申请/专利权人：江南大学

申请日：2019-06-10

公开（公告）日：2020-09-04

公开（公告）号：CN110184204B

主分类号：C12N1/19(20060101)

分类号：C12N1/19(20060101);C12P7/40(20060101);C12P7/46(20060101);C12P7/50(20060101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.04#授权;2019.09.24#实质审查的生效;2019.08.30#公开

摘要：本发明公开了一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法，属于生物工程技术领域。本发明通过缺失或过量表达本源转录因子的编码基因CgRDS2来调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的能力。结果表明，光滑球拟酵母缺失CgRDS2基因后，与出发菌株相比，在低pH胁迫条件下细胞浓度可降低32.6％，细胞存活率下降56.9％，胞内ATP含量降低33.5％，细胞膜通透性降低23.6％；过表达CgRDS2基因后，与出发菌株相比，菌株在低pH胁迫条件下，细胞浓度没有显著变化，细胞存活率提高17.6％，胞内ATP含量提高41.5％，细胞膜通透性增加18.8％。

主权项：1.一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法，其特征在于，所述方法是缺失CgRDS2基因以降低菌株低pH胁迫抗性，或者过表达CgRDS2基因以增强菌株的低pH胁迫抗性。

全文数据：一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法技术领域本发明涉及一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法，属于生物工程技术领域。背景技术光滑球拟酵母作为生产丙酮酸的唯一工业微生物，也用于生产其他有机酸，苹果酸、富马酸、α-酮戊二酸等。在发酵生产有机酸的过程中，随着胞外有机酸的积累会造成培养基pH的下降，严重抑制细胞生长，同时降低有机酸的产量。因此，有效解决低pH胁迫是光滑球拟酵母发酵生产有机酸过程中一个亟待解决的问题。目前解决低pH胁迫的方法主要是向发酵培养基中添加NaOH、CaCO3等碱性物质，但是这类物质的添加又会使得发酵体系的渗透压不断升高，形成渗透压胁迫，同样导致细胞生长和生产能力下降。目前，已经有研究表明，光滑球拟酵母中转录因子CgCrz1通过调节细胞膜脂质合成与代谢途经来抵御酸胁迫环境；酿酒酵母中，转录因子Smp1通过参与HOG信号传导路径来响应渗透压胁迫；转录因子Mga2通过调节脂质代谢基因使得脂质组分发生变化以抵御氧胁迫环境；转录因子Cip1通过下调细胞周期蛋白依赖性激酶Cdk1使得细胞周期停滞来应对高渗胁迫；转录因子Gcn4通过下调核糖体蛋白合成基因，使得蛋白质合成能力受损，进而抑制翻译来延长酵母寿命。从中可以看出，菌株在抵御不同的胁迫时，所涉及的转录因子，以及该转录因子调控的代谢途径或路径是不同的。因此，菌株抵御不同的环境胁迫的机制是不同的，不同的环境胁迫下细胞的调控之间并不存在必然的联系。发明人实验室前期通过文献调研，挖掘了大量可能参与胁迫响应的转录因子，发现在胁迫条件下，与出发菌株相比，缺失一些转录因子的光滑球拟酵母的生长情况并没有发生显著变化。同时由于目前关于转录因子在光滑球拟酵母中的研究非常有限，其调控微生物抵御外界环境胁迫的具体机制并不十分清楚，当缺失或过表达转录因子后，有可能会影响细胞的完整性而使其在正常条件下的生长受到影响。因此，寻找一种可以调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的转录因子，并且其缺失或过表达对细胞的正常生长没有影响，对于提高光滑球拟酵母发酵生产有机酸的性能具有十分重要的意义。发明内容为了解决上述问题，本发明通过缺失转录因子的编码基因CgRDS2，使得光滑球拟酵母的抗低pH胁迫能力降低；通过过量表达转录因子的编码基因CgRDS2，使得光滑球拟酵母在低pH胁迫条件下的生存能力提高；同时，正常条件下，敲除或过表达CgRDS2并不影响菌株的生长，为提高光滑球拟酵母发酵生产有机酸的性能提供潜在策略。本发明的第一个目的是提供一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法，所述方法是缺失CgRDS2基因以降低菌株低pH胁迫抗性，或者过表达CgRDS2基因以增强菌株的低pH胁迫抗性。在一种实施方式中，所述方法通过过量表达本源转录因子的编码基因CgRDS2增强光滑球拟酵母抵抗渗透压胁迫的能力。在一种实施方式中，本发明通过缺失光滑球拟酵母CgRDS2基因，使菌株在渗透压胁迫条件下的生物量和细胞活性下降，从而降低菌株的生长能力。在一种实施方式中，所述CgRDS2基因含有geneID:2891470的核苷酸序列。在一种实施方式中，所述菌株是CandidaglabrataHTUΔ，基因型为his3Δtrp1Δura3Δ。在一种实施方式中，所述菌株是CandidaglabrataHTUΔ，基因型为his3Δtrp1Δura3Δ，已于YanDN,LinXB,QiYL,LiuH,ChenXL,LiuLM,ChenJ.2016.Crz1pregulatespHhomeostasisinCandidaglabratabyalteringmembranelipidcomposition.ApplEnvironMicrob82:6920-6929.论文中公开公开日：2016-12-31。在一种实施方式中，所述缺失突变具体是：1将标记基因与基因CgRDS2的左右臂连接起来，构建敲除框；2将步骤1的敲除框导入光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgRDS2替换成标记基因，3筛选获得缺失CgRDS2基因的菌株。在一种实施方式中，所述缺失突变具体是：将标记基因CgHIS3同基因CgRDS2的左右臂连接起来，构建敲除框，将测序正确的敲除框导入光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgRDS2替换成CgHIS3，利用重组后的菌株含有CgHIS3基因而能合成组氨酸这一特征筛选缺失CgRDS2基因的的突变菌株，经基因组PCR和测序验证正确的菌株即为缺失CgRDS2基因的菌株Cgrds2Δ。在一种实施方式中，所述过表达具体是：以强启动子启动转录CgRDS2基因。在一种实施方式中，所述强启动子为PTEF。在一种实施方式中，所述过表达是将CgRDS2基因连接到质粒pY26上，得到重组质粒pY26-CgRDS2，然后将重组质粒转化到酵母中。本发明的第二个目的是提供一种改变光滑球拟酵母胞内ATP含量的方法，所述方法是敲除或过表达基因CgRDS2。本发明的第三个目的是提供一种改变光滑球拟酵母细胞膜通透性的方法，所述方法是敲除或过表达基因CgRDS2。本发明还提供所述方法在光滑球拟酵母生产有机酸方面的应用。在一种实施方式中，所述有机酸包括但不限于丙酮酸、苹果酸、富马酸、α-酮戊二酸。本发明的有益效果：1光滑球拟酵母缺失CgRDS2基因后，与出发菌株相比，在低pH胁迫条件下细胞浓度可降低32.6％，细胞存活率下降56.9％，胞内ATP含量降低33.5％，细胞膜通透性降低23.6％；2光滑球拟酵母过表达CgRDS2基因后，与出发菌株相比，菌株在低pH胁迫条件下，细胞浓度没有显著变化，细胞存活率提高17.6％，胞内ATP含量提高41.5％，细胞膜通透性增加18.8％；3正常条件下，敲除或过表达CgRDS2并不影响菌株的生长。附图说明图1：基因缺失菌株的构建凝胶电泳图：A是构建敲除框的基因片段电泳图，其中，M为2000bpmarker，LM为基因CgRDS2左臂与组氨酸基因，LMR为基因CgRDS2左臂、组氨酸基因与基因CgRDS2右臂；B是菌落PCR验证，其中，M为5000bpmarker，+为阳性对照；-为阴性对照，泳道1表示阳性转化子的菌落PCR片段。图2：基因过表达菌株的构建凝胶电泳图：A是质粒pY26-CgRds2双酶切验证，其中，M为5000bpmarker，泳道1-4为不同阳性转化子中质粒pY26-CgRds2的双酶切验证条带，上方是pY26片段，大小为7430bp，下方是CgRds2，大小为1389bp；B是含有质粒pY26-CgRds2的菌落PCR验证，其中，M为2000bpmarker，泳道1-5为阳性转化子的菌落PCR片段，+为阳性对照。图3：各菌株在正常条件和不同pH值条件下的平板生长实验图。图4：各菌株在正常条件和pH2.0条件下的的生长曲线：A是正常条件下各菌株的生长曲线；B是pH2.0条件下各菌株的生长曲线。图5：各菌株在正常条件和pH2.0条件下细胞存活率的测定结果。图6：各菌株在正常条件和pH2.0条件下的胞内ATP含量的测定结果。图7：各菌株在正常条件和pH2.0条件下的细胞膜通透性的测定结果。图8：缺失菌株Cgrlm1Δ、Cgusv1Δ和Cgcst6Δ在正常条件和pH2.0条件下的平板生长实验图。图9：缺失菌株Cgrds2Δ在正常条件和5％乙醇、10mMH2O2条件下的平板生长实验图。具体实施方式实施例1：缺失菌株的构建以野生型光滑球拟酵母CandidaglabrataATCC2001基因组为模板，分别以P1P2、P3P4、P5P6为引物，扩增出待敲除基因的左臂L、组氨酸基因M和右臂R，经融合PCR构建敲除框CgRDS2-LMR图1。将测序正确的敲除框用电击转化法导入出发菌株CandidaglabrataHTUΔ基因型为his3Δtrp1Δura3Δ，已于YanDN,LinXB,QiYL,LiuH,ChenXL,LiuLM,ChenJ.2016.Crz1pregulatespHhomeostasisinCandidaglabratabyalteringmembranelipidcomposition.ApplEnvironMicrob82:6920-6929.论文中公开，公开日：2016-12-31，利用组氨酸标记基因来筛选阳性转化子，并提取基因组PCR测序验证。验证结果正确的菌株为缺失菌株Cgrds2Δ。P1：ATTCGAAGGCCCACTGTAP2：ACCCTCTTAACAAACGCCATGTCAAAAATATGATGCTGTGCTTAGP3：CACAGCATCATATTTTTGACATGGCGTTTGTTAAGAGGGTP4：ACTTGTCTATGCATATGTGTCTATGCTAGGACACCCTTAGTP5：CTAAGGGTGTCCTAGCATAGACACATATGCATAGACAAGTTATATACAP6：CCACTATTAGTGGCCCTAAATAAGT实施例2：过表达菌株的构建以野生型光滑球拟酵母CandidaglabrataATCC2001基因组为模板，以P7P8为引物扩增目的基因CgRDS2geneID:2891470，将扩增产物与质粒pY26用相同的限制性内切酶NotI和BglII消化，通过T4连接酶将基因CgRDS2与质粒pY26进行连接，质粒pY26是一个双向表达质粒，含有TEF和GPD两个启动子，将基因CgRDS2连接到质粒pY26上的TEF启动子后面，由PTEF启动转录，利用重组质粒上的URA3基因来筛选阳性转化子，最后提取质粒验证得到过表达菌株Cgrds2ΔCgRDS2图2。P7：AAGGAAAAAAGCGGCCGCATGGAAGAACCAGCAGCP8：GGAAGATCTTTAGTTGGAATGATCTCTTGTAGGA实施例3：各菌株生长性能的测定1平板生长实验：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB0.67％YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids,2％Glucose液体培养基中过夜活化，再转接到YNB培养基中培养至对数期，测定菌体浓度并将菌悬液调节至OD660＝1.0，以此为初始浓度，进行5次10倍梯度稀释，依次将4μL菌液点种在相应的固体YNB培养基上，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照图3。2生长曲线测性：将待测菌株的单菌落接种于20mL的YNB0.67％YeastNitrogenBasewithoutAminoAcids,2％Glucose液体培养基中过夜活化，再转接到100mL的YNB或者pH2.0的YNB液体培养基中，控制起始OD660＝0.1，30℃，200rpm摇床培养，每隔2小时取样测定OD值，绘制生长曲线图4。平板生长实验和生长曲线分析pH2.0对菌株wt出发菌株CandidaglabrataHTUΔ、Cgrds2Δ、Cgrds2ΔCgRDS2生长的影响。正常条件下，敲除或过表达CgRDS2并不影响菌株的生长；在pH2.0条件下，与出发菌株wt相比，敲除菌株Cgrds2Δ的细胞浓度降低了32.6％，而过表达菌株Cgrds2ΔCgRDS2的细胞浓度回补到出发菌株的水平。以上结果表明，基因CgRDS2能够调节细胞对低pH胁迫的耐受能力。实施例4：各菌株细胞存活率的测定将菌株wt、Cgrds2Δ、Cgrds2ΔCgRDS2单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，再转接到100mL的YNB液体培养基中，控制起始OD660＝0.1，30℃，200rpm摇床培养至对数期，添加不同浓度的盐酸调节培养基的pH值，30℃，200rpm培养1h后离心收集菌体，无菌水清洗菌体2次后重悬并稀释菌体。取相同数量不同条件下的菌液涂布于YNB平板上，30℃培养2-4天，观察各菌株的生长状态并计数。定义正常条件下细胞存活率为100％，则胁迫条件下细胞存活率＝胁迫平板上的菌落数正常平板上的菌落数×100％，最后绘制细胞存活率折线图。如图5所示，在pH2.0条件下，与出发菌株wt相比，敲除菌株Cgrds2Δ的细胞存活率降低了56.9％，而过表达菌株Cgrds2ΔCgRDS2的细胞存活率提高了17.6％。上述结果表明基因CgRDS2有利于光滑球拟酵母在pH2.0条件下生长。实施例5：各菌株胞内ATP含量的测定将菌株wt、Cgrds2Δ、Cgrds2ΔCgRDS2单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，再转接到100mL的YNB液体培养基中，控制起始OD660＝0.1，30℃，200rpm摇床培养至对数期，随后在无胁迫或者pH2.0胁迫条件下处理1h，各取500μL相同浓度的菌液置于预冷好的陶瓷研钵中，向研钵中加入500μLATP检测裂解液后立即加入液氮进行研磨，将研磨液收集在1.5mL离心管中，4℃，12000rpm离心后取上清用于ATP检测。具体检测步骤按照ATP检测试剂盒S0026，碧云天说明书进行。结果表明：如图6所示，在pH6.0条件下，与出发菌株wt相比，敲除菌株Cgrds2Δ中胞内ATP含量降低了18.4％；而回补菌株Cgrds2ΔCgRDS2中胞内ATP含量提高了17.4％；在pH2.0条件下，与出发菌株wt相比，敲除菌株Cgrds2Δ中胞内ATP含量降低了33.5％；而回补菌株Cgrds2ΔCgRDS2中胞内ATP含量提高了41.5％。说明光滑球拟酵母中转录因子CgRds2能够调节胞内ATP水平，并且在酸胁迫条件下的调节作用更加显著。实施例6：各菌株细胞膜通透性的测定将菌株wt、Cgrds2Δ、Cgrds2ΔCgRDS2单菌落接种于YNB液体培养基过夜培养，再转接到100mL的YNB液体培养基中，控制起始OD660＝0.1，30℃，200rpm摇床培养至对数期，随后在无胁迫或者pH2.0胁迫条件下处理1h，4℃，6000rpm离心收集菌体，菌泥经PBSNaCl8.0gL，KH2PO40.2gL，Na2HPO4·H2O2.9gL，KCl0.2gL缓冲液清洗后重悬，稀释至适当的浓度。取5mL稀释后的样品，平均分为两份，一份加入5μL碘化丙啶PI，立即避光反应5min，收菌清洗后用2.5mLPBS重悬细胞；另一份不做任何处理。用PBS缓冲液校对荧光分光光度计，随后在激发波长536nm和发射波长617nm条件下检测未染色和染色后细胞中的荧光值，并利用以下公式分析细胞膜通透性：PI吸收因子＝[FPBS+细胞+PI-FPBS+细胞][FPBS+PI-FPBS]，式中F表示荧光值。结果表明：如图7所示，在pH6.0条件下，三株菌的细胞膜通透性没有显著差别；而在pH2.0条件下，与出发菌株wt相比，敲除菌株Cgrds2Δ中细胞膜通透性降低了23.6％，而在回补菌株Cgrds2ΔCgRDS2中细胞膜通透性提高了18.8％。说明酸胁迫下CgRds2有助于维持细胞膜的通透性。对照例1：其他转录因子在酸胁迫条件下的生长情况采用实施例1中相同的策略，区别在于，将CgRDS2基因替换为其他因子CgRLM1geneID：2888539、CgUSV1geneID：2887354和CgCST6geneID：2889195，分别构建得到缺失菌株Cgrlm1Δ、Cgusv1Δ和Cgcst6Δ。对相应的缺失菌株在酸性条件下的生长情况进行检测。结果表明：如图8所示：在无胁迫和pH2.0胁迫条件下，与出发菌株wt相比，缺失菌株Cgrlm1Δ、Cgusv1Δ和Cgcst6Δ的生长情况没有发生显著变化。对照例2：缺失菌株Cgrds2Δ在其他胁迫环境下的生长情况采用实施例3中平板生长实验相同的策略，区别在于，将菌液点种在无胁迫以及含有5％乙醇和10mMH2O2的固体YNB培养基上，30℃培养2-3天，观察菌体的生长情况并拍照。结果表明：如图9所示，在无胁迫的YNB平板上，缺失菌株Cgrds2Δ与出发菌株wt的生长状况基本相同，表明敲除基因CgRDS2对光滑球拟酵母的生长没有显著影响；在添加5％乙醇和10mMH2O2的YNB平板上，与出发菌株wt相比，缺失菌株Cgrds2Δ的生长状况仅有轻微抑制，表明转录因子CgRds2在抵御乙醇和氧胁迫中的作用不显著。虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。SEQUENCELISTING江南大学一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法8PatentInversion3.3118DNA人工合成1attcgaaggcccactgta18245DNA人工合成2accctcttaacaaacgccatgtcaaaaatatgatgctgtgcttag45340DNA人工合成3cacagcatcatatttttgacatggcgtttgttaagagggt40441DNA人工合成4acttgtctatgcatatgtgtctatgctaggacacccttagt41548DNA人工合成5ctaagggtgtcctagcatagacacatatgcatagacaagttatataca48625DNA人工合成6ccactattagtggccctaaataagt25735DNA人工合成7aaggaaaaaagcggccgcatggaagaaccagcagc35834DNA人工合成8ggaagatctttagttggaatgatctcttgtagga34

权利要求：1.一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法，其特征在于，所述方法是缺失CgRDS2基因以降低菌株低pH胁迫抗性，或者过表达CgRDS2基因以增强菌株的低pH胁迫抗性。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述CgRDS2基因含有geneID:2891470的核苷酸序列。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述菌株是CandidaglabrataHTUΔ，基因型为his3Δtrp1Δura3Δ。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述缺失突变具体是：1将用于筛选的标记基因与基因CgRDS2的左右臂连接起来，构建敲除框；2将步骤1的敲除框导入光滑球拟酵母感受态细胞中，通过同源臂重组将基因CgRDS2替换成标记基因，3筛选获得缺失CgRDS2基因的菌株。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述过表达具体是：以强启动子启动转录CgRDS2基因。6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述强启动子为PTEF。7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述过表达是将CgRDS2基因连接到质粒pY26上，得到重组质粒pY26-CgRDS2，然后将重组质粒转化到酵母中。8.一种改变光滑球拟酵母胞内ATP含量的方法，其特征在于，所述方法是敲除或过表达基因CgRDS2。9.一种改变光滑球拟酵母细胞膜通透性的方法，其特征在于，所述方法是敲除或过表达基因CgRDS2。10.权利要求1-9任一所述方法在光滑球拟酵母生产有机酸方面的应用。

百度查询： 江南大学 一种调节光滑球拟酵母抵御低pH胁迫的方法

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