申请/专利权人：西南大学

申请日：2018-08-15

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN108948169B

主分类号：C07K14/415(20060101)

分类号：C07K14/415(20060101);C12N15/29(20060101);C12N15/74(20060101);C12N1/21(20060101);C12N15/82(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/60(20180101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.07.29#未缴年费专利权终止;2019.01.01#实质审查的生效;2018.12.07#公开

摘要：本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用，属于基因工程和遗传工程技术领域。本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明利用上述编码基因或编码序列转染棉花，可显著提高被转染棉花的纤维绿色色素合成水平，同时能避免常规杂交手段导致的非靶标性状导入。

主权项：1.一种蛋白质、编码蛋白质的基因、编码蛋白质的核酸、含编码蛋白质的基因或核酸的重组载体和包括重组载体的重组菌中的任一项或几项在促进棉花纤维绿色色素合成中的应用；所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示；所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示；所述核酸的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示；所述重组载体还包括棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子。

全文数据：一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用技术领域[0001]本发明属于基因工程和遗传工程技术领域，具体涉及一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用。背景技术[0002]天然彩棉与普通棉花相比具有色泽自然柔和、古朴典雅、质地柔软等特点。用彩色棉花制成的纺织品不需化学染料染色，在加工生产过程不会产生对土地、水源的污染。在纺织品中不含甲醛、偶氮染料等有害物质，并具有防静电、止骚痒的功能，是名副其实的“绿色产品”，被誉为“生态服装”、“植物羊绒”，是适应世界各国人民保护生存环境、实现可持续发展要求的新型纺织原料，顺应了人们追求纯天然时尚、环保与健康的时代潮流。[0003]天然彩棉品种较少，传统育种一般通过杂交的方法将绿色纤维基因转育到新材料中，使转育后的棉花长出绿色的棉纤维。然而，传统杂交方法在转育绿色纤维基因的同时，不可避免地会将部分非靶标性状导入到新材料中，进而影响新材料的其他优良性状。发明内容[0004]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质及其编码基因和应用，利用转基因手段，通过在棉花纤维中表达Gh3622基因，特定地改变棉花纤维中的绿色色素合成和积累，在不带入非靶标性状的情况下获得绿色纤维，同时也为改变纤维中绿色色素积累水平奠定基础。[0005]本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。[0006]本发明提供了一种编码上述蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。[0007]本发明提供了上述蛋白质的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。[0008]本发明提供了一种用于扩增上述基因或编码序列的引物对，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。[0009]本发明提供了一种含有上述基因或编码序列的重组载体，所述重组载体还包括棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子。[0010]本发明提供了一种重组菌，所述重组菌包括宿主细菌和上述重组载体。[0011]本发明还提供了上述蛋白质、基因、编码序列、重组载体和重组菌在促进棉花纤维绿色色素合成中的应用。[0012]优选的，所述促进棉花纤维绿色色素合成的方法，包括如下步骤：[0013]1将编码序列、棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子pFbl2A和植物表达载体重组，得到重组载体；[0014]2将所述重组载体导入宿主细菌中，得到重组菌；[0015]3利用所述重组菌对棉花进行遗传转化。[0016]优选的，所述步骤1中棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子由扩增得到，扩增所述棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子用引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示。[0017]优选的，所述步骤⑵宿主细菌包括根瘤农杆菌。[0018]有益效果:本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。本发明提供了编码上述蛋白质的基因和编码序列。利用上述基因或编码序列转染棉花材料，可显著提高被转染棉花的纤维绿色色素合成水平，同时能避免常规杂交手段导致的非靶标性状导入。附图说明[0019]图1为本发明实施例1所述绿色纤维基因的精细定位图。其中，图I-A为绿色色素水平Lg区段的遗传连锁图，标记间的交换株用X+数字显示；图I-B是对用Lg区段的雷蒙德氏棉基因组区段及注释基因；图I-C表示开花后20天的绿色和白色RIL纤维中Gh3622表达水平；图I-D表示开花后20天的绿色和白色RIL纤维中绿色色素水平；[0020]图2为本发明实施例3所述Gh3622基因的编码序列构建入植物表达载体PLGN的流程图；[0021]图3为本发明实施例5所述棉花Gh3622基因转录水平的检测结果及棉花纤维色泽及绿色色素水平结果；其中，图3-A为转基因绿色棉FLgTl、16和19、分离的非转基因系Null以及野生绿色棉（WT的成熟籽棉照片；图3-B为开花后20天后转基因纤维中的Gh3622基因表达水平；图3-C表示转基因绿色棉FLgTl及分离的非转基因系Null在不同时期的纤维中Gh3622基因的表达水平；图3-D表示转基因绿色棉FLgTl及分离的非转基因系Null在不同时期的纤维中的绿色色素水平变化。具体实施方式[0022]本发明提供了一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。[0023]本发明提供了一种编码上述蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。[0024]在本发明中，所述基因是由绿色纤维材料RIL051和白色纤维材料渝棉1号杂交构建的F2代分离群体经SSR标记精细定位获得。所述RIL051来源于绿色纤维材料T586和白色纤维材料渝棉1号的重组近交系（RIU。所述SSR标记包括C2-0120、PGML4063、HAU3033、〇6尺5015、咄!?10087、5冊07324、5而01713、5冊01715、5冊16607和5冊01720。本发明提取卩2代分离群体的叶片DNA后，鉴定各个单株各分子标记的基因型，最后用joinmap软件构建绿色纤维Lg区段的遗传连锁图。在本发明中，各分子标记检测用引物如SEQIDNo.8〜27所不。[0025]本发明提供了一种上述蛋白质的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。所述编码序列为上述基因在合成SEQIDNo.1所示氨基酸序列的蛋白质时转录的mRNA的互补单链。[0026]本发明中，所述编码序列的制备方法优选包括以下步骤：以开花后20天的绿色纤维总RNA为模板，利用3’-RACE试剂盒TaKaRa，大连，中国），扩增得到编码序列。在本发明中，所述3’-RACE扩增用特异性引物的序列如SEQIDNo.32所示。[0027]本发明还提供了上述编码基因或编码序列的PCR用扩增引物对，所述PCR用扩增引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。利用上述PCR用扩增引物对，可扩增上述编码基因或编码序列，进一步对3’-RACE法扩增得到的编码序列进行验证。[0028]本发明提供了一种含有上述基因或编码序列的重组载体。所述重组载体优选包括上述编码序列和棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子。所述棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子优选利用SEQIDNo.6所示的正向引物和SEQIDNo.7所示的反向引物联合扩增棉花基因组获得。[0029]本发明还提供了一种重组菌，所述重组菌包括上述重组载体和宿主细菌。在本发明中，所述宿主细菌优选为根瘤农杆菌。利用本发明提供的重组菌转染棉花新材料，能显著提高棉花新材料纤维绿色色素的合成，同时能避免常规杂交手段导致的非靶标性状导入。[0030]本发明提供了上述蛋白质、编码基因、编码序列、引物对、重组载体和或重组菌在促进棉花纤维绿色色素合成中的应用。[0031]在本发明中，所述促进棉花纤维绿色色素合成的应用方法优选包括如下步骤：[0032]1将编码序列、棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子pFbl2A和植物表达载体重组，得到重组载体；[0033]2将所述重组载体导入宿主细菌中，得到重组菌；[0034]3利用所述重组菌对棉花进行遗传转化。[0035]本发明对所述编码序列、棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子pFbl2A的扩增方法和连接方法不作特别限定，本领域常规方法即可。在本发明的实施例中，优选在启动子两端加上Hindm和BamHI位点，利用Hindm和BamHI酶切位点连接启动子和载体;再用BamHI和KpnI将编码基因的编码序列插入到载体的相应位点上。具体扩增程序见如下常规实验操作3〇[0036]本发明对步骤2所述导入的方法和步骤⑶所述遗传转化的方法不作特别限定，本领域常规导入方法和遗传转化方法即可。在本发明的实施例中，所述导入优选采用电击转化法进行;所述遗传转化优选在无菌环境下进行。[0037]下面结合实施例对本发明提供的一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质及其编码基因和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0038]在本发明的实施例中，所用到的常规实验操作如下：[0039]I.DNA的提取[0040]基因组DNA采用植物基因组DNA快速提取试剂盒Aidlab提取，详细步骤见说明书。[0041]2.RNA的提取[0042]RNA采用EASYspin植物RNA快速提取试剂盒Aidlab提取，详细步骤见说明书。[0043]3.DNA片段的PCR扩增[0044]扩增体系为：l〇XExPCRbufferMg2+free2.5yL，2.5mmolLdNTPs2yL，25mmlLMgCl22yL，引物l5ymolLlyL，引物25ymolLlyL，ExTaqDNA聚合酶1U，基因组DNA约60ng，加入ddH20至25yL。[0045]扩增程序为：94°C，5min;94°C，30sec，56°C，30sec，72°C，I·5min，35个循环；72°C延伸lOmin。[0046]4.DNA片段的回收、连接和克隆[0047]使用BioFlux胶回收试剂盒回收DNA片段。使用T4DNAIigase进行DNA片段连接。回收的片段与PUCm-T上海生工载体建立如下连接体系：10XT4DNA连接缓冲液lyL，载体DNA片段lyL，外源连接产物DNA片段lyL，T4DNA连接酶lyL，用双蒸水补足体积至10yL。载体DNA片段与外源连接产物DNA片段摩尔比为1:3,16°C连接12h。之后将连接产物转化大肠杆菌DH5a。获得的抗性克隆经液体培养过夜，用BioFlux质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证后，在Invitrogen公司测序。[0048]5.GUS组织化学染色[0049]由于实验室采用的表达载体具有⑶S报告基因，一般用⑶S组织化学染色检测跟踪转基因。具体方法:取少量转基因棉花叶片有伤口）置于96孔板中，加入GUS染液[0.ImolLK3FeCN6,0.ImolLK4FeCNe,O.OlmolLNa2EDTA,500mgLX-Gluc,l%TritonX-IOOνν，0.14molL磷酸钠缓冲液ρΗ7.0]，在37°C恒温条件下放置2h左右，充分染液后再用75%乙醇脱色。植株叶片可被GUS染液染成特异蓝色的植株为转基因阳性。[0050]实施例1[0051]绿色纤维基因的精细定位[0052]前期，用来源于绿色纤维材料T586和白色纤维材料渝棉1号的重组近交系RIL群体将绿色纤维（Lg基因定为到第21染色体Dll上与标记C2-0120、PGML4063、HAU3033、CGR5015和NBRI0087紧密连锁。然后，用绿色纤维材料RIL051和白色纤维品种渝棉1号构建了1个含750个单株的F2代分离群体;利用棉花D基因组祖先种雷蒙德氏棉的基因组序列设计引物，在该区段找到另外5个SSR标记（SWU07324、SWU01713、SWU01715、SWU16607*SWU01720。用于绿色纤维Lg基因精细定位的分子标记及其扩增引物间表1。[0053]表1用于绿色纤维Lg基因精细定位的分子标记[0054][0056]棉花成熟后再田间检测各单株的纤维颜色，取叶片提取DNA并鉴定各个单株各分子标记的基因型，最后用Joinmap软件构建绿色纤维Lg区段的遗传连锁图。遗传连锁图如图I-A所示:Lg定位到标记SWUl713和SWUl715之间56.8kb的区段内。雷蒙德氏棉基因组中该区段只包含一个蛋白编码基因Gorai.007G362200图1-B，因此，将陆地棉中的对应基因命名为Gh3622SEQIDNo.2，并把它作为棉花绿色纤维Lg的候选基因。进一步分析RIL群体中绿色和白色纤维的Gh3622表达和绿色色素水平，结果如图I-C和图I-D所示：纤维中Gh3622表达和绿色色素水平高度一致，均在开花后20天的绿色纤维中有很高的转录水平，而在白色纤维中转录水平极低或检测不到，表明Gh3622在纤维中促进绿色色素合成，进而促进纤维绿色呈色。[0057]实施例2[0058]Gh3622编码序列的克隆[0059]提取开花后20天绿色纤维的总RNA，用3’-RACE方法扩增Gh3622的cDNA序列。3’-RACE的基因特异引物为ctcttctcccataatccaattc-3’，其余操作按试剂盒说明书TaKaRa进行。扩增产物用常规方法进行回收、克隆、测序。[0060]分别以陆地棉T586基因组DNA和开花后20天绿色纤维CDNA为模板，用引物5’-ggatccgggatgaagggcaacgat_3’矛口5’—ggtaccctaggagataggccatgac-S'if|Gh3622S@的基因组和cDNA编码序列，扩增产物用常规方法进行回收、克隆、测序，进一步验证RACE结果。最终获得Gh3622基因的编码序列如SEQIDNo.3所示。[0061]实施例3[0062]纤维次生壁合成期特异的Gh3622表达载体的构建[0063]Gh3622基因的编码序列构建入植物表达载体pLGN的流程见图24LGN是由传统的植物表达载体PBI121改造而来的一个双元植物表达载体。其T-DNA区段RB和LB之间区域，图2替换为了组成型的CaMV35S启动子CaMV35S-P控制报告基因⑶S和标记基因NptII的融合基因表达盒，以及另一个由CaMV35S-P控制的表达盒。[0064]按前述常规操作方法用引物（pFbl2F，5’-aagcttgcagacttaggattggatg-3’和pFbl2R，5’-ggatccggttaaccgaaatacaaagca-3’）从棉花基因组中扩增克隆启动子pFbl2，并在启动子两端加上Hindm和BamHI位点。用Hindm和BamHI将pFbl2A启动子从克隆载体上切下Hindm为部分酶切），连接到用Hindm和BamHI酶切的pLGN载体上构建pLGN-pFbl2A载体。进一步用BamHI和KpnI将Gh3622基因的编码序列从克隆载体上切下，插入到pLGN-pFb12A载体的相应位点上，即获得最终的表达载体pLGN-pFb12A-Gh3622。所有限制性内切酶购自Roche公司，按照使用说明书操作。DNA片段的回收、连接和大肠杆菌转化按前述常规操作方法进行。参考Bio-RADMicroPulser用户说明书，将上述载体通过电激转化法导入农杆菌LBA4404。[0065]实施例4[0066]棉花的遗传转化[0067]通过根癌农杆菌介导的方法进行上述表达载体的棉花遗传转化，所用培养基配方见表2。[0068]表2根癌农杆菌介导的棉花遗传转化用培养基[0069][0071]MS:MurashigeSkoog，1962;B5:Gamborg，1986;GeIrite:Sigma，货号：G1910;SH:SchenkHildebrandt，1972。[0072]具体步骤为:对野生型陆地棉冀棉14号饱满棉花种子进行脱壳，将少量约20〜40颗去壳后的种子置于灭菌后的IOOmL三角瓶中，先用75%酒精预洗种子lmin，轻轻倒出酒精再加入0.1^HgCl2灭菌约12min不断摇动三角瓶进行灭菌），轻轻倒出升汞，加入无菌水充分漂洗，约漂洗10次，最后一次三角瓶中留有适量无菌水。置于摇床30°C、IOOrpm上，每隔8小时换一次无菌水，待胚根长出Icm左右约36〜48h，将胚根轻轻插进萌发培养基中，30°C暗培养至下胚轴伸长到3cm左右约48h。侵染约20h前，将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50mgLKm和125mgLSm的液体YEB培养基中，置于28°C摇床200rpm，培养约20h后测量菌液的OD值OD6qq，OD6qq在0.8〜1.0适宜转化。收集活化后的农杆菌液，8000rpm离lmin，弃上清后用含有共培养液体培养基含ΙΟΟμπιοΙLAS，乙酰丁香酮的按1:1体积比重悬菌体后收集重悬液于IOOmL三角瓶，置于摇床30°C、IOOrpm培养约20min。将下胚轴切成长约Icm的小段，置于重悬液中并在摇床30°C、IOOrpm上侵染50min，弃液体再取出下胚段轻轻放入固体共培养基表面，暗培养48h左右。暗培养后将下胚段转入固体筛选培养基中培养（30°C、16h光照8h黑暗，下同）15天后再转入固体下胚段生长培养基，每隔15d左右继代一次至愈伤组织明显形成，将愈伤组织转到固体愈伤培养基上培养。将状态良好的胚性愈伤转入液体悬浮培养基中并置于摇床30°C、IOOrpm上悬浮培养IOd左右，通过筛网过滤将细小体胚铺于体胚伸长培养基中至绿色体胚长出，将绿色体胚挑至体胚伸长培养基中继续培养至长约Icm左右，插入生根培养基中直至幼苗长出。以上操作必须在严格的无菌条件下完成。[0073]生长健壮的再生棉花幼苗移栽至种植钵，在温室中常规管理至棉花纤维和种子成熟。收获TO代转基因棉花种子，继续种植Tl代并收获种子，播种Tl代种子后对萌发的T2代幼苗进行GUS组织染色见常规操作方法），筛选出纯合的转基因T2代株系全部为GUS阳性或GUS阴性植株），移栽T2代纯合株系，并检测靶标基因Gh3622的表达水平和比较纤维颜色性状的变化。[0074]实施例5[0075]棉花Gh3622基因转录水平的检测[0076]提取RIL系、转基因棉花和对照纤维的RNA，逆转录合成cDNA—链，以此为模板进行定量PCR检测。具体操作步骤为：用cDNA—链合成试剂盒TaKaRa公司）合成各种RNA的一链cDNA，操作均按试剂盒说明书进行。定量PCR在CFX96定量PCR检测系统Bio-Rad上进行，在20yL的反应体系包括10yL2XSuperMixBio-Rad，上下游引物各0·2μπιο11和IyL—链cDNA。温度循环参数为95°C预变性2min;95°C，10sec，60°C，20sec，扩增40循环。用棉花Actin4基因作内标。用定量PCR仪自带的分析软件Bio-RadCFXManager2.0计算各个基因的相对表达量。所有定量PCR引物序列见表3。[0077]表3定量PCR引物序列[0078][0079]棉花纤维色泽及绿色色素水平的考察：棉花纤维色泽取成熟纤维进行观察照相。用开花后20天的纤维检测绿色色素水平。取开花后10〜30天的棉铃，冰上剥取胚珠上的纤维，液氮速冻，真空冷冻干燥后，称取样品约〇.lg，在液氮中迅速研磨成粉，加入3mL配制好的色素提取液50%无水乙醇，50%二氯甲烧），匀浆10s，60°C下超声萃取2小时；5000rpm，离心IOmin;取上清，即为色素粗提液，多次提取直至样品为无色，合并色素提取液，用旋转蒸发仪蒸发掉提取液后，用色素溶解液50%甲醇;50%N，N-二甲基甲酰胺重新溶解样品。每个样品三个重复，取溶解液50yL于96孔酶标板上，在波长332nm处检测吸光值，用吸光值估计色素含量。[0080]棉花Gh3622基因转录水平的检测结果及棉花纤维色泽及绿色色素水平如图3所示。其中，图3-A为转基因绿色棉FLgTl、16和19、分离的非转基因系Null以及野生绿色棉WT的成熟籽棉照片；图3-B为开花后20天后转基因纤维中的Gh3622基因表达水平；图3-C表示转基因绿色棉FLgTl及分离的非转基因系Null在不同时期的纤维中Gh3622基因的表达水平；图3-D表示转基因绿色棉FLgTl及分离的非转基因系Null在不同时期的纤维中的绿色色素水平。图3结果表明，pFbl2A-Gh3622转基因棉花成熟纤维呈现绿色，且Gh3622表达水平和绿色色素水平均在次生壁合成期开花20天后）显著升高，显示通过转基因方法在纤维次生壁合成期特异表达Gh3622基因可以促进纤维合成绿色色素，使成熟纤维呈绿色。[0081]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

权利要求：1.一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.—种编码权利要求1所述蛋白质的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.2所不。3.—种权利要求1所述蛋白质的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQIDNo.3所示。4.一种用于扩增权利要求2所述基因或权利要求3所述编码序列的引物对，所述引物对的正向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.4所示，所述引物对的反向引物的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示。5.—种含有权利要求2所述基因或权利要求3所述编码序列的重组载体，其特征在于，所述重组载体还包括棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子。6.—种重组菌，其特征在于，包括宿主细菌和权利要求5所述重组载体。7.权利要求1所述蛋白质、权利要求2所述基因、权利要求3所述编码序列、权利要求4所述引物对、权利要求5所述重组载体和权利要求6所述重组菌中的任一项或几项在促进棉花纤维绿色色素合成中的应用。8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述促进棉花纤维绿色色素合成的方法，包括如下步骤：1将编码序列、棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子和植物表达载体重组，得到重组载体；⑵将所述重组载体导入宿主细菌中，得到重组菌；⑶利用所述重组菌对棉花进行遗传转化。9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤（1中棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子由扩增得到，扩增所述棉花纤维次生壁合成期特异表达启动子用引物对的核苷酸序列如SEQIDNo.6和SEQIDNo.7所示。10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述步骤⑵宿主细菌包括根瘤农杆菌。

百度查询： 西南大学 一种促进棉花纤维绿色色素合成的蛋白质、基因及其编码序列和应用

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