申请/专利权人：安徽农业大学

申请日：2019-07-24

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN111663005A

主分类号：C12Q1/70(20060101)

分类号：C12Q1/70(20060101);C12Q1/6851(20180101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.04.21#发明专利申请公布后的驳回;2020.10.13#实质审查的生效;2020.09.15#公开

摘要：本发明公开了一种用于检测猪细小病毒6型的荧光定量PCR方法，包括如下步骤：S1、制备特异性引物；根据GenBankPPV6的Cap基因序列，登录号：KU563733.1，应用PrimerPremier5.0软件设计一对特异性引物如下：F：5’‑GAAAAAGAACAGGCGCAGAC‑3’，R：5’‑GGGATTATGAAGCCAGACG‑3’；S2、重组质粒标准品制备并提取DNA；取适量采集的淋巴结、脾、肺等组织加入含青霉素和链霉素各1000IUml的PBS匀浆用研钵充分碾磨；反复冻融3次，6000rmin离心10min，取上清液，置于‑80℃冰箱待用；将制备好的样品按照DNARNA提取试剂盒使用说明书提取DNA；本发明提供一种能够快速、简便、灵敏地检测猪细小病毒6型的方法；本发明根据Cap基因设计特异性引物，建立了一种基于SYBRGreenI的real‑time荧光定量PCR检测方法。

主权项：1.一种用于检测猪细小病毒6型的荧光定量PCR方法，其特征在于：包括如下步骤：S1、制备特异性引物；根据GenBankPPV6的Cap基因序列，登录号：KU563733.1，应用PrimerPremier5.0软件设计一对特异性引物如下：F：5’-GAAAAAGAACAGGCGCAGAC-3’，R：5’-GGGATTATGAAGCCAGACG-3’；S2、重组质粒标准品制备并提取DNA；取适量采集的淋巴结、脾、肺等组织加入含青霉素和链霉素各1000IUml的PBS匀浆用研钵充分碾磨；反复冻融3次，6000rmin离心10min，取上清液，置于-80℃冰箱待用；将制备好的样品按照DNARNA提取试剂盒使用说明书提取DNA；S3、PCR扩增；利用特异性引物用对提取的DNA模板进行PCR扩增，扩增条件95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃20s，30个循环；72℃10min；S4、扩增检测处理；对PCR产物进行处理，并对鉴定为阳性的重组质粒进行测序；S5、荧光定量PCR方法的建立；将提取的质粒模板进行10倍梯度稀释作为标准品模板，制作标准曲线；S6、灵敏度检测；以10倍梯度稀释的8个梯度4.78×101copiesμL～4.78×108copiesμL的标准质粒为模板进行qPCR扩增，同时进行普通PCR；观察qPCR最低检出模板拷贝浓度，并于普通PCR比较分析；S7、特异性检测；采用猪细小病毒7型PPV7、猪圆环病毒2型PCV2、猪圆环病毒3型PCV3、猪流行性腹泻病毒PEDV、猪蓝耳病毒PRRSV和猪伪狂犬病毒PRV中任一或多种组合的猪DNA或RNA病毒进行qPCR检测特异性对其进行了评价，并以ddH2O作为阴性对照。

全文数据：

权利要求：

百度查询： 安徽农业大学 一种用于检测猪细小病毒6型的荧光定量PCR方法

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