申请/专利权人：中国水稻研究所

申请日：2019-06-11

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN110184286B

主分类号：C12N15/54(20060101)

分类号：C12N15/54(20060101);C12N15/82(20060101);C12N15/66(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/46(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.15#授权;2019.09.24#实质审查的生效;2019.08.30#公开

摘要：本发明提供了OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用，涉及基因功能验证技术领域，本发明所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。在本发明实施例中，所述OsMPK15通过调节PRs和SAJA相关基因的表达以及ROS爆发来负调控对不同稻瘟菌和Xoo菌株的抗性。此外，OsMPK15的敲除也导致粒长增加。

主权项：1.OsMPK15基因在调控水稻主要病害抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080；所述病害为水稻稻瘟病和白叶枯病；所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性。

全文数据：OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用技术领域本发明属于基因功能验证技术领域，具体涉及OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用。背景技术植物已经进化出两层免疫系统以抵御病原体的攻击，包括模式识别受体PRRs触发免疫反应PTI和特定病原体的效应子触发的免疫反应ETI，ETI通过识别特异性的细胞质抗性蛋白激活。通常抗病反应的激活需要三个步骤：一是细胞外信号的感知；二是向细胞的传递以及最后通过磷酸化激活防御反应；这三个步骤在防御信号传导中起着重要作用。其中丝裂原活化蛋白激酶MAPK级联反应是研究相对透彻和保守的信号传导途径之一，其在植物生长发育以及非生物和生物应激反应中起着至关重要的作用。植物MAPK级联信号传导模块由三种功能上相互交织的蛋白激酶组成，包括MAPK激酶激酶MPKKK，MAPK激酶MPKK和MAPK，基本过程是MPKKK磷酸化并激活MPKK，MPKK反过来磷酸化并激活MAPK。通常活化后的MAPK进入细胞核并与特定的下游组分如转录因子相互作用。到目前为止，根据水稻基因组数据库通过计算机搜索已经确定了至少17种水稻MAPK，但大部分成员尚待功能鉴定。发明内容有鉴于此，本发明的目的在于提供OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用，OsMPK15基因负调控水稻稻瘟病和白叶枯病的抗性，同时敲除所述OsMPK15基因后显著增加了粒长。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了OsMPK15基因在调控水稻对疾病抗性中的应用，所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。优选的，所述疾病包括稻瘟病和水稻白叶枯病。优选的，所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对稻瘟病和水稻白叶枯病的抗性。本发明还提供了所述OsMPK15基因在调控水稻粒长中的应用。本发明还提供了OsMPK15蛋白在调控水稻抗性中的应用，所述OsMPK15蛋白由所述OsMPK15基因转录翻译得到。本发明还提供了所述OsMPK15蛋白在调控水稻粒长中的应用。本发明还提供了包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻抗性中的应用。优选的，所述重组载体的制备方法，包括：将所述OsMPK15基因的全长ORF克隆至以玉米泛素启动子修饰的pCAMBIA1301载体中，得重组载体pCAMBIA1301-Ubi::OsMPK15。本发明还提供了所述包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻粒长中的应用。本发明提供了OsMPK15基因在调控水稻抗性中的应用，所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。本发明实施例中构建了OsMPK15的敲除和过表达突变体，并在不同真菌和细菌菌株接种下研究其抗病性。敲除突变OsMPK15mpk15后导致病程相关PRs基因的组成型表达，由病原体相关分子模式PAMP激发子几丁质诱导的活性氧ROS积累，并显著增强了对不同稻瘟病和白叶枯病生理菌株的抗性。稻瘟菌和白叶枯菌分别是引起水稻稻瘟病和白叶枯病的致病菌株。相反，在过表达OsMPK15OsMPK15-OE家系中，PR基因和ROS的表达显著下调。同时，植物激素如水杨酸SA和茉莉酸JA在mpk15突变体系中积累，但在OsMPK15-OE家系中减少。在mpk15突变体中SA和JA途径相关基因的表达显著上调，而在OsMPK15-OE家系中则表现为显著下调。因此OsMPK15可能通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对水稻稻瘟病M.oryzae和白叶枯病Xoo抗性。此外，OsMPK15可能通过牺牲抗病性来正向调节水稻产量，OsMPK15的敲除也导致粒长增加。附图说明图1为本发明制备得到的mpk15突变体和OsMPK15-OE家系；图2为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的表型比较；图3为OsMPK15负调控对水稻稻瘟菌的抗病性；图4为OsMPK15负调控对水稻白叶枯病的抗性；图5为mpk15突变体中ROS积累和SAJA激素含量增加；图6为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系中防卫基因的表达模式；图7为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的农艺表型；图8为WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的粒长和粒宽。具体实施方式本发明提供了OsMPK15基因在调控水稻对疾病抗性中的应用，所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。本发明所述OsMPK15基因含有TDY磷酸化位点，可编码498个氨基酸。本发明所述疾病优选包括稻瘟病M.oryzae和白叶枯病Xoo。本发明所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对稻瘟病和水稻白叶枯病的抗性。本发明还提供了所述OsMPK15基因在调控水稻粒长中的应用。在本发明中，敲除所述OsMPK15基因可增加粒长。本发明还提供了OsMPK15蛋白在调控水稻对疾病抗性中的应用，所述OsMPK15蛋白由所述OsMPK15基因转录翻译得到。本发明所述OsMPK15蛋白对调控水稻广谱抗性的分子机理与所述OsMPK15基因相同，在此不再赘述。本发明还提供了所述OsMPK15蛋白在调控水稻粒长中的应用。本发明所述调控的机理与所述OsMPK15基因相同，在此不再赘述。本发明还提供了包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻对疾病抗性中的应用。本发明所述重组载体的制备方法，优选包括：将所述OsMPK15基因的全长ORF克隆至玉米泛素启动子驱动的经过修饰的pCAMBIA1301载体中，得重组载体pCAMBIA1301-Ubi::OsMPK15。本发明还提供了所述包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻粒长中的应用。本发明所述调控的机理与所述OsMPK15基因相同，在此不再赘述。下面结合实施例对本发明提供的OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1CRISPRCas9编辑得到mpk15突变体和OsMPK15-OE家系使用CrisprCas9编辑系统得到mpk15突变体。OsMPK15LOC_Os11g17080的靶序列设计为TTCCTCTATCAGTTGCTTCGAGG。mpk15突变体通过测序验证是纯合的。将OsMPK15的全长ORF克隆到玉米泛素启动子修饰的pCAMBIA1301载体中，得到pCAMBIA1301-Ubi::OsMPK15质粒。然后将重组质粒导入水稻栽培品种中花11ZH11得到OsMPK15过表达OsMPK15-OE家系。转基因水稻在自然条件下在转基因田生长。测序分析表明两个mpk15突变体纯合家系插入“A”或“T”分别导致移码突变图1中A。对于过量表达OsMPK15，将完整的OsMPK15基因ORF序列构建到玉米泛素启动子控制下的修饰后的双元载体中图1中B，重组载体通过农杆菌转化至水稻品种ZH11。选择两个表达量比野生型高173.1和104.5倍的家系OE-17和OE-19图1中C。在每个生长阶段，都没有观察到OsMPK15-OE与野生型植物在幼苗期和成株期有任何显著变化图2中A。在剑叶、倒二叶和倒三叶时期，WT中发现了轻微的类病斑，而在田间条件下mpk15突变体中没有类病斑。然而在OsMPK15-OE家系的倒三叶中观察到白叶枯病斑图2中B。实施例2OsMPK15在水稻稻瘟病抗性中的作用参照OverexpressionofMoSM1,encodingforanimmunity-inducingproteinfromMagnaportheoryzae,inriceconfersbroad-spectrumresistanceagainstfungalandbacterialdiseaseHong,Y.,Yang,Y.,Zhang,H.,Huang,L.,Li,D.,andSong,F.2016.中方法评估苗期的稻瘟病抗性：用30日龄的水稻幼苗喷雾接种稻瘟菌株46-2和RB22的孢子。稻瘟菌株在燕麦琼脂培养基上生长10天，10天后收集分生孢子并将其浓度调节至105个mL，添加0.02％吐温-20。然后离体叶片接种：使用移液管尖端在每片叶子上的三个点处滴加5μL孢子悬浮液。将接种的叶子在25℃，100％湿度下在黑暗中保持24小时，然后在25℃，12小时光照12小时黑暗循环正常条件下生长。在接种后6天dpi测量病斑长度。结果如图3中A和图3中B所示，在接种菌株46-2和RB22后，OsMPK15-OE家系OE-17和OE-19上的典型的稻瘟病斑表型比野生型更严重。在OsMPK15-OE和野生型植物的叶上观察到典型的稻瘟菌病斑，而在mpk15突变体家系的叶片上几乎没有观察到典型的稻瘟病斑图3中A，图3中B。在接种稻瘟菌后6天，OsMPK15-OE家系接种叶片的平均病斑直径比野生型增加了2.14至2.41倍，而mpk15突变植物的接种叶片的病斑直径与WT相比减少了60.5％至68.9％图3中D。使用qRT-PCR方法通过测定稻瘟菌28SrDNA的基因组DNA水平间接计算稻瘟菌DNA量，并且通过比较基因组真菌28SrDNA水平与水稻OsEF1基因组DNA获得的比率表示稻瘟菌相对生长量。通过稻瘟菌28SrDNA基因组DNA水平测定表明，OsMPK15-OE家系在接种的叶子中具有更多的稻瘟菌含量，与WT相比增加了7.60至9.92倍，而mpk15突变体植物减少了81.71％至89.15％。即mpk15突变体增加了水稻稻瘟病的抗性，而OsMPK15-OE表现出增加了对水稻稻瘟菌的感病性。实施例3OsMPK15在水稻白叶枯病抗性中的作用通过剪叶法对3个月大的OsMPK15-OE和mpk15突变体家系接种两个白叶枯菌株：菲律宾白叶枯菌株PXO96和中国白叶枯菌浙江菌株Zhe817，并将接种后的水稻在白天30℃和夜晚25℃、保持适当的湿度的温室中发病，接种15天后通过测量病斑长度来评价其对白叶枯病的抗性。结果如图4中A和4中B所示，与WT相比，mpk15突变体家系整体发病不太严重，而OsMPK15-OE发病严重。PXO96菌株接种后的mpk15突变体的剑叶病斑平均长度分别为3.68和4.81cm，分别为WT的51.47％和62.82％，而OsMPK15-OE家系分别为18.98和13.32cm，与WT9.90cm相比，增加了34.45％和91.58％图4中C。表明mpk15突变体显著增加了对白叶枯病的抗性，而OsMPK15-OE家系显示出增加了对白叶枯菌的感病性。实施例4ROS的测量将三个月大的水稻叶片用打孔器打出叶盘在无菌蒸馏水中孵育过夜消除损伤。使用鲁米诺化学发光测定法测定几丁质处理后的ROS产生曲线。将每个编号的三个叶盘置于含有100μL鲁米诺WakoPureChemicalCorporation的L-012，1.0μL辣根过氧化物酶Sigma的1.5mL微量离心管中，加入1.0μL激发子800nM几丁质，水作为模拟对照立即在Glomax2020发光计Promega中，每10秒记录发光读数，并连续记录读数20分钟。每个样品至少进行3次生物学重复。结果如图5所示，对于几丁质处理，mpk15突变体家系中的ROS积累显著高于WT，而OsMPK15-OE家系中的积累显著低于WT。在几丁质处理后约5分钟和6分钟出现峰值ROS水平图5中A。在mpk15突变体系中几丁质处理的ROS积累是WT中的1.56倍，而OsMPK15-OE系在峰值时间仅具有WT的58.3％图5A中。相反，对照处理后不同品系均保持在基础ROS水平。通过使用3'-3'-二氨基联苯胺DAB染色定量内源性H2O2也证实了这一发现图3中C。这些结果表明几丁质触发的ROS积累在OsMPK15-OE家系中被抑制而在mpk15突变体家系中增加。实施例5SA和JA测定在正常条件下测定了4周龄OsMPK15-OE，mpk15突变体和WT中的内源SA和JA水平通过HPLC-MS系统12906460型，Agilent进行SA和JA的定量，其中稳定同位素标记的SA和JA作为内标。每次测量三次重复。结果显示，mpk15家系中的SA水平比WT中的SA水平高1.69至1.98倍，而OsMPK15-OE系分别与WT相比降低了36.69％和22.06％图5中B。类似地，与WT相比，mpk15突变体家系中的内源JA水平分别增加了41.47％和24.06％，而OsMPK15-OE家系分别减少了78.87％和71.91％。这些结果表明，在正常条件下，OsMPK15-OE家系中SA和JA积累减少，而mpk15家系中SA和JA积累增加。实施例6实时定量PCR表达分析使用TRIzol试剂Invitrogen，Shanghai，China提取相同发育阶段的WT、mpk15突变体和OsMPK15-OE家系的总RNA，使用PrimeScriptRT试剂盒合成第一链cDNA。使用LightCycler480II实时PCR系统Roche，USA将0.5μLcDNA用于qRT-PCR的模板。OsActin基因LOC_Os03g50885用作内部对照。基因特异性引物列于表1中。对每种表达评估进行三次独立的生物学和技术重复。表1引物名称及序列分析4周龄mpk15突变体，OsMPK15-OE和WT中PR4，PR5，PR8，PR10和PAL的表达模式，结果如图6中A所示，在mpk15突变体家系中PR4，PR5，PR8，PR10和PAL的表达水平其中PAL是SA生物合成基因显著上调，分别是WT的9.85、4.15、3.41、4.94和2.23倍，而在OsMPK15-OE家系中该基因都保持非常低的水平WT的8.9％至89％。此外，MAPK级联翻译中枢基因包括MAPK3和MAPK6的表达，SA信号标记基因WRKY45，以及JA生物合成基因LOX，OPR1，AOS1，AOS2和AOS4。MAPK3、MAPK6和WRKY45在mpk15突变体家系中显著上调并在OsMPK15-OE家系中被抑制图6中B。在mpk15突变体家系中，包含LOX和OPR1的JA生物合成基因显著上调，显示比WT高出2.61和6.78倍，而其他JA生物合成基因如AOS1，AOS2和AOS4则略有上调，显示比WT增加1.46至2.36倍；而它们在OsMPK15-OE家系中被抑制图6中B，与mpk15突变体中升高的SA和JA含量表现一致。这些结果表明OsMPK15可能在调节针对稻瘟菌和Xoo的SA和JA信号传导途径中起负调控作用。实施例7农艺性状比较在田间条件下检查不同水稻家系的株高和分蘖数。将收获的谷物风干并在室温下储存一个月。使用常规方法选择每个品系的20个随机主穗，用于穗重、每穗总数、结实率和单株产量的测量。使用自动种子考种及千粒重分析系统万深SC-G，中国杭州计算来自WT、mpk15突变体、OsMPK15-OE植株的千粒重、粒长和粒宽。至少三次重复。结果显示，OsMPK15-OE家系的株高高于WT图2中A，图7中A。此外，OsMPK15-OE家系的每穗粒数和穗长均高于WT，而mpk15突变体比WT少图2中C，图2中D。即mpk15突变体中增强的抗病性可能会消耗更多的能量，导致更少的生物量和穗粒数。与野生型植株相比，mpk15突变体系每穗粒数和结实率显著下降，千粒重增加；然而OsMPK15-OE家系显著增加了每穗粒数图7中C。分蘖数，结实率和千粒重在OsMPK15-OE和WT之间没有显著差异图7中B，D，E。田间评估对单株籽粒产量显示，与WT相比，OsMPK15-OE家系每株植物的籽粒产量增加了14.02％和23.23％，而mpk15突变体家系分别仅为WT的60.2％至66.93％图7中F。此外，OsMPK15的敲除产生更大的种子，而在OsMPK15-OE和WT之间没有观察到粒长、粒宽和幼苗发育有显著差异图8中A-D。这些结果表明，OsMPK15可能通过牺牲抗病性来正向调节水稻产量。本发明提供了OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用，OsMPK15通过调节PRs和SAJA相关基因的表达以及ROS爆发来负调控对不同菌株稻瘟菌和Xoo的抗性。此外，OsMPK15的敲除也导致粒长增加。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表中国水稻研究所OsMPK15基因、编码蛋白和重组载体在水稻中的应用38SIPOSequenceListing1.0130DNA人工序列ArtificialSequence1cggggtacccgtcgtcctcgttaactgtct30230DNA人工序列ArtificialSequence2cgcggatccaggatggatttcttcaggggt30339DNA人工序列ArtificialSequence3gagctgtacaagggatcccgtcgtcctcgttaactgtct39439DNA人工序列ArtificialSequence4cttaattaactctctagaaggatggatttcttcaggggt39526DNA人工序列ArtificialSequence5tgtgtgttctggagtcaagtcgtcgt26626DNA人工序列ArtificialSequence6aaacacgacgacttgactccagaaca26730DNA人工序列ArtificialSequence7tacgagaggaaccgctcattcagataatta30828DNA人工序列ArtificialSequence8tcagcagatcgtaacgataaagctactc28920DNA人工序列ArtificialSequence9caaccctgacaagattccct201020DNA人工序列ArtificialSequence10agtcaaggttggtggacctc201121DNA人工序列ArtificialSequence11ccgtcgtcctcgttaactgtc211221DNA人工序列ArtificialSequence12aggatggatttcttcaggggt211320DNA人工序列ArtificialSequence13agcgcatattgtgccacatg201423DNA人工序列ArtificialSequence14ggatacacttgccacacgagtct231524DNA人工序列ArtificialSequence15caacagcaactaccaagtcgtctt241627DNA人工序列ArtificialSequence16caaggtgtcgttttattcatcaacttt271722DNA人工序列ArtificialSequence17gttcatctggtcagcggatagc221826DNA人工序列ArtificialSequence18tcataagtattatcacgaccgttcga261919DNA人工序列ArtificialSequence19ccctgccgaatacgcctaa192021DNA人工序列ArtificialSequence20ctcaaacgccacgagaatttg212119DNA人工序列ArtificialSequence21tctcgccatcgccaacatc192220DNA人工序列ArtificialSequence22tgcccttgaacccgtagtcc202321DNA人工序列ArtificialSequence23gacgcgaggaagtacatgagg212419DNA人工序列ArtificialSequence24cagcgggttgaaggtgagc192518DNA人工序列ArtificialSequence25cgcacgctcagggagatc182625DNA人工序列ArtificialSequence26ggtatgatatcccttatggcaacaa252720DNA人工序列ArtificialSequence27tcgtccgggaatacggtggt202820DNA人工序列ArtificialSequence28aggcctttgggtgcttggag202918DNA人工序列ArtificialSequence29ccgagcttgacgcgaaga183021DNA人工序列ArtificialSequence30gatcgtcgtcgtccacattgt213118DNA人工序列ArtificialSequence31caccgccggtcaaagtct183222DNA人工序列ArtificialSequence32ccgtatccgtacaagctgattg223323DNA人工序列ArtificialSequence33caatacgtgtactggtcgaatgg233420DNA人工序列ArtificialSequence34aaggtgtcgtaccggaggaa203520DNA人工序列ArtificialSequence35gaggagtacgtgccggacag203622DNA人工序列ArtificialSequence36ggagtcgtatcggaggaagagc223720DNA人工序列ArtificialSequence37cgggaggaagggaacaaggt203821DNA人工序列ArtificialSequence38aatggtgcgtcaagctcaaac21

权利要求：1.OsMPK15基因在调控水稻对疾病抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK15基因的登录号为LOC_Os11g17080。2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述疾病包括稻瘟病和水稻白叶枯病。3.根据权利要求1或2所述应用，其特征在于，所述OsMPK15基因通过调节SA和JA介导的信号通路来负调控对稻瘟病和水稻白叶枯病的抗性。4.权利要求1～3任一项所述OsMPK15基因在调控水稻粒长中的应用。5.OsMPK15蛋白在调控水稻对疾病抗性中的应用，其特征在于，所述OsMPK15蛋白由所述OsMPK15基因转录翻译得到。6.权利要求5所述OsMPK15蛋白在调控水稻粒长中的应用。7.包含权利要求1～4任一项所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻对疾病抗性中的应用。8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述重组载体的制备方法，包括：将所述OsMPK15基因的全长ORF克隆至以玉米泛素启动子修饰的pCAMBIA1301载体中，得重组载体pCAMBIA1301-Ubi::OsMPK15。9.权利要求7或8所述包含所述OsMPK15基因的重组载体在调控水稻粒长中的应用。

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