申请/专利权人：江南大学

申请日：2017-05-16

公开（公告）日：2020-09-11

公开（公告）号：CN106967766B

主分类号：C12P19/20(20060101)

分类号：C12P19/20(20060101);C12P19/18(20060101);C12P19/04(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.11#授权;2017.08.15#实质审查的生效;2017.07.21#公开

摘要：本发明公开了一种葡萄糖基‑α‑环糊精的制备方法，该方法包括如下步骤：1将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入CGTase酶，反应12‑24h；2采用物理的方法使酶活降低至0.001‑1.0U；3向步骤2的反应体系中加入糖化酶，反应12‑24h，然后高温灭酶，制得含有葡萄糖基‑α‑环糊精的混合物；4利用高效液相的方法对步骤3所得到的混合物进行分离纯化，最终制得所述葡萄糖基‑α‑环糊精。本发明方法反应条件温和，同时利用CGTase微弱的耦合活力水解掉环状糊精及未反应的底物，从而得到高纯度葡萄糖基‑α‑环糊精。

主权项：1.一种葡萄糖基-α-环糊精的制备方法，其特征在于所述方法包括如下具体步骤：（1）将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入CGTase酶，在温度为35-60℃，pH为4.0-6.5的条件下反应12-24h；所述CGTase酶的添加量为0.1-0.5U；（2）采用物理的方法使酶活降低至0.001-0.003U；（3）向步骤（2）的反应体系中加入糖化酶，在温度为30-50℃，pH为4.0-6.5的条件下反应12-24h，然后高温灭酶，制得含有葡萄糖基-α-环糊精的混合物；所述糖化酶添加量为0.5-1.0U；（4）利用高效液相的方法对步骤（3）所得到的混合物进行分离纯化，最终制得所述葡萄糖基-α-环糊精。

全文数据：一种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法技术领域[0001]本发明涉及环糊精的合成技术领域，尤其是涉及一种通过双酶复合水解制备葡萄糖基-a-环糊精的方法。背景技术[0002]环糊精也称作环麦芽寡糖，是由若干a-D吡喃葡萄糖单元通过a-14糖苷键链接而成的一类低聚糖的总称。环糊精因其水溶性较差、具有较高的溶血性和肾毒性导致其应用收到严重的限制，因此对环糊精的改性十分必要。[0003]环糊精的改性方法有化学法或生物酶的方法来修饰环糊精，将某些特定的取代基接枝到环糊精上，这种在保留环糊精空腔结构基本不变的情况下引入取代基团而得到的改性产物，通常称之为修饰环糊精，或改性环糊精，或环糊精衍生物。当取代基为糖基时，通常将其称之为分支环糊精，如葡萄糖基环糊精、麦芽糖基环糊精、半乳糖基环糊精和甘露糖环糊精等。多数的改性环糊精水溶性好、毒性低，具有更加广阔的应用前景。[0004]葡萄糖基_a-环糊精的研究主要集中在1984年，Kobayashi等研究了一种采用BME的限制反应作用于蜡质玉米淀粉得到分支寡糖的方法，然后在SDS的存在下用BME作用于分支寡糖，在葡萄糖淀粉酶和Taka-amylaseA的联合作用下得到了Gi-a-CD。之后的报道几乎没有。[0005]随后，Watanabe等设计了一种制备高产。^^^的新方法。这种方法包括两个步骤:普鲁兰酶将麦芽糖和a-CD缩合成G2-a-CD以及G2-a-CD在葡萄糖淀粉酶作用下水解，由于葡萄糖淀粉酶将G2-a-CD水解为Gn-CD，普鲁兰酶缩合反应的平衡偏向麦芽糖基a-CD的合成，其结果导致分支率的增加。发明内容[0006]针对现有技术存在的上述问题，本发明申请人提供了一种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法。本发明方法反应条件温和，同时利用CGTase微弱的耦合活力水解掉环状糊精及未反应的底物，从而得到高纯度葡萄糖基-a-环糊精。[0007]本发明的技术方案如下：[0008]—种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：[0009]1将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入CGTase酶，在温度为35-6TC，pH为4.0-6.5的条件下反应12-2411;[0010]2采用物理的方法使酶活降低至o.ooi-i.〇u;[0011]⑶向步骤2的反应体系中加入糖化酶，在温度为30-50°C，pH为4.0-6.5的条件下反应12-24h，然后高温灭酶，制得含有葡萄糖基-a-环糊精的混合物；[0012]⑷利用高效液相的方法对步骤3所得到的混合物进行分离纯化，最终制得所述葡甸糖基-a-环糊精。[0013]步骤⑴中所述磷酸盐缓冲液的浓度为i〇-5〇mM，pH为4.0_6.5。[0014]步骤⑴中所述麦芽糊精的质量浓度为1%_5%。[0015]步骤⑴中所述CGTase酶的添加量为0.1-0.5U。[0016]步骤⑵中所述物理方法为80-100°C水浴加热。^[0020]本发明利用了CGTase的微弱的耦合活力打破副产物环状糊精的环状结构，#糖化酶的作用下将己经开环的环状结构进行水解，环状结构在CGTase和糖化酶的共同作用下边开环，边水解，最终将副产物环状的环糊精水解为小分子的葡萄糖。从而实现基-a-环糊精的有效分离。[0021]本发明主要利用了CGTase的环化活力来制备葡萄糖基-a-环糊精，然后加入的糖化酶可以促进CGTase酶反应向着耦合活力的方向进行，从而将副产物环状糊精水解为葡胃糖，实现了葡萄糖基-a_环糊精的有效分离。附图说明[0022]图1为本发明实施例6中制得的葡萄糖基-a-环糊精高效液相图谱；[0023]图2为本发明实施例6中制得的葡萄糖基-a-环糊精的二级质谱图。具体实施方式[0024]下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。[0025]实施例i[0026]—种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：[0027]⑴取l〇mg的麦芽糊精2mL离心管中，加入lmLpH5.520mM的磷酸盐缓冲溶液，加入0•36U的CGTase，在60°C反应条件下反应12h;[0028]⑵在100°C水浴条件下保温15min;[0029]⑶利用高效液相的方法对步骤⑵所得产物进行分离纯化，最终得到〇.19mg葡萄糖基-a-环糊精。[0030]实施例2[0031]一种葡萄糖基-a_环糊精的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：[0032]⑴取lOmg的麦芽糊精2mL离心管中，加入lmLpH5.520mM的磷酸盐缓冲溶液，加入0.36U的CGTase，在6TC反应条件下反应12h;[0033]2向反应体系中加入〇.72U糖化酶，45。：的反应条件下反应12h，在l〇TC的条件下保温15min;[0034]3利用高效液相的方法对步骤2所得产物进行分离纯化，最终得到〇mg葡萄糖基-a-环糊精。[0035]实施例3[0036]一种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：[0037]⑴取10mg的麦芽糊精2mL离心管中，加入imLpH6.020mM的磷酸盐缓冲溶液，加入0_1U的CGTase，在6TC反应条件下反应12h;[OO38]⑵8TC水浴加热25min，使CGTase的酶活至0.001U;[0039]⑶向反应体系中加入0.5U糖化酶，45°C的反应条件下反应1此，在10TC的条件^保温15tnin，制得含有葡萄糖基-a-环糊精的混合物；”[0040]⑷利用高效液相的方法对步骤⑶所得产物进行分离纯化，最终得到〇.23葡萄糖基-a-环糊精。[0041]实施例4[0042]—种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：[0043]1取10mg的麦芽糊精2mL离心管中，加入lmLpH5.520mM的磷酸盐缓冲溶液，加入0.5U的CGTase，在6TC反应条件下反应12h;’[0044]290°C水浴加热5min，使CGTase的酶活至0.01U;[0045]⑶向反应体系中加入1.0U糖化酶，45°C的反应条件下反应12h，在10TC的条件下保温15min，制得含有葡萄糖基-a-环糊精的混合物；’、[0046]⑷利用高效液相的方法对步骤〇3所得产物进行分离纯化，最终得到〇.32mg葡萄糖基-a-环糊精。[0047]实施例5[0048]—种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：[0049]⑴取50mg的麦芽糊精2mL离心管中，加入lmLpH5.520mM的碟酸盐缓冲溶液，加入0•36U的CGTase，在35°C反应条件下反应24h;[0050]⑵l〇TC水浴加热5min，使CGTase的酶活至0.003U;[0051]3向反应体系中加入0.72U糖化酶，50°C的反应条件下反应24h，在l〇TC的条件下保温15min，制得含有葡萄糖基-a-环糊精的混合物；[0052]⑷利用高效液相的方法对步骤⑶所得产物进行分离纯化，最终得到〇.16mg葡萄糖基-a-环糊精。[0053]实施例6[OOM]—种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法，所述方法包括如下具体步骤：[0055]1取10mg的麦芽糊精2mL离心管中，加入lmLpH5.52〇mM的磷酸盐缓冲溶液，加入0.36U的CGTase，在60°C反应条件下反应12h;[0056]⑵8〇°C水浴加热lOmin，使CGTase的酶活至0.003U;[0057]3向反应体系中加入0.72U糖化酶，45°C的反应条件下反应12h，在100°C的条件下保温15min，制得含有葡萄糖基-a-环糊精的混合物；[0058]4利用高效液相的方法对步骤3所得产物进行分离纯化，最终得到〇.44mg葡萄糖基-a-环糊精。将本发明实施例所得葡萄糖基-a-环糊精的高效液相图谱和二级质谱图分别如图1、2所示。[0059]由图1可以看出，副产物环状糊精几乎完全被CGTase和糖化酶水解为葡萄糖，本发明方法可以得到相对纯度较高的葡萄糖基-a-环糊精。[0060]由图2为所得样品的二级质谱图，其中的值为1133.6,与葡萄糖基-a-环糊精的相对分子质M—致，可以确定此样品为葡萄糖基-a-环糊精。

权利要求：1.一种葡萄糖基-a-环糊精的制备方法，其特征在于所述方法包括如下具体步骤：⑴将麦芽糊精溶于磷酸盐缓冲液中，加入CGTase酶，在温度为35-60°C，pH为4•0_6•5的条件下反应12_24h;⑵采用物理的方法使酶活降低至0•001-1.0U;3向步骤2的反应体系中加入糖化酶，在温度为30-5TC，pH为4•0-6.5的条件下反应12-24h，然后高温灭酶，制得含有葡萄糖基-a-环糊精的混合物；⑷利用高效液相的方法对步骤3所得到的混合物进行分离纯化，最终制得所述葡萄糖基-a-环糊精。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1中所述磷酸盐缓冲液的浓度为10-50mM，pH为4•0-6•5〇3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤1中所述麦芽糊精的质量浓度为1%-5%〇4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤（1中所述CGTase酶的添加量为0.1-0.5U。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤2中所述物理方法为80_100°〇水浴加热。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3中所述的糖化酶采用磷酸盐缓冲液稀释至0.5-1.0111^，其中磷酸盐缓冲液浓度为1-501111\1。胃7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤3中所述糖化酶添加量为0•5一1.0U〇

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