申请/专利权人：昆明佰佳益康生物科技有限公司

申请日：2017-09-12

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN107446901B

主分类号：C12N9/16(20060101)

分类号：C12N9/16(20060101);A23K20/189(20160101);C12R1/66(20060101);C12R1/885(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.15#授权;2018.01.05#实质审查的生效;2017.12.08#公开

摘要：本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种复合酶制剂的制备工艺；通过孢子培养、种子培养、无花果曲霉和里氏木霉的复合发酵培养、分离纯化稳定等步骤，制备出的复合酶制剂具有良好的酶活性及稳定性，作为添加剂加入猪饲料中，可促进猪对营养物质的吸收利用，减少营养物质随粪便排出，同时该生产工艺流程简单，便于规模化、工业化生产。

主权项：1.一种复合酶制剂的生产工艺，其特征在于，所述的一种复合酶制剂的生产工艺采用无花果曲霉A.ficuumNRRL3135和里氏木霉混合发酵，经分离纯化得到一种复合酶制剂，其具体步骤包括：1）无花果曲霉孢子悬浮液制备：将无花果曲霉的菌种接种在固态PAD培养基上，32℃划线培养72～96小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为107-108个ml，得到无花果曲霉孢子悬浮液；里氏木霉孢子悬浮液制备：将里氏木霉菌种接种在固态PAD培养基上，28℃划线培养20～40小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为107-108个ml，得到里氏木霉孢子悬浮液；2）无花果曲霉发酵种子液制备：按8-10%的体积接种量将无花果曲霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，32℃，180rpm，pH5-6,溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到一级种子；按8-10%的体积接种量将一级种子接种到二级种子罐内，32℃，180rpm，pH5-6,溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到无花果曲霉发酵种子液；里氏木霉孢子发酵种子液制备：按5-8%的体积接种量将里氏木霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，28℃，150rpm，pH5-6,溶氧20%-30%，培养20-24小时，得到里氏木霉发酵种子液；3）发酵培养：以5-8%的体积接种量将无花果曲霉发酵种子液接种到装有发酵培养基的液体发酵罐内，于32℃、250-300rpm转速下培养，在发酵开始5h后以8mlL.h的流速补加含有12mlLPTM1的甘油，培养12-15h后下调温度至30℃，以10%的体积接种量补加里氏木霉发酵种子液，继续培养10-12h，停止流加甘油，当DO开始上升时，调节温度到28℃，同时以1mlL.h的流速加入甲醇和氯化钙的混合溶液;3h后每30min以增加10%的流速将甲醇和氯化钙的混合溶液的流速提升至2mlL.h，发酵70-80h,得到复合酶制剂发酵液；发酵过程中溶氧保持30%-35%，pH保持5-6；4）分离浓缩：将发酵液以4000rmin，离心15min，得粗酶液；在上清液中加硫酸铵至饱和度20％，再取上清，加硫酸铵至饱和度60％，取沉淀溶于pH为6.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，获得酶液，酶液依次通过孔径为0.6-0.8μm的微滤膜微滤和孔径为0.005-0.015μm的超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；5）向浓缩酶液中加入其质量的5-12％的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体植酸酶；其中：步骤2）中所述的种子培养基成分如下：1-3％木糖渣，1-4％麸皮，1-5％葡萄糖，1-4％蛋白胨，0.2-0.5％硫酸铵，0.3-0.6％磷酸二氢钾，0.05-0.09％硫酸镁，其余为水，121℃、1×105pa灭菌20min；步骤3）中所述的发酵培养基成分如下：2-7％木糖渣，1-4％麸皮，0.2-1％微晶纤维素，0.5-0.8％豆饼粉，1-3%乳清粉、蛋白胨0.6-0.9％、0.2-0.5％硫酸铵，0.1-0.3％尿素，0.3-0.6％磷酸二氢钾，0.05-0.09％硫酸镁，0.3-0.6％吐温80，甜菜碱0.1-0.3%，其余为水，121℃、1×105pa灭菌20min；步骤5）中所述的稳定剂组成为：氯化钙0.1molL、氯化镁0.6molL、海藻糖0.2molL、蔗糖0.8molL。

全文数据：一种复合酶制剂的生产工艺技术领域[0001]本发明属于酶制剂技术领域，具体涉及一种复合酶制剂的生产工艺。背景技术[0002]植酸又称肌酸、环己六醇六全-二氢磷酸盐，它主要存在于植物的种子、根干和茎中，本身是一种很强的螯合剂，在饲料中被采食后，会影响动物对多种矿物质元素、蛋白质的吸收利用；还能抑制蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，从而影响动物对蛋白质、碳水化合物消化吸收；同时植酸自身含有的磷元素也无法被动物消化吸收，随着粪便排出体外，造成严重的环境污染。[0003]对于单胃动物，本身不具备植酸分解酶，为了增强动物对饲料中各营养元素的吸收利用，需在饲料中添加相应的植酸酶添加剂，但是植酸通常都被包裹在细胞壁内部，常规植酸酶无法高效直接的作用于植酸，需要在纤维素酶的协同作用下，才能发挥植酸酶的作用，而很多动物内源纤维素酶含量不足，需要外加纤维素酶。[0004]无花果曲霉是一种很好的植酸酶生产菌株，其产酶种类齐全，对动物体内pH环境适应性强，但是植酸被包裹在细胞壁内部，植酸酶无法直接分解植酸;里氏木霉的纤维素酶产酶量高，但是产酶的葡萄糖苷酶活力较低，分解纤维二糖的能力较弱。[0005]在饲料中同时加入植酸酶和纤维素酶可较好的促进营养物质的吸收，但是来源不同的植酸酶和纤维素酶之间的协同作用较弱，且采用单独发酵的方式分别制备纤维素酶和植酸酶，酶种单一，生产成本高，后期饲料配比麻烦。发明内容[0006]为了克服背景技术中存在的不足，本发明提供一种复合酶制剂的生产工艺，通过孢子培养、种子培养、复合发酵培养和分离纯化稳定等步骤，制备出的复合酶制剂具有很好的酶活性及稳定性，同时生产成本低，便于工业化的生产利用。[0007]本发明是通过如下技术方案实现的：[0008]所述的一种复合酶制剂的生产工艺采用无花果曲霉A.ficuumNRRL3135和里氏木霉混合发酵，经分离纯化得到一种复合酶制剂，其具体步骤包括：[0009]1无花果曲霉孢子悬浮液制备:将无花果曲霉的菌种接种在固态PAD培养基上，32°：划线培养72〜96小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到无花果曲霉孢子悬浮液；[0010]里氏木霉孢子悬浮液制备:将里氏木霉菌种接种在固态PAD培养基上，28°C划线培养20〜40小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到里氏木霉孢子悬浮液；[0011]2无花果曲霉发酵种子液制备:按8-10%的体积接种量将无花果曲霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到一级种子；按8-10%的体积接种量将一级种子接种到二级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6,溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到无花果曲霉发酵种子液；[0012]里氏木霉孢子发酵种子液制备：按5-8%的体积接种量将里氏木霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，28°C，150rpm，pH5-6，溶氧20%-30%，培养20-24小时，得到里氏木霉发酵种子液；[0013]3发酵培养：以5-8%的体积接种量将无花果曲霉发酵种子液接种到装有发酵培养基的液体发酵罐内，于32°C、250-300rpm转速下培养，在发酵开始5h后以8mlL.h的流速补加含有WmVLPTM1的甘油，培养12-15h后下调温度至30°C，以10%的体积接种量补加里氏木霉发酵种子液，继续培养l〇_12h，停止流加甘油，当DO开始上升时，调节温度至28°C，同时以lmlL.h的流速加入甲醇和氯化钙的混合溶液;3h后每30min以增加10%的流速将甲醇和氯化钙的混合溶液的流速提升至2mlL.h，发酵70-80h，得到复合酶制剂发酵液;发酵过程中溶氧保持30%-35%，pH保持5-6;[0014]4分离浓缩:将发酵液以4000rmin，离心15min，得粗酶液;在上清液中加硫酸铵至饱和度20%，再取上清，加硫酸铵至饱和度60%，取沉淀溶于pH为6.0的Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液中，获得酶液，酶液依次通过孔径为〇.6-0.8μπι的微滤膜微滤和孔径为0.005-0.015μm的超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；[0015]5向浓缩酶液中加入其质量5-12%的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体植酸酶。[0016]进一步，步骤1中所述的PAD培养基成分如下：葡糖糖20g，马铃薯250g，琼脂20g，加水至1000ml，121°C、IX105pa灭菌20min。[0017]进一步，步骤2中所述的种子培养基成分如下：1-3%木糖渣，1-4%麸皮，1-5%葡萄糖，1-4%蛋白胨，0.2-0.5%硫酸铵，0.3-0.6%磷酸二氢钾，0.05-0.09%硫酸镁，121°C、IX105pa灭菌20min。[0018]进一步，步骤3中所述的产酶培养基成分如下:2-7%木糖渣，1-4%麸皮，0.2-1%微晶纤维素，0.5-0.8%豆饼粉，1-3%乳清粉、蛋白胨0.6-0.9%、0.2-0.5%硫酸铵，0.1-0.3%尿素，0.3-0.6%磷酸二氢钾，0.05-0.09%硫酸镁，0.3-0.6%吐温80,甜菜碱0.ΙΟ·3%，121Γ、IX105pa灭菌20min。[0019]进一步，步骤3中所述的甲醇和氯化钙的混合溶液中甲醇溶液和氯化钙溶液的体积比为IOO:1，其中甲醇溶液为IOO%含有12mlLPTM1的甲醇，氯化钙溶液浓度为0.5moIL。[0020]进一步，步骤5中所述的稳定剂溶液组成为:氯化f丐O.lmolL、氯化镁0.6molL、海藻糖〇.2molL、鹿糖0.8molL。[0021]进一步，步骤4中所述的微滤进口压力为0.1-0.15MPa，压差0.06-0.08MPa，酶液温度25-30°C;所述的超滤进口压力为0·20-0·25MPa，压差0·10-0·12MPa，酶液温度25-35cC。[0022]进一步，所述的乳清粉为牛奶生产奶酪过程中所产的副产品经巴氏杀菌、脱盐、蒸发浓缩和喷雾干燥制备而成，其中乳糖含量65-80%。[0023]本发明的有益效果:本发明提供了一套完整的复合酶制剂生产工艺，在特殊的培养基上经过孢子培养、种子培养和复合发酵培养，制备出了一种既含有高酶活的植酸酶又含有高酶活的纤维素酶的特别适用于肉猪养殖的复合酶制剂;在发酵过程中不同阶段流加不同的物料，在发酵培养基中添加价格低廉的乳清粉、微晶纤维素等组分，既减少了高价格速效碳源的使用量，又有效的克服了速效碳源发酵中产生的阻抑作用，速效碳源和迟效碳源配合使用，控制菌株快速生长和产酶;复合发酵的工艺里无花果曲霉和里氏木霉协同发酵，使产酶种类齐全活性较高，且相较于单独发酵产生的酶种，复合发酵产生的酶种之间具有更好的协同性，作为添加剂利用于饲料中，纤维素酶首先高效的分解细胞壁上的纤维素，使植酸酶更好的作用于细胞内部的植酸，有利于猪对营养物质的吸收和利用，减少粪便中磷的排泄，减少营养物质的损失;通过分离纯化浓缩、稳定处理使该工艺制备出的复合酶制剂具有很好的稳定性能，便于储藏运输和使用。具体实施方式[0024]下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。[0025]实施例1[0026]—种复合酶制剂的生产工艺包括以下步骤：[0027]所述的一种复合酶制剂的生产工艺采用无花果曲霉A.ficuumNRRL3135和里氏木霉混合发酵，经分离纯化得到一种复合酶制剂，其具体步骤包括：[0028]1无花果曲霉孢子悬浮液制备:将无花果曲霉的菌种接种在固态PAD培养基上，32°：划线培养72小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到无花果曲霉孢子悬浮液；[0029]里氏木霉孢子悬浮液制备:将里氏木霉菌种接种在固态PAD培养基上，28°C划线培养20小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到里氏木霉孢子悬浮液；[0030]2无花果曲霉发酵种子液制备：按8%的体积接种量将无花果曲霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养24小时，得到一级种子;按8%的体积接种量将一级种子接种到二级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养24小时，得到无花果曲霉发酵种子液；[0031]里氏木霉孢子发酵种子液制备:按5%的体积接种量将里氏木霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，28°C，150rpm，pH5-6，溶氧20%-30%，培养20小时，得到里氏木霉发酵种子液；[0032]3发酵培养：以5%的体积接种量将无花果曲霉发酵种子液接种到装有发酵培养基的液体发酵罐内，于32°C、250-300rpm转速下培养，在发酵开始5h后以8mlL.h的流速补加含有12mlLPTMl的甘油，培养12h后下调温度至30°C，以10%的体积接种量补加里氏木霉发酵种子液，继续培养l〇h，停止流加甘油，当DO开始上升时，调节温度至28°C，同时以ImlL.h的流速加入甲醇和氯化钙的混合溶液;3h后每30min以增加10%的流速将甲醇和氯化钙的混合溶液的流速提升至2mlL.h，发酵70h，得到复合酶制剂发酵液;发酵过程中溶氧保持30%-35%，pH保持5-6;[0033]4分离浓缩:将发酵液以4000rmin，离心15min，得粗酶液;在上清液中加硫酸铵至饱和度20%，再取上清，加硫酸铵至饱和度60%，取沉淀溶于pH为6.0的Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液中，获得酶液，酶液依次通过孔径为0.6-0.8μπι的微滤膜微滤和孔径为0.005-0.015μm的超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；[0034]5向浓缩酶液中加入其质量5%的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体植酸酶。[0035]步骤1中所述的PAD培养基成分如下：葡糖糖20g，马铃薯250g，琼脂20g，加水至IOOOml，121°C、IX105pa灭菌20min。[0036]步骤2中所述的种子培养基成分如下：I%木糖渣，I%麸皮，I%葡萄糖，I%蛋白胨，0·2%硫酸铵，0·3%磷酸二氢钾，0·05%硫酸镁，121°C、IX105pa灭菌20min。[0037]步骤3中所述的产酶培养基成分如下：2%木糖渣，1%麸皮，0.2%微晶纤维素，0.5%豆饼粉，1%乳清粉、蛋白胨0.6%、0.2%硫酸铵，0.1%尿素，0.3%磷酸二氢钾，0·05%硫酸镁，0·3%吐温80，甜菜碱0·1%，121°C、IX105pa灭菌20min。[0038]步骤3中所述的甲醇和氯化钙的混合溶液中甲醇溶液和氯化钙溶液的体积比为100:1，其中甲醇溶液为100%含有12mlLPTMl的甲醇，氯化钙溶液浓度为0.5moIL。[0039]步骤5中所述的稳定剂溶液组成为：氯化钙0.lmolL、氯化镁0.6molL、海藻糖0·2molL、鹿糖0·8molL。[0040]步骤4中所述的微滤进口压力为0.IMPa，压差0.06MPa，酶液温度25°C;所述的超滤进口压力为0·20MPa，压差0·IOMPa，酶液温度25°C。[0041]所述的乳清粉为牛奶生产奶酪过程中所产的副产品经巴氏杀菌、脱盐、蒸发浓缩和喷雾干燥制备而成，其中乳糖含量65%。[0042]实施例2[0043]—种复合酶制剂的生产工艺包括以下步骤：[0044]所述的一种复合酶制剂的生产工艺采用无花果曲霉A.ficuumNRRL3135和里氏木霉混合发酵，经分离纯化得到一种复合酶制剂，其具体步骤包括：[0045]1无花果曲霉孢子悬浮液制备:将无花果曲霉的菌种接种在固态PAD培养基上，32°：划线培养80小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到无花果曲霉孢子悬浮液；[0046]里氏木霉孢子悬浮液制备:将里氏木霉菌种接种在固态PAD培养基上，28°C划线培养30小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到里氏木霉孢子悬浮液；[0047]2无花果曲霉发酵种子液制备:按8-10%的体积接种量将无花果曲霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养27小时，得到一级种子;按9%的体积将一级种子接种到二级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6,溶氧30%-40%，培养27小时，得到无花果曲霉发酵种子液；[0048]里氏木霉孢子发酵种子液制备:按6%的体积接种量将里氏木霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，28°C，150rpm，pH5-6，溶氧20%-30%，培养22小时，得到里氏木霉发酵种子液；[0049]3发酵培养：以6%的体积接种量将无花果曲霉发酵种子液接种到装有发酵培养基的液体发酵罐内，于32°C、250-300rpm转速下培养，在发酵开始5h后以8mlL.h的流速补加含有WmVLPTM1的甘油，培养13h后下调温度至30°C，以10%的体积接种量补加里氏木霉发酵种子液，继续培养llh，停止流加甘油，当DO开始上升时，调节温度至28°C，同时以lmlL.h的流速加入甲醇和氯化钙的混合溶液;3h后每30min以增加10%的流速将甲醇和氯化钙的混合溶液的流速提升至2mlL.h，发酵75h，得到复合酶制剂发酵液;发酵过程中溶氧保持30%-35%，pH保持5-6;[0050]4分离浓缩:将发酵液以4000rmin，离心15min，得粗酶液;在上清液中加硫酸铵至饱和度20%，再取上清，加硫酸铵至饱和度60%，取沉淀溶于pH为6.0的Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液中，获得酶液，酶液依次通过孔径为〇.6-0.8μπι的微滤膜微滤和孔径为0.005-0.015μm的超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；[0051]5向浓缩酶液中加入其质量9%的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体植酸酶。[0052]步骤1中所述的PAD培养基成分如下：葡糖糖20g，马铃薯250g，琼脂20g，加水至IOOOml，121°C、IX105pa灭菌20min。[0053]步骤2中所述的种子培养基成分如下：2%木糖渣，2%麸皮，3%葡萄糖，3%蛋白胨，0·3%硫酸铵，0·4%磷酸二氢钾，0·07%硫酸镁，121°C、IX105pa灭菌20min。[0054]步骤3中所述的产酶培养基成分如下：5%木糖渣，2%麸皮，0.7%微晶纤维素，0.6%豆饼粉，2%乳清粉、蛋白胨0.8%、0.3%硫酸铵，0.2%尿素，0.4%磷酸二氢钾，0·07%硫酸镁，0·4%吐温80，甜菜碱0·2%，121°C、IX105pa灭菌20min。[0055]步骤3中所述的甲醇和氯化钙的混合溶液中甲醇溶液和氯化钙溶液的体积比为100:1，其中甲醇溶液为100%含有12mlLPTM1的甲醇，氯化钙溶液浓度为0.5moIL。[0056]步骤5中所述的稳定剂溶液组成为：氯化钙0.lmolL、氯化镁0.6molL、海藻糖0·2molL、鹿糖0·8molL。[0057]步骤4中所述的微滤进口压力为0.13MPa，压差0.07MPa，酶液温度28°C;所述的超滤进口压力为0·23MPa，压差0·IMPa，酶液温度28°C。[0058]所述的乳清粉为牛奶生产奶酪过程中所产的副产品经巴氏杀菌、脱盐、蒸发浓缩和喷雾干燥制备而成，其中乳糖含量73%。[0059]实施例3[0060]—种复合酶制剂的生产工艺包括以下步骤：[0061]所述的一种复合酶制剂的生产工艺采用无花果曲霉A.ficuumNRRL3135和里氏木霉混合发酵，经分离纯化得到一种复合酶制剂，其具体步骤包括：[0062]1无花果曲霉孢子悬浮液制备:将无花果曲霉的菌种接种在固态PAD培养基上，32°：划线培养96小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到无花果曲霉孢子悬浮液；[0063]里氏木霉孢子悬浮液制备:将里氏木霉菌种接种在固态PAD培养基上，28°C划线培养40小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到里氏木霉孢子悬浮液；[0064]2无花果曲霉发酵种子液制备:按10%的体积接种量将无花果曲霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养30小时，得到一级种子;按10%的体积接种量将一级种子接种到二级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到无花果曲霉发酵种子液；[0065]里氏木霉孢子发酵种子液制备:按8%的体积接种量将里氏木霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，28°C，150rpm，pH5-6，溶氧20%-30%，培养24小时，得到里氏木霉发酵种子液；[0066]3发酵培养：以8%的体积接种量将无花果曲霉发酵种子液接种到装有发酵培养基的液体发酵罐内，于32°C、250-300rpm转速下培养，在发酵开始5h后以8mlL.h的流速补加含有WmVLPTM1的甘油，培养15h后下调温度至30°C，以10%的体积接种量补加里氏木霉发酵种子液，继续培养12h，停止流加甘油，当DO开始上升时，调节温度至28°C，同时以ImlL.h的流速加入甲醇和氯化钙的混合溶液;3h后每30min以增加10%的流速将甲醇和氯化钙的混合溶液的流速提升至2mlL.h，发酵80h，得到复合酶制剂发酵液;发酵过程中溶氧保持30%-35%，pH保持5-6;[0067]4分离浓缩:将发酵液以4000rmin，离心15min，得粗酶液;在上清液中加硫酸铵至饱和度20%，再取上清，加硫酸铵至饱和度60%，取沉淀溶于pH为6.0的Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液中，获得酶液，酶液依次通过孔径为〇.6-0.8μπι的微滤膜微滤和孔径为0.005-0.015μm的超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；[0068]5向浓缩酶液中加入其质量12%的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体植酸酶。[0069]步骤1中所述的PAD培养基成分如下：葡糖糖20g，马铃薯250g，琼脂20g，加水至IOOOml，121°C、IX105pa灭菌20min。[0070]步骤2中所述的种子培养基成分如下：3%木糖渣，4%麸皮，5%葡萄糖，4%蛋白胨，0·5%硫酸铵，0·6%磷酸二氢钾，0·09%硫酸镁，121°C、IX105pa灭菌20min。[0071]步骤3中所述的产酶培养基成分如下：7%木糖渣，4%麸皮，1%微晶纤维素，0.8%豆饼粉，3%乳清粉、蛋白胨0.9%、0.5%硫酸铵，0.3%尿素，0.6%磷酸二氢钾，0·09%硫酸镁，0·6%吐温80，甜菜碱0·3%，121°C、IX105pa灭菌20min。[0072]步骤3中所述的甲醇和氯化钙的混合溶液中甲醇溶液和氯化钙溶液的体积比为100:1，其中甲醇溶液为100%含有12mlLPTM1的甲醇，氯化钙溶液浓度为0.5moIL。[0073]步骤5中所述的稳定剂溶液组成为：氯化钙0.lmolL、氯化镁0.6molL、海藻糖0·2molL、鹿糖0·8molL。[0074]步骤4中所述的微滤进口压力为0.15MPa，压差0.08MPa，酶液温度25-30°C;所述的超滤进口压力为〇·25MPa，压差0·12MPa，酶液温度25-35°C。[0075]所述的乳清粉为牛奶生产奶酪过程中所产的副产品经巴氏杀菌、脱盐、蒸发浓缩和喷雾干燥制备而成，其中乳糖含量80%。[0076]实验分析[0077]1.复合酶制剂饲养猪的效果分析[0078]将实施例1中制备的浓缩复合酶制剂，按质量比1:200的比例，混合到猪饲料中，观察记录猪的生长状况。[0079]实验一:挑选60日的，性别、体重、生长状况相近的健壮的猪30头，分成三组，每组10头，作为实验组、对照组和空白组，实验组喂食混有复合酶制剂的饲料，对照组喂食混有相同量的市售植酸酶的饲料，空白组喂食不加酶制剂的常规饲料，每天喂食量相同，饲养管理条件一致，分别采集实验组、对照组和空白组的粪便进行磷含量检测。[0080]实验二:挑选90日，的性别、体重、生长状况相近的健壮的猪30头，分成三组，每组10头，作为实验组、对照组和空白组，实验组喂食混有复合酶制剂的饲料，对照组喂食混有相同量的市售植酸酶的饲料，空白组喂食不加酶制剂的常规饲料，每天喂食量相同，饲养管理条件一致，分别采集实验组、对照组和空白组的粪便进行磷含量检测。[0081]粪便中磷含量的测试方法按照《NY525-2002有机肥料标准》执行。[0082]实验结果如表1:[0083]表1复合酶制剂饲养猪的效果分析[0086]以上结果表明，采用添加有该工艺制备的复合酶制剂饲料养猪，相较未添加复合酶制剂的饲料，可使60日龄猪体重增重22.6%，90日龄的体重增重33.8%，饲养效果比添加单纯植酸酶和不添加酶制剂的效果都好，同时添加该工艺制备的复合酶制剂使猪粪中钙磷排泄量明显降低，其效果相较添加单纯植酸酶好，说明该复合酶制剂作为添加剂利用与饲料中，可有效增强猪对饲料中各营养物质的吸收利用，减少营养物质的损失。[0087]2.复合酶制剂植酸酶活力稳定性测试[0088]将本发明实施例2制备的液体复合酶制剂于TC和45°C条件下储存12个月，采用《GBT18634-2009饲用植酸酶活性的测定》中的检测方法测定液体植酸酶的酶活力，计算酶活损失率，酶活损失率是指实际检测的酶活力与产品标注酶活力的差值占标注酶活力的百分率，结果如表2:[0089]表2复合酶制剂植酸酶活力稳定性测试[0092]以上结果表明，在TC和45°C条件下储存12个月，本发明液体复合酶制剂中植酸酶保持较高的酶活性，相较于市售植酸酶，其酶活损失较小，酶活力非常稳定，保质期长，利于保存。[0093]本发明提供了一套完整的复合酶制剂生产工艺，在特殊的培养基上经过孢子培养、种子培养和复合发酵培养，制备出了一种既含有高酶活的植酸酶又含有高酶活的纤维素酶的特别适用于肉猪养殖的复合酶制剂;在发酵过程中不同阶段流加不同的物料，在发酵培养基中添加价格低廉的乳清粉、微晶纤维素等组分，既减少了高价格速效碳源的使用量，又有效的克服了速效碳源发酵中产生的阻抑作用，速效碳源和迟效碳源配合使用，控制菌株快速生长和产酶;复合发酵的工艺里无花果曲霉和里氏木霉协同发酵，使产酶种类齐全活性较高，且相较于单独发酵产生的酶种，复合发酵产生的酶种之间具有更好的协同性，作为添加剂利用于饲料中，纤维素酶首先高效的分解细胞壁上的纤维素，使植酸酶更好的作用于细胞内部的植酸，有利于猪对营养物质的吸收和利用，减少粪便中磷的排泄，减少营养物质的损失;通过分离纯化浓缩、稳定处理使该工艺制备出的复合酶制剂具有很好的稳定性能，便于储藏运输和使用。[0094]以上对本发明实施例所提供的一种复合酶制剂的生产工艺进行了详细介绍，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

权利要求：1.一种复合酶制剂的生产工艺，其特征在于，所述的一种复合酶制剂的生产工艺采用无花果曲霉A.ficuumNRRL3135和里氏木霉混合发酵，经分离纯化得到一种复合酶制剂，其具体步骤包括：1无花果曲霉孢子悬浮液制备:将无花果曲霉的菌种接种在固态PAD培养基上，32°C划线培养72〜96小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到无花果曲霉孢子悬浮液；里氏木霉孢子悬浮液制备:将里氏木霉菌种接种在固态PAD培养基上，28°C划线培养20〜40小时，用无菌水将培养成熟的布满孢子的固态PAD培养基洗涤、震荡，稀释至孢子数为IO7-IO8个ml，得到里氏木霉孢子悬浮液；2无花果曲霉发酵种子液制备:按8-10%的体积接种量将无花果曲霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到一级种子;按8-10%的体积接种量将一级种子接种到二级种子罐内，32°C，180rpm，pH5-6，溶氧30%-40%，培养24-30小时，得到无花果曲霉发酵种子液；里氏木霉孢子发酵种子液制备:按5-8%的体积接种量将里氏木霉孢子悬浮液接种到装有种子培养基的一级种子罐内，28°C，150rpm，pH5-6,溶氧20%-30%，培养20-24小时，得到里氏木霉发酵种子液；3发酵培养：以5-8%的体积接种量将无花果曲霉发酵种子液接种到装有发酵培养基的液体发酵罐内，于32°C、250-300rpm转速下培养，在发酵开始5h后以8mlL.h的流速补加含有UmVLPTM1的甘油，培养12-15h后下调温度至30°C，以10%的体积接种量补加里氏木霉发酵种子液，继续培养l〇_12h，停止流加甘油，当DO开始上升时，调节温度到28°C，同时以ImlL.h的流速加入甲醇和氯化钙的混合溶液；3h后每30min以增加10%的流速将甲醇和氯化钙的混合溶液的流速提升至2mlL.h，发酵70-80h，得到复合酶制剂发酵液;发酵过程中溶氧保持30%-35%，pH保持5-6;4分离浓缩:将发酵液以4000rmin，离心15min，得粗酶液;在上清液中加硫酸铵至饱和度20%，再取上清，加硫酸铵至饱和度60%，取沉淀溶于pH为6.0的Na2HP〇4_NaH2P〇4缓冲液中，获得酶液，酶液依次通过孔径为0.6-0.8μπι的微滤膜微滤和孔径为0.005-0.015μπι的超滤膜超滤，然后循环超滤得到浓缩酶液；5向浓缩酶液中加入其质量的5-12%的稳定剂，充分搅拌，均匀混合，经除菌过滤、无菌灌装即得稳定的液体植酸酶。2.根据权利要求1所述的一种复合植酸酶制剂的生产工艺，其特征在于:步骤1中所述的PAD培养基成分如下：葡糖糖20g，马铃薯250g，琼脂20g，加水至1000ml，121°C、IX105pa灭菌20min。3.根据权利要求1所述的一种复合植酸酶制剂的生产工艺，其特征在于:步骤2中所述的种子培养基成分如下：1-3%木糖渣，1-4%麸皮，1-5%葡萄糖，1-4%蛋白胨，0.2-0.5%硫酸铵，0·3-0·6%磷酸二氢钾，0·05-0·09%硫酸镁，其余为水，121°C、IX105pa灭菌20min〇4.根据权利要求1所述的一种复合植酸酶制剂的生产工艺，其特征在于:步骤3中所述的产酶培养基成分如下:2-7%木糖渣，1-4%麸皮，0.2-1%微晶纤维素，0.5-0.8%豆饼粉，1-3%乳清粉、蛋白胨0·6-0.9%、0·2-0.5%硫酸铵，0·1-0.3%尿素，0·3-0.6%磷酸二氢钾，0.05-0.09%硫酸镁，0.3-0.6%吐温80，甜菜碱0.1-0.3%，其余为水，121°C、IXIO5Pa灭菌20min〇5.根据权利要求1所述的一种复合植酸酶制剂的生产工艺，其特征在于:步骤3中所述的甲醇和氯化钙的混合溶液中甲醇溶液和氯化钙溶液的体积比为100:1，其中甲醇溶液为100%含有12mlLPTM1的甲醇，氯化钙溶液浓度为0.5moIL。6.根据权利要求1所述的一种复合植酸酶制剂的生产工艺，其特征在于:步骤5中所述的稳定剂溶液组成为:氯化1丐0.1111〇11、氯化镁0.61]1〇11、海藻糖0.21]1〇11、鹿糖0.81]1〇1L07.根据权利要求1所述的一种复合植酸酶制剂的生产工艺，其特征在于:步骤4中所述的微滤进口压力为0.1-0.15MPa，压差0.06-0.08MPa，酶液温度25-30°C;所述的超滤进口压力为0·20-0·25MPa，压差0·10-0·12MPa，酶液温度25-35°C。8.根据权利要求4所述的一种复合植酸酶制剂的生产工艺，其特征在于:所述的乳清粉为牛奶生产奶酪过程中所产的副产品经巴氏杀菌、脱盐、蒸发浓缩和喷雾干燥制备而成，其中乳糖含量65-80%。

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