申请/专利权人：福建农林大学

申请日：2017-07-17

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN107446953B

主分类号：C12N15/89(20060101)

分类号：C12N15/89(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.15#授权;2018.01.05#实质审查的生效;2017.12.08#公开

摘要：本发明公开了一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得该基因的全基因序列并测序；2）根据步骤1）得到的DNA序列确定实验的DNA片段，PCR扩增并纯化DNA片段；3）将步骤2）得到的DNA片段利用微量注射的方法注射入昆虫体内；4）对步骤3）的昆虫进行RT‑qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。

主权项：1.一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1）确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得该基因的全基因序列并测序；2）根据步骤1）得到的全基因序列，在外显子和内含子上分别确定PCR扩增区域，并PCR扩增和纯化得到实验所需的外显子DNA片段与内含子DNA片段；所述外显子DNA片段序列如SEQIDNO.2所示，内含子DNA片段序列如SEQIDNO.3所示；3）将步骤2）得到的外显子DNA片段和内含子DNA片段，利用微量注射的方法分别注射入昆虫体内；4）对步骤3）的昆虫进行RT-qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平；步骤1）所述的靶标基因为小菜蛾鞣化激素α亚基基因，该基因序列如SEQIDNO.1所示；步骤3）中的昆虫为福州敏感品系小菜蛾四龄幼虫。

全文数据：一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法技术领域[0001]本发明涉及一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，属于生物技术领域。背景技术[0002]同源依赖性基因沉默被广泛应用于分子生物学的研宄，主要通过降低转录产物而减少蛋白的合成，从而使其丧失原有的功能。目前用于调控基因表达的同源片段大多数为反义RNA与双链RNA;随着研宄的发现，DNA片段的导入也可引起基因的沉默，被称为DNA干扰DNAinterference〇[0003]目前的研宄指出，将铁线蕨内源基因的dsDNA片段引入配子体细胞可引起基因的沉默，使内源基因的表达量降低（1^*3：[-1'07001«11.,11^311101：00.，01'11：11.，6£3_1.DNAInterference:aSimpleandEfficientGene-SilencingSystemforHigh-ThroughputFunctionalAnalysisintheFernAdiantum[J].PlantandCellPhysiology,2004，4511:1648-1657;无启动子的基因在水蕨上也能导致合成叶绿素必需的镁螯合酶基因CrCTiJJ以及和Otrod的基因沉默（RutherfordG,TanurdzicM,HASEBEM,etal.Asystemicgenesilencingmethodsuitableforhighthroughput,reversegeneticanalysesofgenefunctioninferngametophytes[J].BMCPlantBiology,2004，41:6;此外，在尾海鞘的胚胎中，导入纯化的PCR产物，也可使基因的表达量降低，且基因的5’UTR、3’UTR，以及外显子和内含子的导入都可引起基因的沉默（OmotezakoT,OnumaTA,NishidaH.DNAinterference:DNA—inducedgenesilencinginthea卯endicularianOiicop』euradioica[J].ProceedingsoftheRoyalSocietyB-BiologicalSciences,2015,2821807:doi.org10•1098rspb•2015•0435;另外，将含有GFP基因全长cDNA序列的无启动子质粒转入整合有GFP基因的胰腺癌panc-l细胞中，可观察到细胞中荧光的表达强度下降，且蛋白的表达也减少任新瑜，梁智勇，师晓华，etah同源无启动子DNA片段抑制人胰腺癌细胞株整合基因的表达[J]•中华病理学杂志，2007，368:539-543。[0004]目前，虽然己在部分生物体内发现PCR产物抑制基因表达的现象，但是在昆虫中至今还未有报道。因此，我们结合这一现象设计了以下的试验，以求通过PCR产物来达到抑制小菜蛾基因的表达。发明内容[0005]针对上述问题，本发明公开了一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法。[0006]本发明的技术方案如下：一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，依次包括下述步骤：1确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得其DNA序列并测序；2根据步骤1得到的DNA序列，确定外显子和内含子的DNA片段，分别PCR扩增并纯化得到实验所需的外显子与内含子DNA片段；3将步骤2得到的外显子和内含子DNA片段利用微量注射的方法分别注射入昆虫体内；4对步骤3的昆虫进行RT-qPCR的检测，确定其目的基因的相对表达水平。[0007]步骤1所述的靶标基因为小菜蛾鞣化激素a亚基基因（Bursa该基因mRNA的GenBank：KJ783481.1〇[0008]步骤2中设计的外显子DNA片段大小为122bp，内含子DNA片段大小为115bp。[0009]步骤3中的昆虫为福州敏感品系小菜蛾四龄幼虫。[0010]步骤3中用到的注射针是利用拉针仪，采用一步法所制得的毛细玻璃注射针。[0011]步骤3中注射的DNA片段浓度为100-400ngyL。[0012]步骤4中RT-qPCR检测的内参基因是核糖体蛋白L8基因。[0013]步骤4中基因的相对表达水平的计算采用2_AAGT方法。[0014]本发明具有以下优点：1.本发明提供的方法操作简单易行，DNA片段容易获得和保存。[0015]2.本发明通过注射DNA可有效抑制基因表达。[0016]3.本发明为昆虫的基因抑制提供了新思路和方向。附图说明[0017]图1为本发明具体实施例1注射PCR纯化产物后，鞣化激素a亚基基因的相对表达量。备注:在相同浓度下，相同字母间表示差异不显著，不同字母间表示差异显著。具体实施方式[0018]下面结合具体实施方式，对本发明做进一步的详细说明，但不限定本发明。下述具体实施中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述具体实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。PCR所用的Taq酶购自厦门泰京生物技术有限公司，RNase-FreeWater和qPCR反应试剂盒均购自普洛麦格生物技术有限公司，反转录试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司，TRIzol试剂购自ambion公司，DNA合成与测序则在铂尚生物公司。[0019]实验方法：1.DNA片段的设计及扩增:选择靶标基因，PCR扩增得到基因全长，并将其送去测序获得基因序列;根据测序得到的DNA序列选取实验的片段，设计PCR引物，扩增后纯化待用。[0020]2•注射:拉针并将针安装到Nanoliter2010纳升微量注射泵上，吸取溶解成一定浓度的DNA片段并对实验昆虫进行注射。[0021]3.取样:注射后24h取样，将样品用液氮保存后待用。[0022]4•基因表达水平检测：提取保存样品的RNA，并反转录得到cDNA，利用qPCR试剂盒检测靶标基因的相对表达量。[0023]实施例11.确定小菜蛾鞣化激素Q亚基基因为靶标基因，以小菜蛾基因组数据库中的小菜蛾鞣化激素a亚基基因为模板，设计一对引物。[0024]上游引物01F:5，_GATTTMCTGTTTGTCAAATGCA-3，上游引物01R:5'_ACACTGATCMGAGATTTATTATAGT-3'用上述引物进行PCR，得到大约750bp包括部分5’UTR和3’UTR的PCR产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送于钼尚公司测序，测序结果表明PCR产物的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0025]2•小菜蛾精鞣化激素a亚基基因第二段外显子和第二段内含子扩增引物如下，?〇財广增并纯化后，稀释得到的产物外显子3£〇10^.2，内含子3£〇10^.33稀释浓度为100ngyL，l7〇ngyL，28〇ngyL，400ngAiL。[0026]上游引物Exon2-F:5'_AGGTTTCGGGMGTMAATCTG-3，上游引物Exon2-R:5'_TTCGAAACTTCTTATCTTCACTTTTGG-3'上游引物Intron2-F:5'_GTATCATCATCATCAGCCTATAGC-3'上游引物Intron2-R:5'_MTGATGAGTTGCAGAAAGG-3'3.利用拉针仪，采用一步法温度设置在65°C将毛细玻璃管制成微量注射针，180°C干燥灭菌2小时。[0027]选取福州小菜蛾敏感品系四龄小菜蛾幼虫为供试虫体。[0028]将已开口并灌入硅油的针安装到Nanoliter2010纳升微量注射栗上，然后利用注射栗的控制装置将硅油打出，之后再吸取注射溶液入注射针中，确定注射针可以工作后，一手轻压虫体头部，一手持注射装置将针头从虫体背部接近尾部的地方插入，脚踩控制器两次，注射完成后拔出针头，再对另一只供试虫进行同样的操作，实验中，水与EGFP处理对照组组以及其他处理组的注射操作均参照上述的描述。[0029]4.将注射后的虫体按处理组分，放在不同的盒子内饲养。饲养温度26±1。：，饲养湿度60%-80%，每天供应新鲜的萝卜叶。[0030]注射后的第24小时进行取样，每个处理三次生物学重复，每个重复取5头试虫。所有取出的样品用液氮冷冻后，于_8TC保存待用。[0031]5•用TRIzol试剂提取样品的RNA，再用反转录试剂盒将其反转录得到cDNA。根据小菜蛾核糖体蛋白L8基因序列GenBank:XMJ11559216和小菜蛾鞣化激素a亚基基因序列SEQIDN0.1，分别设计qPCR所需的引物对qi?PLS-Fqi?PLS-R和qSursa-FqSursa-R。[0032]qi?PL5-F：5,-CGGTCGTGCCTACCACAAATACA-37；qRPL8~R:5^CGTGAGGATGCTCCACAGGGT-3;；qBursa-F：5'-CCTGAGAGAGCGGATAGT-37；qBursa-R：5,-ATCATAGCAAACTCCTCC-3'；用qPCR反应试剂盒检测各样品cDNA中鞣化激素a亚基基因和核糖体L8基因的表达情况，然后采用2_AACT方法计算精氨酸激酶基因的相对表达量。[0033]6•注射不同浓度纯化PCR产物后，对小菜蛾蛹期Bursa的表达量进行了检测，经单因素方差分析和S-N-K多重比较，发现不同浓度处理组组间存在显著差异。当注射浓度为100nguL时，不同处理间基因表达量存在差异和4.385，姐=3，跑=8，？=0.042，且两处理组间基因的表达量无显著差异，但与水处理组间存在显著差异，分别下降了30.0%注射外显子PCR产物，序列见SEQIDN0.2和27_5%注射内含子PCR产物，序列见SEQIDN0.3。当注射浓度为170nguL时，不同处理间基因表达量存在差异7=14.684，办1=3，從2=8，尸=〇.〇〇1，且与水对照组相比，处理组Bursa的表达量分别下降了57.〇%注射外显子PCR产物）和68.0%注射内含子PCR产物）；注射浓度为280ng此时，不同处理间基因表达具有显著差异F=19.035，dfi=3，df2=8，P=〇•001，且与水对照组相比，处理组仙rsa的表达量分别下降了37•5%注射外显子PCR产物和58•3%注射内含子PCR产物）；当注射浓度为4〇〇ngwL时，不同处理间基因表达具有显著差异F=5.423，df1=3，跑=8，卜〇•〇25，小菜蛾蛹期Sursa的表达量与水对照组相比明显被抑制，Burscr的表达量分别下降了57•0%注射外显子^尺产物和45.0%注射内含子PCR产物）。

权利要求：1.一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，依次包括下述步骤：1确定昆虫靶标基因，PCR扩增获得该基因的全基因序列并测序；2根据步骤1得到的全基因序列，在外显子和内含子上分别确定PCR扩增区域，并PCR扩增和纯化得到实验所需的外显子与内含子DNA片段；3将步骤2得到的外显子和内含子DNA片段，利用微量注射的方法分别注射入昆虫体内；4对步骤3的昆虫进行RT-qPCR的检测，确定其靶标基因的相对表达水平。2.根据权利要求1所述的一种利用DNA的PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤1所述的靶标基因为小菜蛾鞣化激素a亚基基因。3.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制基因表达的方法，其特征在于，步骤2中设计的外显子DNA片段大小为122bp，内含子DNA片段大小为115bp。4.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤3中的昆虫为福州敏感品系小菜蛾四龄幼虫。5.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤3中用到的注射针是利用拉针仪，采用一步法所制得的毛细玻璃注射针。6.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤3中注射的DNA片段浓度为1〇〇-400nguL。7.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤4中RT-qPCR检测的内参基因是核糖体蛋白L8基因。8.根据权利要求1所述的一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法，其特征在于，步骤4中基因的相对表达水平的计算采用fAACT。

百度查询： 福建农林大学 一种利用PCR产物抑制昆虫基因表达的方法

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