蘖预测的准确性，提高特异株型育种的成功率，加速实现增加小麦单产的目标。附图说明[0040]图1为本发明实施例1中小麦寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与分子标记R207之间的连锁遗传图谱。[0041]图2为本发明实施例1中B95-1XB95-2的部分次级F2群体植株用KASP引物做基因型分型的结果。[0042]图3为本发明实施例1中次级F2群体的重组子鉴定及基因Ltn3定位情况。[0043]图4为本发明实施例2中利用基于KASP设计的引物，对B95-1、B95-2、F1、H461JI^16及川麦107做基因型分型的检测结果。具体实施方式[0044]以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001，或按照制造厂商说明书建议的条件。[0045]实施例1小麦寡分蘖基因Ltn3及分子标记R207的获得[0046]本发明与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207是通过以下方法获得的：[0047]1利用近等基因系寡分蘖小麦B95-1作为父本本，以近等基因系多分蘖小麦B95-2为母本本杂交，得到杂种Fl，Fl代单株自交获得F2，获得含有986个单株的次级F2群体。[0048]2用CTAB法提取所述的亲本，Fl植株和次级F2群体的各单株的DNA，从数据库http:plants.ensembl·orgTriticum_aestivumInfoIndex下载获得目标区间内scaffold序列信息，设计测序引物对亲本B95-1和B95-2进行DNA扩增测序，通过DNAMAN6.0对测序结果进行比对，寻找差异位点，对差异位点进行KASP分子标记开发。获得亲本B95-1的带型记为A，亲本B95-2的带型记为B，F1植株的带型记为H。[0049]3小麦成熟期田间鉴定所述次级F2群体植株的分蘖数。[0050]4利用JoinMap4.0作图软件将获得的所述次级F2群体基因型资料构建小麦分子连锁图谱，寻找最优的标记数和标记顺序。[0051]5设计荧光定量PCR引物，用于后续筛选。利用DNAMAN6.0软件设计荧光定量PCR引物7对（表1。荧光定量PCR引物设计标准：扩增引物长度18~25bp，扩增产物长度45-60bp，退火温度57-62°C，GC含量在40%~60%之间。合成引物序列为：[0052]正向引物I:F探针+扩增引物序列[0053]正向引物2:H探针+扩增引物序列[0054]反向引物:扩增引物序列[0055]F探针：（可结合FAM荧光基团）[0056]H探针：（可结合HEX荧光基团）[0057]表17对KASP引物序列及扩增片段长度[0058][0059]6竞争性等位基因特异性PCRKASP分析[0060]a亲本之间多态性分子标记的筛选：选取上述设计的7对引物，以亲本B95-1和B95-2的DNA为模板，进行PCR扩增，共获得1对效果良好的分子标记引物，命名为R207-123核苷酸序列分别如SEQIDNO:2-4所示）。扩增产物为具有多肽性的分子标记R207,核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。[0061]b次级F2群体的KASP分析：用上述步骤获得的具有多态性的分子标记R207的PCR引物，扩增亲本B95-1、B95-2和次级F2群体植株的DNA，进行基因型鉴定，获得分子标记数据。亲本B95-1的类型记为A，扩增片段大小长47bp，单碱基差异位点为C。亲本B95-2的类型记为B，扩增片段长47bp，单碱基差异位点为T。次级F2群体株系类型来源于B95-1的记为A，来源于B95-2的记为B，杂合记为H。[0062]c遗传连锁图谱的构建:根据分子标记R207的鉴定数据，结合已开发的其他分子标记的基因分型数据，用作图软件JoinMap4.0构建遗传高密度图谱。并结合次级F2群体分蘖表型数据定位寡分蘖基因Ltn3与R207共分离。[0063]小麦寡分蘖基因Ltn3在2D染色体上的位置及与分子标记R207之间的连锁遗传图谱见图1。[0064]B95-1XB95-2的部分次级F2群体植株用KASP引物做基因型分型的结果见图2。[0065]次级F2群体的重组子鉴定及基因Ltn3定位情况见图3。[0066]实施例2与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207的应用[0067]基于KASP检测平台技术设计引物，对895-1、895-2、？1、财61、川农16及川麦107做基因型分型检测。[0068]1、提取待测小麦三叶期的叶片基因组DNA;[0069]2、以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；[0070]3、采用荧光检测仪分析PCR产物，进行基因分型。[0071]其中，步骤2的引物序列如下：[0075]并且，引物R207-1和R207-2的5'端分别连有不同的荧光探针；[0076]所述荧光探针的序列如下：[0077]F探针（可结合FAM荧光基团）[0078]H探针（可结合HEX荧光基团）[0079]荧光定量PCR扩增反应体系：2XKASPMastermix5yL，KASPAssayMix0·HyL，模板DNA50ng、DnaseRNase_free去离子水加至总量为IOyL;其中，KASPAssayMix中含有引物R207-1、R207-2和R207-3，体积比为2:2:5。即，在KASPAssayMix中，将浓度为100μΜ的引物R207-1、R207-2和R207-3按2:2:5体积比混合。[0080]荧光定量PCR程序:95°C活化15min;95°C变性20s，65°C退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低TC;94°C变性20s，57°C退火延伸60s，循环30次;37°C60s，采集荧光信号。[0081]分析PCR产物的具体方法如下：[0082]含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461相同的焚光信号，而不含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的焚光信号。基因型分型结果见图4。[0083]虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

权利要求：1.与小麦寡分蘖基因Ltn3共分离的分子标记R207，其特征在于，标记R207位于小麦2D染色体长臂上，核苷酸序列如下：5'-GGCATCTACATTCGCGTTCNTGCCTGCAGCGGTCAGTCTGATCACCAG-3'；其中，N为C或T。2.权利要求1所述的分子标记在小麦育种中的应用。3.权利要求1所述的分子标记在鉴定寡分蘖小麦品种中的应用。4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：1提取待测小麦的基因组DNA;2以待测小麦的基因组DNA为模板，基于KASP检测平台技术设计引物，进行荧光定量PCR扩增；3采用荧光检测仪分析PCR产物，进行基因分型。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，步骤2的引物序列如下：R207-l:5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3'；R207-2:5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3'；R207-3:5'-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3'；并且，引物R207-1和R207-2的5'端分别连有不同的荧光探针；所述荧光探针的序列如下：F探针：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'H探针：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，步骤2中荧光定量PCR扩增反应体系：2XKASPMastermix5yL，KASPAssayMixO.14yL，模板DNA50ng、DnaseRNase_free去离子水加至总量为IOyL;其中，KASPAssayMix中含有引物R207-l、R207-2和R207-3,体积比为2:2:5〇7.根据权利要求4-6任一项所述的应用，其特征在于，步骤2中荧光定量PCR程序:95°C活化15min;95°C变性20s，65°C退火延伸60s，循环10次，每次退火延伸温度降低1°C;94°C变性20s，57°C退火延伸60s，循环30次;37°C60s，采集荧光信号。8.根据权利要求4-7任一项所述的应用，其特征在于，步骤3中含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461相同的焚光信号，而不含有小麦寡分蘖基因Ltn3的小麦品种均出现与小麦H461明显不同的焚光信号。9.基于KASP技术检测权利要求1所述分子标记的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括：R207-l:5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGCATCTACATTCGCGTTCC-3'；R207-2:5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGGCATCTACATTCGCGTTCT-3'；R207-3:5'-CTGGTGATCAGACTGACCGC-3'；并且，引物R207-1和R207-2的5'端分别连有不同的荧光探针；所述荧光探针的序列如下：F探针：5'-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3'H探针：5'-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3'。10.权利要求9所述的引物组合在小麦分子标记辅助育种中的应用。

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