申请/专利权人：山东水发生命科学研究有限公司

申请日：2017-07-31

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN107306939B

主分类号：A01N1/02(20060101)

分类号：A01N1/02(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.15#授权;2017.11.28#实质审查的生效;2017.11.03#公开

摘要：本发明公开了一种用于树突状细胞的细胞冻存液，在RPMI‑1640培养液中添加有效量的冻存保护剂、细胞稳定剂和防沉剂均匀混合而成，冻存保护剂为二甲基亚砜，细胞稳定剂为人γ球蛋白；防沉剂为多聚‑L‑赖氨酸，多聚‑L‑赖氨酸的分子量范围为3‑7万；二甲基亚砜的体积百分浓度为1‑3％。本发明细胞冻存液用于冻存DCs时可以保证DCs的冻存复苏率和免疫活性，冻存1年内冻存复苏率和免疫活性无明显降低；人γ球蛋白为细胞稳定剂，可以维持DCs的免疫活性；多聚‑L‑赖氨酸为防沉剂，避免储存过程人γ球蛋白向冻存液底部沉降，同时，多聚‑L‑赖氨酸具有部分冻存保护剂的作用，还有助于维持DCs的免疫活性。

主权项：1.一种基于RPMI-1640培养液的细胞冻存液在树突状细胞冻存方面的应用，该细胞冻存液通过在RPMI-1640培养液中添加有效量的冻存保护剂、细胞稳定剂和防沉剂均匀混合而成；所述冻存保护剂为二甲基亚砜；所述细胞稳定剂为人γ球蛋白；所述防沉剂为多聚-L-赖氨酸，多聚-L-赖氨酸的分子量范围为3-7万；该细胞冻存液具体通过如下方法配制而成：先将98mLRPMI-1640培养液和2mL二甲基亚砜混合，再加入人γ球蛋白、多聚-L-赖氨酸，人γ球蛋白、多聚-L-赖氨酸的终浓度分别为10、25μgmL。

全文数据：一种用于树突状细胞的细胞冻存液技术领域[0001]本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种用于树突状细胞的细胞冻存液。背景技术[0002]临床常需大量成熟的树突状细胞DCs，但机体内天然DCs含量少，难以满足临床应用的需要，只能通过体外培养大量获得。成熟DCs需要大量细胞因子维持，花费高、易污染，不利于DCs的临床应用，因此可将制备出的DCs冷冻保存，需要时复苏即可。[0003]为了保持冻存DCs的复苏率和免疫活性，选择合适的冷冻保存方法极其重要。[0004]目前，DCs的冻存方法是采用含有10%二甲基亚砜DMSO、20%胎牛血清FCS的冻存液二步降温。这种方法存在两个明显的不足：[0005]第一，FCS成分复杂，会向DCs中引入污染物和致病原，安全性不易把控；目前有进口冻存液不含FCS如日本ZENOAQ公司生产的Cellbanker细胞冻存液），但是价格昂贵，应用成本过高，限制了其在临床中的使用，尤其是发展中国家和不发达国家；[0006]第二，虽然DMSO是常用的冻存保护剂，但这不代表其不会对细胞造成冻存损伤深低温时DMSO的细胞毒性受到抑制，复苏时动作要快，尽快洗掉二甲基亚砜，否则会造成对细胞严重的毒;但是，本领域技术人员知道，速度再快，细胞毒不可避免），这种损伤限制了复苏率的进一步提高；除非开发新的可以替代DMSO的试剂或降低DMSO的比例。[0007]为了降低DCs的冻存成本，打破进口冻存液的垄断，申请人致力于开发拥有自主产权的DCs冻存液，在保证DCs冻存复苏率和免疫活性的前提下降低成本。发明内容[0008]本发明旨在降低DCs的冻存成本，打破进口冻存液的垄断，提供一种经济、实用、高效的DCs冻存液，在保证DCs冻存复苏率和免疫活性的前提下降低成本。[0009]本发明通过如下技术方案得以实现：[0010]一种基于RPMI-1640培养液的细胞冻存液，在RPMI-1640培养液中添加有效量的冻存保护剂、细胞稳定剂和防沉剂均匀混合而成，冻存保护剂为二甲基亚砜，所述细胞稳定剂为人γ球蛋白；所述防沉剂为多聚-L-赖氨酸，多聚-L-赖氨酸的分子量范围为3-7万;所述二甲基亚砜的体积百分浓度为1-3%。[0011]优选地，人γ球蛋白的质量浓度为8-12ygmL。[0012]优选地，所述多聚-L-赖氨酸在细胞冻存液中的质量浓度为20-30ygmL。[0013]优选地，该细胞冻存液中还含有抗生素。[0014]优选地，抗生素为庆大霉素，浓度为50UmL。[0015]上述细胞冻存液在树突状细胞冻存方面的应用。[0016]本发明优点：[0017]本发明提供的细胞冻存液用于冻存DCs时可以保证DCs的冻存复苏率和免疫活性，冻存1年内冻存复苏率和免疫活性无明显降低;本发明细胞冻存液中，二甲基亚砜为冻存保护剂，减少低温对DCs造成的损伤;人γ球蛋白为细胞稳定剂，可以维持DCs的免疫活性;多聚-L-赖氨酸为防沉剂，避免储存过程人γ球蛋白向冻存液底部沉降，同时，多聚-L-赖氨酸具有部分冻存保护剂的作用，多聚-L-赖氨酸的存在使得DMSO的体积浓度从现有技术的10-20%可以降低到本发明的1-3%而依然能避免低温对DCs造成的损伤;另外，多聚-L-赖氨酸还有助于维持DCs的免疫活性。本发明提供的细胞冻存液对DCs冻存效果与日本ZENOAQ公司生产的CelIbanker细胞冻存液基本一致，但是成本仅有该进口冻存液的约110。附图说明[0018]图1为DCs在3、6、9和12月后的冻存复苏率（％;[0019]图2为DC-CIK对K562的杀伤率（％。具体实施方式[0020]为了更好地解释本发明的技术方案，下面结合具体实施例进一步介绍。实施例中未特别强调的实验材料均为常规实验材料，属于本领域技术人员易于获得的范畴。[0021]实施例1:细胞冻存液的制备[0022]试剂来源：[0023]RPMI-1640培养液，Gibco;[0024]二甲基亚砜，百灵威科技有限公司；[0025]人γ球蛋白（CAS号:9007-83-4，上海士锋生物科技有限公司；[0026]多聚-L-赖氨酸MW3-7万，A0057-250mg，上海士锋生物科技有限公司。[0027]细胞冻存液的制备：[0028]以100mLRPMI-1640培养液为溶剂，以二甲基亚砜、人γ球蛋白、多聚-L-赖氨酸为溶质，将溶剂和溶质混合而成。具体为：先将98mLRPMI-1640培养液和2mL二甲基亚砜混合，再加入人γ球蛋白、多聚-L-赖氨酸，人γ球蛋白、多聚-L-赖氨酸终浓度分别为10、25ygmL〇[0029]配制好后，置于4°C冰箱中保存。[0030]其中，多聚-L-赖氨酸可以起到防止人γ球蛋白沉降的作用。发明人在一个具体实施方案中，采用不添加多聚-L-赖氨酸的细胞冻存液作为对比，也置于4°C冰箱中保存，30天后从液面至瓶底按照高度均匀取3个样品测定其中γ球蛋白的浓度，结果中间高度样品中γ球蛋白的浓度约为液面处浓度的5倍，瓶底处样品中γ球蛋白的浓度约为液面处浓度的11倍。而添加多聚-L-赖氨酸的细胞培养液不存在沉降，4°C静置6个月后三个高度处的浓度无显著差异。[0031]当然，为了避免污染，也可以在细胞培养中添加适量抗生素，如50UmL庆大霉素。[0032]另配制对比冻存液备用，该对比冻存液与上述细胞冻存液相比仅不添加多聚-L-赖氨酸。[0033]实施例2:DCs增殖培养、冻存、复苏、复苏率和免疫活性检测[0034]一、实验材料和方法[0035]l、DCs和CIK的制备[0036]单个核细胞的培养：取肝素抗凝的健康志愿者外周血20ml，用淋巴细胞分离液密度梯度离心（2400Xg，20min，轻轻吸取灰白色层的单个核细胞，置于15ml离心管中，用RPMI-1640Gibco培养液离心洗涤3次（2000Xg，5min。用无血清培养基UltraCULTURETM北京惠特比科技悬浮细胞，调整细胞密度为IXIO5Ail，加入细胞培养瓶中，置37°C、5%CO2孵箱中培养2h后，轻摇细胞瓶。[0037]CIK细胞的诱导：将上述细胞瓶中的悬浮的细胞吸到另一培养瓶中，调整密度为1XlOfVml，用含有IL-21000Uml、CD3-McAbl00ngml的UltraCULTURETM诱导CIK细胞，每2-3d半量换液，第12天时收集CIK备用。[0038]DCs细胞的诱导:将上述细胞瓶中的贴壁细胞用含有100ngmlhGM-CSF和lOOOUmlIL-4的UltraCULTURETM继续培养，2-3d半量换液，到第12天时收集诱导的DCs细胞。[0039]用锥虫蓝染色计数活细胞数。将一部分细胞做杀伤活性测定，另一部分细胞冻存。[0040]2、DCs的冻存和复苏[0041]将DCs分别用实施例1制备的本发明冻存液和对比冻存液临用现配稀释成3.5X105ml，各分装出4管先置于-80°C低温冰箱降温12小时，再置于-196Γ液氮中保存。分别于3、6、9和12月各从液氮中各取出1支，迅速放入40°C水浴复温，待细胞融化后立即吸出细胞悬液，用RPMI-164KGibco培养液离心洗涤，并用锥虫蓝染色检测DCs复苏率。[0042]DCs复苏后用含有100ngmlhGM-CSF和1000UmlIL-4的UltraCULTURETM无血清培养基继续培养2d，收集DCs备用。[0043]3、MTT法检测DC-CIK的杀伤活性[0044]培养第12天的CIK和复苏后再培养2d的DCs按6:1比例相混合，调整细胞数为IXIOfVml，用含有IL-2lOOOUml、hGM-CSF100ngml的UltraCULTURETM培养4d，SP共培养的DC-CIK，调整密度为4X105ml，加入含有K562细胞的96孔细胞培养板中（效靶比20:1，以此作为实验组。另外单独加入DC-CIK和单独加入K562细胞，每组5复孔，作为对照组。置37°C、5%CO2孵箱中继续培养48h，离心弃上清，每孔加20μ1ΜΤΤ5mgml，放置37°C、5%CO2孵箱中培养4h，离心弃上清，每孔加二甲基亚砜100μ1，振荡溶解。15min后酶标仪570nm波长测D值。按照下式计算DC-CIK的杀伤率：[0045]杀伤率（％=【1-实验组D-单独DC-CIK组D单独K562细胞D】X100%。[0046]二、实验结果[0047]l、DCs复苏率[0048]以实施例1制备的本发明冻存液和对比冻存液为冻存保护剂分别对DCs冻存3、6、9和12月复苏率如表1和图1所示。与对比冻存液比，本发明冻存液复苏率更高，冻存保护效果更好，这说明在没有多聚-L-赖氨酸存在时，2%浓度的DMSO不足以有效避免细胞冻存损伤。[0049]表IDCs在3、6、9和12月后的冻存复苏率（％[0051]2、DC-CIK对K562的杀伤活性[0052]培养第12天的CIK和冻存3、6、9和12月复苏后再培养2d的DCs共培养的DC-CIK对K562细胞的杀伤率如表2和图2所示。与对比冻存液比，本发明冻存液对K562细胞的杀伤率更高，DCs免疫活性维持更优，这说明多聚-L-赖氨酸还有助于维持冻存DCs的免疫活性。[0053]表2DC-CIK对K562的杀伤率（％[0055]上述实施例可以证明，本发明提供的细胞冻存液用于冻存DCs时可以保证DCs的冻存复苏率和免疫活性，冻存1年内冻存复苏率和免疫活性无明显降低;本发明细胞冻存液中，二甲基亚砜为冻存保护剂，减少低温对DCs造成的损伤;人γ球蛋白为细胞稳定剂，可以维持DCs的免疫活性;多聚-L-赖氨酸为防沉剂，避免储存过程人γ球蛋白向冻存液底部沉降，同时，多聚-L-赖氨酸具有部分冻存保护剂的作用，多聚-L-赖氨酸的存在使得DMSO的体积浓度从现有技术的10-20%可以降低到本发明的1-3%而依然能避免低温对DCs造成的损伤;另外，多聚-L-赖氨酸还有助于维持DCs的免疫活性。[0056]上述实施例仅用于进一步解释本发明的技术方案，本领域技术人员应当明白，任何简单替换或修改均不脱离本发明，本发明的保护范围并不受限于上述具体实施例。

权利要求：1.一种基于RPMI-1640培养液的细胞冻存液，在RPMI-1640培养液中添加有效量的冻存保护剂、细胞稳定剂和防沉剂均匀混合而成，冻存保护剂为二甲基亚砜，其特征在于:所述细胞稳定剂为人γ球蛋白；所述防沉剂为多聚-L-赖氨酸，多聚-L-赖氨酸的分子量范围为3-7万;所述二甲基亚砜的体积百分浓度为1-3%。2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于:人γ球蛋白的质量浓度为8-12ygmL〇3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于:所述多聚-L-赖氨酸在细胞冻存液中的质量浓度为20-30ygmL。4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于:该细胞冻存液中还含有抗生素。5.根据权利要求4所述的细胞冻存液，其特征在于:抗生素为庆大霉素，浓度为50UmL。6.权利要求1-5任一所述细胞冻存液在树突状细胞冻存方面的应用。

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