申请/专利权人：泉州易初生物医药科技有限公司

申请日：2017-02-28

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN108503643B

主分类号：C07D473/34(20060101)

分类号：C07D473/34(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.03.15#未缴年费专利权终止;2020.09.15#授权;2018.10.09#实质审查的生效;2018.09.07#公开

摘要：本发明涉及一种Grp94特异性的Hsp‑90抑制剂，提供一种蛋白酶抑制剂的制备方法，解决现有技术关于该制备方法的空白缺陷，包括以下处理步骤：在三口烧瓶中，放入无水的二甲基甲酰胺，氮气保护下，先加入3,5‑二氯苯硫酚，搅拌完全溶解后，再慢慢加入氢化钠，常温下搅拌反应1小时；然后再边搅拌边加入8‑溴‑9‑3‑异丙胺基正丙基腺嘌呤，加完后慢慢升高温度至150度，回流反应6小时；反应完全后冷却到室温，将反应液慢慢加入到水中，淬灭未反应的氢化钠，用二氯甲烷甲醇混合溶液萃取，有机相再用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次洗涤，再用饱和碳酸氢钠多次萃取之后，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，用柱层析过柱提纯。

主权项：1.蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下处理步骤：在三口烧瓶中，放入无水的二甲基甲酰胺200ml，氮气保护下，先加入3,5-二氯苯硫酚14～16g，搅拌使其完全溶解后，再慢慢加入氢化钠2～3g，常温下搅拌反应1小时；然后再边搅拌边加入8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤20～24.5g，加完后慢慢升高温度至150℃，回流反应6～7小时；反应完全后冷却到室温，将反应液慢慢加入到水中，淬灭未反应的氢化钠，用二氯甲烷甲醇＝101混合溶液萃取，有机相再用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次洗涤，再用饱和碳酸氢钠多次萃取之后，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，用柱层析过柱提纯，得到纯品PU-WS13；所述3,5-二氯苯硫酚的制备方法为：13,5-二氯苄基苯硫酚的制备：在干燥反应瓶中，加入二甲基亚砜20～25ml，搅拌下将均三氯苯2～3g、苄硫醇1.37～1.4g、碘化亚铜212～215mg、苯并三氮唑130～132mg和叔丁醇钾1.74～1.76g逐一慢慢溶于二甲基亚砜中，并保持温度在40℃以下，而后慢慢升高温度至100℃，在此条件下搅拌反应16小时；反应结束后冷却到室温，将反应液倒入碳酸氢钠溶液50～55ml中，并用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，得到粗品3,5-二氯苄基苯硫酚，所得粗品用柱层析分离提纯，得到纯品3,5-二氯苄基苯硫酚；2接着在干燥反应瓶中，放入无水甲苯30～35ml，并加入纯品3,5-二氯苄基苯硫酚1.5～1.7g，搅拌到原料全部溶解后，再慢慢加入固体钠2.9～3.0g，在氮气保护下，回流反应10小时；待反应完成后，用冰水冷却至0℃，用乙醇小心淬灭多余的固体钠，而后加入氯化铵水溶液80～85ml，调节溶液至酸性，并用乙酸乙酯50～60ml萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，柱层析纯化，可得到纯品3,5-二氯苯硫酚；所述8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤的制备方法为：a、8-溴腺嘌呤的制备：先将腺嘌呤40～45g加入烧瓶中，在机械搅拌下加入液溴100～107ml，加入过程要缓慢，然后常温下搅拌3小时；反应完毕后，加入亚硫酸氢钠溶液除去多余的液溴，再用氨水调节反应液成中性，析出白色粉末状固体；过滤，固体用冰水洗涤，得到8-溴腺嘌呤；b、8-溴-9-溴丙基腺嘌呤的制备：在三口烧瓶中，先将8-溴腺嘌呤8～10g溶于二甲基甲酰胺60～70ml中，搅拌至完全溶解后，再慢慢加入1,3-二溴丙烷15～20g和碳酸铯16～20g，升高温度至100℃，在此温度下搅拌反应16小时；反应完成后冷却至室温，倒入纯水中，用二氯甲烷甲醇＝101混合溶液萃取，有机相再用饱和氯化铵溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，所得粗品用柱层析提纯，得到纯品8-溴-9-溴丙基腺嘌呤；c、8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤：在烧瓶中先放入80ml的二甲基甲酰胺，一边搅拌一边慢慢加入8-溴-9-溴丙基腺嘌呤5～7g，异丙胺12.5～15g和三乙胺15～20ml，加完后，常温搅拌16小时；反应后，先用40℃旋蒸，除去多余的异丙胺和三乙胺，其余反应液用乙酸乙酯稀释，然后用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次萃取，再用饱和碳酸氢钠萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩，用柱层析法提纯，得到纯品8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤。

全文数据：蛋白酶抑制剂的制备方法技术领域[0001]本发明涉及一种GrP94特异性的HSP-90抑制剂，尤其涉及一种蛋白酶抑制剂的制备方法。背景技术[0002]Grp特异性抑制剂是一种很热门的蛋白酶新型抑制剂。Grpglucoseregulatedproteins即葡萄糖调节蛋白，是一类分布在内质网腔中的应激蛋白，其主要成员为Grp78和Grp94,它们参与蛋白质合成时新生肽链的折叠，行使分子伴侣功能。分子伴侣通过确保蛋白质合成后的适当折叠以及它们在变形应激的条件下重折叠在细胞功能中发挥重要作用，分子伴侣是对应激的细胞反应的重要部分，此外，通过调节各种细胞蛋白质的适当折叠，分子伴侣在调节细胞功能（例如细胞增殖和编程性死亡中）发挥重要的作用。热休克蛋白（Hsp是一类因对各种环境应激，例如热休克、氧化应激或醇或重金属的存在发生反应而蓄积在细胞中的分子伴侣，除了它们在保护细胞免受所述环境应激中的作用外，在无应激条件下Hsp作为多种细胞蛋白的分子伴侣还可以发挥重要的作用。[0003]Hsp是同一种同源二聚体，其在一系列与多种底物蛋白的复合相互作用中具有ATP酶活性和功能。但是，相对于其它分子伴侣，Hsp-90是独特的，因为其已知底物蛋白中的大多数是信号转导蛋白，因此，Hsp-90在调节细胞信号转导网络中发挥重要作用。特别是，Hsp-90的底物蛋白包括许多与癌症有关的突变蛋白或过度表达的蛋白，例如，p53、Bcr-Abl激酶、Raf-1激酶、Akt激酶、Npm-Alk激酶。因此，Hsp-90的抑制导致这些重要的信号蛋白选择性降解，所述信号蛋白参与细胞编程性死亡、细胞增殖和细胞周期调节。因此，因为这些信号蛋白在涉及异常细胞生长的疾病状态例如癌症中所发挥的重要作用，所以Hsp-90是一种令人注目的治疗靶。因此，发展和开发Hsp-90活性的新抑制剂是合乎需要的。（文献：（aPatelPD，YanP，etal;NatChemBiol.2013,9ll，677.b任景，严碧波等；药学学报，2015,506，640.c朱江，李慧玉等；肿瘤防治研究，2010,3712，1442.⑹罗浩铭，孙薇等;药学学报，2010,457，813.。[0004]研究表明，PU-WS13做为一种高效Grp94特异性的Hsp-90抑制剂，能够有效地降低乳腺癌细胞表面HER2的过量表达，并且能强烈抑制人类多发性骨髓瘤细胞在体外环境的活动和生存，是未来很有希望的一种抗癌性新型药物。但目前关于该物质的制备方法甚少。发明内容[0005]因此，针对以上内容，本发明提供一种蛋白酶抑制剂的制备方法，解决现有技术关于该制备方法的空白缺陷。[0006]为达到上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下处理步骤：[0007]在三口烧瓶中，放入无水的二甲基甲酰胺200ml，氮气保护下，先加入3，5-二氯苯硫酚14〜16g，搅拌使其完全溶解后，再慢慢加入氢化钠2〜3g，常温下搅拌反应1小时;然后再边搅拌边加入8-溴-9-3-异丙胺基）正丙基腺嘌呤20〜24.5g，加完后慢慢升高温度至150度，回流反应6〜7小时；[0008]反应完全后冷却到室温，将反应液慢慢加入到水中，淬灭未反应的氢化钠，用二氯甲烷甲醇=101混合溶液萃取，有机相再用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次洗涤，再用饱和碳酸氢钠多次萃取之后，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，用柱层析过柱提纯，得到纯品PU-WS13〇[0009]进一步的改进是:所述3，5_二氯苯硫酸的制备方法为：[0010]⑴3，5-二氯苄基苯硫酚的制备：在干燥反应瓶中，加入二甲基亚砜20〜25ml，搅拌下将均三氯苯2〜3g、苄硫醇1.37〜1.4g、碘化亚铜212〜215mg、苯并三氮唑130〜132mg和叔丁醇钾1.74〜1.76g逐一慢慢溶于二甲基亚砜中，并保持温度在40度以下，而后慢慢升高温度至100度，在此条件下搅拌反应16小时;反应结束后冷却到室温，将反应液倒入碳酸氢钠溶液50〜55ml中，并用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，得到粗品3,5_二氯苄基苯硫酚，所得粗品用柱层析分离提纯，得到纯品3，5-二氯苄基苯硫酚；[0011]2接着在干燥反应瓶中，放入无水甲苯30〜35ml，并加入纯品3,5_二氯苄基苯硫酚1.5〜1.7g，搅拌到原料全部溶解后，再慢慢加入固体钠2.9〜3.Og，在氮气保护下，回流反应10小时;待反应完成后，用冰水冷却至0度，用乙醇小心淬灭多余的固体钠，而后加入氯化铵水溶液80〜85ml，调节溶液至酸性，并用乙酸乙酯50〜60ml萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，柱层析纯化，可得到纯品3，5-二氯苯硫酚。[0012]进一步的改进是:所述8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺噪呤的制备方法为：[0013]18-溴腺嘌呤的制备：[0014]先将腺嘌呤40〜45g加入烧瓶中，在机械搅拌下加入液溴100〜107ml，加入过程要缓慢，然后常温下搅拌3小时；[0015]反应完毕后，加入亚硫酸氢钠溶液除去多余的液溴，再用氨水调节反应液成中性，析出白色粉末状固体。过滤，固体用冰水洗涤，得到8-溴腺嘌呤；[0016]28-溴-9-溴丙基腺嘌呤的制备：[0017]在三口烧瓶中，先将8-溴腺嘌呤8〜IOg溶于二甲基甲酰胺60〜70ml中，搅拌至完全溶解后，再慢慢加入1，3-二溴丙烷15〜20g和碳酸铯16〜20g，升高温度至100度，在此温度下搅拌反应16小时；[0018]反应完成后冷却至室温，倒入纯水中，用二氯甲烷甲醇=101混合溶液萃取，有机相再用饱和氯化铵溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，所得粗品用柱层析提纯，得到纯品8-溴-9-溴丙基腺嘌呤；[0019]38-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤：[0020]在烧瓶中先放入80ml的二甲基甲酰胺，一边搅拌一边慢慢加入8-溴-9-溴丙基腺嘌呤5〜7g，异丙胺12.5〜15g和三乙胺15〜20ml，加完后，常温搅拌16小时；[0021]反应后，先用40度旋蒸，除去多余的异丙胺和三乙胺，其余反应液用乙酸乙酯稀释，然后用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次萃取，再用饱和碳酸氢钠萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩，用柱层析法提纯，得到纯品8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤。[0022]通过采用前述技术方案，本发明的有益效果是:本发明PU-WS13的制备方法，其制备过程为：[0023；[0024]得到的PU-WS13纯度高，解决了现有技术中关于PU-WS13的制备方法的空白。附图说明[0025]图1为本发明实施例的蛋白酶抑制剂的结构鉴定图谱。具体实施方式[0026]以下将结合具体实施例来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。[0027]若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明。[0028]本发明的实施例为：[0029]参考图1，蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下处理步骤：[0030]13，5-二氯苄基苯硫酚的制备：[0031]在干燥反应瓶中，加入二甲基亚砜（20ml，搅拌下将均三氯苯（2g、苄硫醇1.37g、碘化亚铜（212mg、苯并三氮唑（132mg和叔丁醇钾（I.74g逐一慢慢溶于二甲基亚砜20ml中，并保持温度在40度以下，而后慢慢升高温度至100度，在此条件下搅拌反应16小时；[0032]反应后冷却到室温，将反应液倒入碳酸氢钠溶液50ml中，并用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，得到粗品3,5_二氯苄基苯硫酚，所得粗品用柱层析分离提纯，得到纯品3，5-二氯苄基苯硫酚，白色固体248mg，产率83.7%;[0033]23，5-二氯苯硫酚的制备：[0034]在干燥反应瓶中，放入无水甲苯30ml，并加入3,5-二氯节基苯硫酸1.7g，搅拌到原料全部溶解后，再慢慢加入固体钠2.9g，在氮气保护下，回流反应10小时；[0035]待反应完成后，用冰水冷却至0度，用乙醇小心淬灭多余的固体钠，而后加入氯化铵水溶液80ml，调节溶液至酸性，并用乙酸乙酯60ml萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，柱层析纯化，可得到纯品3，5-二氯苯硫酸，白色固体960mg，产率84.9%;[0036]⑶8-溴腺嘌呤的制备：[0037]先将腺嘌呤40g加入烧瓶中，在机械搅拌下加入液溴（107ml，加入过程要缓慢，然后常温下搅拌3小时；[0038]反应完毕后，加入亚硫酸氢钠溶液除去多余的液溴，再用氨水调节反应液成中性，析出白色粉末状固体。过滤，固体用冰水洗涤，得到8-溴腺嘌呤，淡黄色固体54g，产率85.7%；[0039]⑷8-溴-9-溴丙基腺嘌呤的制备：[0040]在三口烧瓶中，先将8-溴腺嘌呤Sg溶于二甲基甲酰胺60ml中，搅拌至完全溶解后，再慢慢加入1，3_二溴丙烷（15g和碳酸铯（16g，升高温度至100度，在此温度下搅拌反应16小时；[0041]反应完成后冷却至室温，倒入纯水中，用二氯甲烷甲醇=101混合溶液（IOOml萃取，有机相再用饱和氯化铵溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，所得粗品用柱层析提纯，得到纯品8-溴-9-溴丙基腺嘌呤，白色固体5.4g，产率54%;[0042]58-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤：[0043]在烧瓶中先放入80ml的二甲基甲酰胺，一边搅拌一边慢慢加入8-溴-9-溴丙基腺嘌呤5g，异丙胺（12.5g和三乙胺（15ml，加完后，常温搅拌16小时；[0044]反应后，先用40度旋蒸，除去多余的异丙胺和三乙胺。其余反应液用乙酸乙酯200ml稀释，然后用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次萃取，再用饱和碳酸氢钠萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩，用柱层析法提纯，得到纯品8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤，白色固体4.08g，87.7%;[0045]⑹蛋白酶抑制剂的制备：[0046]在三口烧瓶中，放入无水的二甲基甲酰胺200ml，氮气保护下，先加入3，5-二氯苯硫酚（Hg，搅拌使其完全溶解后，再慢慢加入氢化钠3g，常温下搅拌反应1小时;然后再边搅拌边加入8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤24.5g，加完后慢慢升高温度至150度，回流反应6小时；[0047]反应完全后冷却到室温，将反应液慢慢加入到水中，淬灭未反应的氢化钠，用二氯甲烷甲醇=101混合溶液萃取，有机相再用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次洗涤，再用饱和碳酸氢钠多次萃取之后，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，用柱层析过柱提纯，得到纯品蛋白酶抑制剂，淡黄色固体24·8g，产率83·2%，1H-匪R400MHz，DMS〇-d6:8·62-8·65m，1H，8.43s,lH,8.24-8.26m,lH,8.11-8.12m,1H,7.50-7.51m,2H,7.46-7.47m,1H,4.38-4.42t,2H，3·31m,lH，2.90-2.93m,2H，2.22-2.26t,2H，1.18-1.20d,6H。[0048]以上所记载，仅为利用本创作技术内容的实施例，任何熟悉本项技艺者运用本创作所做的修饰、变化，皆属本创作主张的专利范围，而不限于实施例所揭示者。

权利要求：1.蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于，包括以下处理步骤：在三口烧瓶中，放入无水的二甲基甲酰胺200ml，氮气保护下，先加入3，5-二氯苯硫酚14〜16g，搅拌使其完全溶解后，再慢慢加入氢化钠2〜3g，常温下搅拌反应1小时;然后再边搅拌边加入8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤20〜24.5g，加完后慢慢升高温度至150度，回流反应6〜7小时；反应完全后冷却到室温，将反应液慢慢加入到水中，淬灭未反应的氢化钠，用二氯甲烷甲醇=101混合溶液萃取，有机相再用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次洗涤，再用饱和碳酸氢钠多次萃取之后，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，用柱层析过柱提纯，得到纯品PU-WS13〇2.根据权利要求1所述的蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于:所述3，5-二氯苯硫酚的制备方法为：13，5-二氯苄基苯硫酚的制备:在干燥反应瓶中，加入二甲基亚砜20〜25ml，搅拌下将均三氯苯2〜3g、苄硫醇1.37〜1.4g、碘化亚铜212〜215mg、苯并三氮唑130〜132mg和叔丁醇钾1.74〜1.76g逐一慢慢溶于二甲基亚砜中，并保持温度在40度以下，而后慢慢升高温度至100度，在此条件下搅拌反应16小时;反应结束后冷却到室温，将反应液倒入碳酸氢钠溶液50〜55ml中，并用乙酸乙酯萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，得到粗品3,5_二氯苄基苯硫酚，所得粗品用柱层析分离提纯，得到纯品3，5-二氯苄基苯硫酚；2接着在干燥反应瓶中，放入无水甲苯30〜35ml，并加入纯品3，5-二氯苄基苯硫酚1.5〜1.7g，搅拌到原料全部溶解后，再慢慢加入固体钠2.9〜3.Og，在氮气保护下，回流反应10小时;待反应完成后，用冰水冷却至0度，用乙醇小心淬灭多余的固体钠，而后加入氯化铵水溶液80〜85ml，调节溶液至酸性，并用乙酸乙酯50〜60ml萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，旋蒸，柱层析纯化，可得到纯品3，5-二氯苯硫酚。3.根据权利要求1所述的蛋白酶抑制剂的制备方法，其特征在于:所述8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤的制备方法为：18-溴腺嘌呤的制备：先将腺嘌呤40〜45g加入烧瓶中，在机械搅拌下加入液溴100〜107ml，加入过程要缓慢，然后常温下搅拌3小时；反应完毕后，加入亚硫酸氢钠溶液除去多余的液溴，再用氨水调节反应液成中性，析出白色粉末状固体。过滤，固体用冰水洗涤，得到8-溴腺嘌呤；⑵8-溴-9-溴丙基腺嘌呤的制备：在三口烧瓶中，先将8-溴腺嘌呤8〜IOg溶于二甲基甲酰胺60〜70ml中，搅拌至完全溶解后，再慢慢加入1，3-二溴丙烷15〜20g和碳酸铯16〜20g，升高温度至100度，在此温度下搅拌反应16小时；反应完成后冷却至室温，倒入纯水中，用二氯甲烷甲醇=101混合溶液萃取，有机相再用饱和氯化铵溶液洗涤，用无水硫酸镁干燥，旋蒸，所得粗品用柱层析提纯，得到纯品8-溴-9-溴丙基腺嘌呤；⑶8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤：在烧瓶中先放入80ml的二甲基甲酰胺，一边搅拌一边慢慢加入8-溴-9-溴丙基腺嘌呤5〜7g，异丙胺12.5〜15g和三乙胺15〜20ml，加完后，常温搅拌16小时；反应后，先用40度旋蒸，除去多余的异丙胺和三乙胺，其余反应液用乙酸乙酯稀释，然后用饱和食盐水和饱和氯化铵溶液多次萃取，再用饱和碳酸氢钠萃取，有机相用无水硫酸镁干燥，浓缩，用柱层析法提纯，得到纯品8-溴-9-3-异丙胺基正丙基腺嘌呤。

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