申请/专利权人：东营凤起生物科技发展有限公司

申请日：2018-10-06

公开（公告）日：2020-09-08

公开（公告）号：CN109172566B

主分类号：A61K31/357(20060101)

分类号：A61K31/357(20060101);A61K31/336(20060101);A61K31/352(20060101);A61P39/06(20060101);A61P39/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.08#授权;2019.02.12#实质审查的生效;2019.01.11#公开

摘要：本发明公开了一种玫瑰酸A在抗造血干细胞衰老方面的应用。造血干细胞经历自我更新、分化、衰老与死亡等复杂过程而维持机体终生血细胞产生；机体在衰老过程中造血系统的基本成分虽得以维持，但造血干细胞的功能和数量却逐渐降低，这导致机体造血功能降低、免疫功能衰退。本发明发现，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。

主权项：1.玫瑰酸A用于制备抗造血干细胞衰老的药物的用途。

全文数据：一种玫瑰酸A在抗造血干细胞衰老方面的应用技术领域本发明属于生物医药领域，涉及造血干细胞抗衰老，具体涉及一种玫瑰酸A在抗造血干细胞衰老方面的应用。背景技术造血干细胞经历自我更新、分化、衰老与死亡等复杂过程而维持机体终生血细胞产生。机体在衰老过程中造血系统的基本成分虽得以维持，但造血干细胞的功能和数量却逐渐降低，这导致机体造血功能降低、免疫功能衰退。目前认为衰老是一种与基因相关的疾病，抑癌基因p16是调控细胞衰老的关键基因。研究已经证实，细胞衰老时，p16基因的转录及蛋白质表达水平增高，抑制细胞有丝分裂，刺激发生反应而产生RB蛋白的磷酸化，从而维持了衰老细胞不可逆的生长停滞状态。抑制p16基因的转录及蛋白表达可以抑制细胞衰老。环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B和玫瑰酸D为重瓣玫瑰花中的成分，其化学结构如图1所示。目前尚未见这些化合物抗造血干细胞衰老的报道。发明内容本发明的目的在于提供一种玫瑰酸A在抗造血干细胞衰老方面的应用。本发明上述目的通过如下技术方案实现：玫瑰酸A用作p16基因转录抑制剂的用途。玫瑰酸A用于制备抗造血干细胞衰老的药物的用途。一种用于抗造血干细胞衰老的药物制剂，以玫瑰酸A为活性成分，制成药学上可以接受的剂型。有益效果：本发明发现，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。附图说明图1为各化合物结构式；图2为各组造血干细胞中p16mRNA表达水平；图3为各组造血干细胞SA-β-Gal染色结果；图4为各组造血干细胞混合集落培养结果。具体实施方式下面结合实施例具体介绍本发明实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。一、实验材料健康清洁级C57BL6J小鼠，雌雄各半，6～8周龄，体重18～20g，由中国药科大学动物中心提供。环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B和玫瑰酸D自制，纯度≥98％，干燥保存。Anti-Sca-1MicroBeadKit购自Miltenyi公司。SA-β-GalStainingKit购自CellSignaling公司。甲基纤维素培养基MethoCultGFM3434购自StemCell公司。二、实验方法1、造血干细胞衰老模型制备及分组干预C57BL6J小鼠随机分为对照组、模型组和给药组包括环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B和玫瑰酸D给药组，每组24只。模型组和给药组小鼠采用X线3.0Gy全身均匀照射照射能量6MeV，照射源距动物的高度为100cm，照射面积为25cm×25cm，每次照射1min每10天1次，共8次。给药组于照射当日分别灌胃给予环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A、玫瑰酸B或玫瑰酸D50mgkg，对照组和模型组灌胃给予等容量0.5％CMC-Na，隔天1次，共40次。末次照射后第10天处死。2、造血干细胞分离与纯化无菌条件下取出小鼠股骨及胫骨，分离骨髓单个核细胞MNCs。采用抗Sca-1+免疫磁珠分选干细胞。取2～5×107个MNCs加入90μLBuffer和10μLAnti-Sca-1-FITC抗体，4℃孵育15min，离心弃上清，加入80μLBuffer和20μLAnti-FITCMicroBeads，4℃孵育25min，离心弃上清，0.5mLBuffer重悬细胞，加入磁性分离柱内，分选柱用Buffer洗涤3次，加入0.5mLBuffer收集Sca-1+细胞，即分离纯化得到造血干细胞。用流式细胞仪检测Sca-1+细胞比例即为造血干细胞的纯度。3、RT-PCR检测p16mRNA表达采用Trizol方法提取各组造血干细胞的总RNA，检测完整性。取1μg总RNA，用AMV逆转录酶进行逆转录，逆转录产物PCR扩增，以GAPDH为内参，检测p16mRNA表达。引物序列如下。PCR反应体系：反转录产物1μL、Taq酶5uμL0.45μL、dNTPs10mmo1L1μL、含15mmolLMg2+缓冲液5μL，GAPDH的上、下游引物各1μL，p16上、下游引物各1μL，用灭菌水补充至50μL。PCR反应条件为：93℃，30s；94℃，3min；64℃，30s；71℃，1min；35个循环，71℃，7min。以p16灰度值GAPDH灰度值之比表示p16mRNA的相对值。p16mRNA上游引物：5′-CCATGTCCAAAAGTGGTGTAAT-3′p16mRNA下游引物：5′-ATGGATGCATTGAGTGAAGTA-3′GAPDH上游引物：5′-GACGCCTATCGGTTAGTC-3′GAPDH下游引物：5′-GAACTGTGCGTCTCTGTC-3′4、造血干细胞衰老指标检测SA-β-Gal染色：收集各组1×105个造血干细胞，加Fixative工作液1mL充分混匀，固定10min；PBS洗涤2次，加入含SolutionA，SolutionB，StainingSolution三者的工作液1mL混匀，37℃、无CO2条件下孵育16h，甘油封片镜检，以随机计数的400个细胞中阳性细胞的个数计算阳性细胞率。混合集落培养：收集各组1×104个造血干细胞，离心弃上清，加甲基纤维素半固体培养基1mL混匀，接种于96孔板，在37℃、5％CO2及饱和湿度培养箱孵育10～12d，依接种造血干细胞数量与形成混合集落形成单位CFU-Mix的数量评价造血干细胞的多向分化能力。5、统计学分析采用SPSS19.0统计学软件，实验重复3次，数据资料用均值±标准差表示，样本均数比较采用组间t检验。P0.05为差异有显著性意义。三、实验结果1、造血干细胞纯度检测分离纯化后Sca-1+细胞纯度达90.55±7.24％，提示分选的Sca-1+HSCs纯度较高。2、各组造血干细胞中p16mRNA表达水平结果如表1和图2所示，与对照组相比，模型组造血干细胞中p16mRNA表达水平显著升高，说明p16与造血干细胞衰老有关；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组造血干细胞中p16mRNA表达水平显著降低，说明环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A和玫瑰酸D通过抑制p16转录抑制了造血干细胞的衰老。玫瑰酸B对p16转录水平无明显影响。表1各组造血干细胞中p16mRNA表达水平3、各组造血干细胞SA-β-Gal染色结果各组造血干细胞SA-β-Gal染色阳性百分比如表2和图3所示，与对照组相比，模型组SA-β-Gal染色阳性百分比显著升高；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组SA-β-Gal染色阳性百分比显著降低；玫瑰酸B给药组SA-β-Gal染色阳性百分比与模型组比较无显著差异。表2各组造血干细胞SA-β-Gal染色结果4、各组造血干细胞混合集落培养结果各组造血干细胞CFU-Mix如表3和图4所示，与对照组相比，模型组CFU-Mix显著降低；与模型组相比，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A和玫瑰酸D给药组CFU-Mix显著升高；玫瑰酸B给药组CFU-Mix与模型组比较无显著差异。表3各组造血干细胞混合集落培养结果上述结果表明，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以通过抑制p16基因转录抵抗造血干细胞衰老，环氧胡萝卜烯醛A、环氧胡萝卜烯醛B、玫瑰酸A或玫瑰酸D可以制成p16基因转录抑制剂和抗造血干细胞衰老的药物。

权利要求：1.玫瑰酸A用作p16基因转录抑制剂的用途。2.玫瑰酸A用于制备抗造血干细胞衰老的药物的用途。3.一种用于抗造血干细胞衰老的药物制剂，其特征在于：以玫瑰酸A为活性成分，制成药学上可以接受的剂型。

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