申请/专利权人：复旦大学附属华山医院北院

申请日：2017-08-16

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN107254545B

主分类号：C12Q1/6886(20180101)

分类号：C12Q1/6886(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.15#授权;2017.11.14#实质审查的生效;2017.10.17#公开

摘要：本发明涉及在成纤维细胞生长因子受体FGFR基因上的2个与乳腺癌相关联的单核苷酸多态性SNP位点rs2420946和rs2981578，预测乳腺癌化疗毒性。本发明通过SNP生物标志物和乳腺癌化疗毒性诊断试剂盒的研制和应用，对乳腺癌化疗后毒性反应程度进行预测，从而指导肿瘤化疗用药、为临床医生预测患者预后提供新的途径。

主权项：1.FGFR2基因上的rs2420946的扩增引物和或FGFR2基因上的rs2981578的扩增引物在制备用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒中的应用，其特征在于，所述乳腺癌化疗的方案为受试者接受环磷酰胺、多西他赛和表柔比星的化疗方案；所述rs2420946的扩增引物为SEQIDNo：1和SEQIDNo：2，所述rs2981578的扩增引物为SEQIDNo：3和SEQIDNo：4。

全文数据：一种与乳腺癌化疗毒性相关的SNP标志物及其应用技术领域[0001]本发明涉及基因工程与肿瘤学技术领域，具体地，本发明涉及一种与乳腺癌化疗毒性相关的SNP标志物及其应用。背景技术[0002]乳腺癌是一种严重危害女性身心健康的常见恶性肿瘤，发病率和死亡率逐年上升，全球每年有120万妇女患乳腺癌，50万妇女死于乳腺癌。化学治疗已与手术治疗、放射治疗一样成为肿瘤治疗的主要手段。随着化疗药物的不断更新，乳腺癌在化学治疗方面已取得了令人瞩目的进展。紫杉醇类和蒽环类药物经过多年的临床实践已成为乳腺癌化疗的两大基石，广泛用于一线和二线局部晚期以及复发、转移性乳腺癌的治疗，规范的治疗能明显改善乳腺癌的预后。但在临床实践和研究中也发现，乳腺癌的化疗疗效、毒副反应存在个体差异，紫杉醇单药用于一线治疗的有效率为32-62%，多西紫杉醇用于转移性乳腺癌的治疗反应率为30-50%。[0003]因此，从药物遗传学和药物基因组学角度研究患者之间药物敏感性的差异，寻找可靠的预测指标，指导个体化治疗，对于指导个体化治疗、改善患者的预后，提高临床用药的有效性和安全性具有极其重要的意义。同时也为研究不同患者之间药物敏感性方面的差异开辟了新的途径。[0004]研究表明，单核苷酸多态性（SingleNucleotidePolymorphism，SNP是引起药物毒副反应的重要遗传因素。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，它是人类最常见的可遗传变异，在人类基因组中广泛存在。SNP表现出的多态性仅涉及到单个碱基的变异，表现是有转换、颠换、插入和缺失等。单核苷酸多态性为第三代遗传标志，人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。目前对于不同分型乳腺癌预后、疗效的预测性研究主要集中在SNP水平。近年来，利用SNP诊断疾病的发生发展已成为临床和科研工作者的研究热点。然而，目前还没有将SNP应用于乳腺癌化疗药物毒性辅助诊断的报道，若能筛选出乳腺癌易感的SNP作为生物标志物，研究其在辅助诊断乳腺癌化疗药物毒性方面的作用，并研制相应的诊断试剂盒，必将有力地推动我国乳腺癌预后评价的现状，并为化疗药物筛选、药效评价及靶向治疗开辟新的途径。发明内容[0005]本发明的目的在于克服现有技术中的缺陷，提供一种与乳腺癌化疗毒性相关的SNP标志物及其应用，通过对成纤维细胞生长因子受体FGFR基因上的单核苷酸多态性位点遗传特异性的研究，提出两个可作为辅助诊断乳腺癌化疗药物毒性的SNP位点，以用于指导肿瘤化疗用药。[0006]为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：[0007]本发明的第一个目的是提供一种与乳腺癌化疗毒性相关的SNP标志物，其包括FGFR2基因上的rs2420946、FGFR2基因上的rs2981578中的至少一种。[0008]本发明的第二个目的是提供一种上述SNP标志物的特异性扩增引物，该特异性引物是指针对上述两个基因多态位点而设计，能特异性扩增出包含这2个SNP位点中的至少一个的DNA片段的引物对。特异性引物对可用常规的合成技术进行合成。SNP标志物的特异性扩增引物包括rs2420946的扩增引物、rs2981578的扩增引物中的至少一种；其中，rs2420946的扩增引物序列为SEQIDNo:l和SEQIDNo:2，rs2981578的扩增引物序列为SEQIDNo:3和SEQIDNo:4。[0009]上述SNP位点：rs2420946和rs2981578的引物信息如下表所示：[0010]表1.相关SNP位点的引物信息[0011][0012]本发明的第三个目的是提供一种上述SNP标志物的特异性扩增引物在制备用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒中的应用。[0013]本发明的第四个目的是提供一种上述SNP标志物在制备乳腺癌化疗药物中的应用。[0014]本发明的第五个目的是提供一种含有上述SNP标志物的特异性扩增引物的用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒。[0015]优选地，该试剂盒用于检测外周血DNA中的rs2420946和或rs2981578。[0016]优选地，该试剂盒还可以包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、MgCl2溶液、去离子水蒸馏水等;还可以含有标准品和或对照品。[0017]本发明的技术方案具体包括：[0018]1采集符合标准的血液样本，系统收集完整的人口学资料和临床资料；[0019]2基因型检测：选择乳腺癌化疗病例，查阅已有文献，找出与乳腺癌风险或预后相关的SNP;对筛选出的SNP，进一步采用基因分型进行检测，找出与乳腺癌化疗毒性相关的SNP；[0020]3乳腺癌化疗毒性辅助诊断试剂盒的研制：根据乳腺癌化疗病例中不同化疗毒性反应患者基因型分布频率有显著差异的SNP开发SNP乳腺癌化疗毒性辅助诊断试剂盒。[0021]具体来说研究的实验方法主要包括以下几个部分：[0022]1.研究样本的选择；[0023]1首次入院就诊并经病理组织学或细胞学确诊的新发乳腺癌患者，其诊断按照世界卫生组织颁布的标准由至少两位病理科医生确认；[0024]2首次化疗前血常规、肝肾功能检查各项指标均正常；[0025]3接受4周期的环磷酰胺+多西他赛+表柔比星方案的化疗;排除化疗前或化疗期间接受放疗的乳腺癌患者；[0026]⑷有详细的化疗2周期或3周期后血常规、肝肾功能检查数据。[0027]本研究共采用211例符合标准的样本进行研究。[0028]2.采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲系统，提取外周血基因组DNA，按常规方法操作。通常能得到20-50ngyLDNA，纯度（紫外2600D:2800D在1.6-2.0。[0029]3.筛查SNP:查阅已有文献，筛选出已报道与乳腺癌风险或乳腺癌预后相关的SNP位点。[0030]4.单个SNP的基因分型；[0031]1取受试者DNA样本；[0032]⑵设计单个SNP的特异性扩增引物；[0033]3进行PCR反应，回收产物进行测序。[0034]5.统计分析方法[0035]运用卡方检验（用于分类变量或者studentt检验（用于连续性变量）比较人口学特征、吸烟、组织类型、分期等在研究对象组间分布的差异。用logistic回归分析中的additive模型进行关联分析，计算比值比（OddsRatio,0R以及它们的95%可信区间，以此评估基因位点多态性对乳腺癌患者化疗毒性的影响。[0036]6.诊断试剂盒制备方法；[0037]单个SNP检测后确定乳腺癌化疗病例中不同化疗毒性反应患者基因型分布频率有显著差异的SNP，作为乳腺癌化疗毒性诊断的指标。筛选出的与乳腺癌化疗毒性有关的SNP辅助诊断试剂盒，其包含FGFR2基因上rs2420946和或FGFR2基因上rs2981578位点的特异性扩增引物，以及Taq酶、dNTPs等试剂。[0038]7.临床应用；[0039]利用本发明人制备的乳腺癌化疗毒性辅助诊断试剂盒检测待筛查的乳腺癌化疗患者并与实际临床检测相比较以确定了乳腺癌化疗毒性辅助诊断试剂盒的有效性。具体包括测定受试者血标本中上述SNP的特异性扩增引物和其他检测试剂，为临床医生快速准确掌握患者的化疗反应和预后情况，及时采用更具个体化的给药方案提供支持。[0040]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：[0041]本发明提供的SNP标志物作为化疗毒性相关的标志物的优越性在于：[0042]ISNP是一种新型基因生物标志物，区别于传统生物标志物，稳定、微创、易于检测，将大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，该类生物标志物的成功开发将为化疗药物毒性的诊断和控制开创全新局面，为其他疾病生物标志物的研制提供借鉴。[0043]2SNP试剂盒是一种系统、全面的诊断试剂盒，可用于化疗药物毒性反应的辅助诊断，有助于反映乳腺癌患者对药物毒性的易患程度，为临床医生快速准确掌握患者病情、及时采取更具个性化的防治方案提供支持。[0044]本发明研究SNP在乳腺癌化疗毒性辅助诊断的应用前景，阐述SNP对于乳腺癌化疗预后的影响，揭示其诊断价值。因此，本发明通过SNP生物标志物和乳腺癌化疗毒性诊断试剂盒的研制和应用，对乳腺癌化疗后毒性反应程度进行预测，从而指导肿瘤化疗用药、为临床医生预测患者预后提供新的途径。具体实施方式[0045]下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。[0046]实施例一[0047]本实施例为样品的收集和样品资料的整理。[0048]发明人于2015年9月至2016年11月在上复旦大学附属华山医院（北院）收集了大量的乳腺癌化疗患者血标本，通过对样品资料的整理，发明人从中选择了211例符合下列标准的样本，样本选择标准如下：（1首次入院就诊并经病理组织学或细胞学确诊的新发乳腺癌患者，其诊断按照世界卫生组织颁布的标准由至少两位病理科医生确认；（2首次化疗前血常规、肝肾功能检查各项指标均正常；（3接受4周期的环磷酰胺+多西他赛+表柔比星方案的化疗;排除化疗前或化疗期间接受放疗的乳腺癌患者；⑷有详细的化疗2周期或3周期后血常规、肝肾功能检查数据。并系统采集了这些样本的人口学资料和临床资料等情况。[0049]实施例二[0050]本实施例为外周血DNA提取、基因型检测及结果分析。[0051]具体步骤为：[0052]1处理血液材料，取200μ1血液样品。[0053]2加入20μ1ProteinaseK溶液，混勾。[0054]3加200μ1缓冲液GB，充分颠倒混匀，56°C放置IOmin，其间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。[0055]4加200μ1无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。[0056]5将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中（吸附柱CB3放入收集管中），12000rpm〜13400Xg离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。[0057]6向吸附柱CB3中加入500μ1缓冲液GD使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm〜13400\8离心308扣，倒掉收集管中的废液，将吸附柱083放入收集管中。[0058]7向吸附柱CB3中加入600μ1漂洗液PW，12000rpm〜13400Xg离心30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB3放入收集管中。[0059]8重复操作步骤7。[0060]912000印111〜13400\8离心21^11，倒掉废液。将吸附柱083置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。[0061]10将吸附柱CB3转入1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200μ1洗脱缓冲液ΤΒ，室温放置2-5min，12000rpm〜13400Xg离心2min，将溶液收集到离心管中。[0062]11测量浓度:通常能得到20-50ngyLDNA，纯度（紫外2600D:2800D在1·8-2·0。[0063]12测序:对与乳腺癌化疗药物的毒性反应有关的2个SNP设计特异性扩增引物；PCR扩增结束后，取5yL扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳，电泳30min，染色20min，然后将凝胶块置于凝胶成像仪中观察，根据比对Marker的片段大小情况，初步判断扩增片段是否正确。进而对符合要求的扩增产物进行纯化：采用Mag-BindOligonucleotidePurificationKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作。上样测序:采用ABI公司BigDye3.ISequencingKit试剂盒，并按试剂盒要求进行操作；用ABI公司3730型测序仪进行测序。[0064]13数据分析与处理:在接受药物化疗后发生不同程度毒性的乳腺癌患者中发现的基因型分布频率有显著差异的3ΝΡ^6ΡΚ2^2420946碱基从T突变为C，乳腺癌患者化疗毒性增加P=O·038，OR=2·350，95%Cl=I·047-5·276，rs2420946碱基为C的个体化疗后发生不良反应事件机率增加P=0.013，OR=1.652，95%Cl=1.109-2.459，隐形模型（CCvs·CTTT为（P=O·019，0R=0·513，95%CI=0·294-0·895;FGFR2rs2981578碱基从G突变为A，乳腺癌患者化疗毒性增加（P〈0·0001，OR=53·963，95%Cl=7·164-406·486，rs2981578碱基为A的个体化疗后发生不良反应事件机率增加P〈0.0001，OR=3.048，95%Cl=1·868-4·972，显性模型（GGvs·AGAA为（P〈0·0001，OR=5·570，95%Cl=2·852-10.880。结果见表2。[0065]表2单核苷酸多态性与乳腺癌患者不同程度化疗毒性的关联分析结果[0066][0067]实施例三[0068]本实施例为用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒的制作。[0069]SNP试剂盒的制作和操作流程是基于SequenomMassARRAY基因分型平台检测技术。试剂盒含有一批SNP特异性扩增引物包括下列引物:序列为SEQIDNo:1和SEQIDNo:2的rs2420946扩增引物和或序列为SEQIDNo:3和SEQIDNo:4的rs2981578,详见上表1，还可以有相应PCR技术所需的常用试剂，如:dNTPs，MgCl2,双蒸水等，这些常用试剂都是本领域技术人员熟知的，另外还可以有标准品和对照（如确定基因型的标准品和空白对照等）。此试剂盒的价值在于只需要外周血而不需要其它组织样品，通过最精简和特异的扩增引物及延伸引物检测SNP，再通过SNP谱评价接受药物化疗的肿瘤患者毒副反应，不仅稳定，检测方便，且精确，大大提高疾病诊断的敏感性和特异性，因此将此试剂盒投入实践，可以帮助指导高危人群的筛检和更有效的个体化治疗。[0070]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

权利要求：1.一种与乳腺癌化疗毒性相关的SNP标志物，其特征在于，包括FGFR2基因上的rs2420946、FGFR2基因上的rs2981578中的至少一种。2.—种如权利要求1或2所述的SNP标志物的特异性扩增引物，其特征在于，包括rs2420946的扩增引物、rs2981578的扩增引物中的至少一种;其中，rs2420946的扩增引物序列为SEQIDNo:1和SEQIDNo:2，rs2981578的扩增引物序列为SEQIDNo:3和SEQIDNo:4〇3.—种如权利要求3所述的SNP标志物的特异性扩增引物在制备用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒中的应用。4.一种如权利要求1所述的SNP标志物在制备乳腺癌化疗药物中的应用。5.—种用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求2所述的SNP标志物的特异性扩增引物。6.根据权利要求5所述的一种用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括PCR技术常用的试剂。7.根据权利要求5所述的一种用于检测或预测乳腺癌化疗毒性的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测样本为外周血。

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