申请/专利权人：天津大学

申请日：2016-11-29

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN107043772B

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);C12N15/63(20060101);C12N1/21(20060101);C12P21/00(20060101);C12R1/46(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.15#授权;2017.09.08#实质审查的生效;2017.08.15#公开

摘要：本发明公开了一种乳酸乳球菌乳亚种YF11的非编码小RNAs013，乳酸乳球菌YF11的非编码小RNAs013，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示；实验结果表明：乳酸乳球菌乳亚种YF11的非编码小RNAs013过表达后，含有s013过表达的乳酸乳球菌在酸性环境下的生存能力明显增强，提高在酸性发酵液的存活率，增加nisin的稳定性，从而提高nisin产量。

主权项：1.乳酸乳球菌乳亚种YF11的非编码小RNAs013，其特征是其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示。

全文数据：乳酸乳球菌乳亚种YF11的非编码小RNAs013技术领域[0001]本发明涉及细菌非编码小RNAsmallnon-codingRNA，sRNA，特别是涉及一个乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013、含有乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013的载体、含该载体的重组乳酸乳球菌及应用。背景技术[0002]细菌非编码小RNAsmallnon-codingRNA，sRNA是近年来在细菌等原核生物中发现的一类RNA调控因子，他们不编码蛋白，通常位于基因间区，长度在50〜500个核苷酸之间，是在生物体整个生命过程中十分关键的基因调节因子。细菌sRNA是细菌代谢、毒力和适应环境压力的重要调节因子，在应对环境变化的基因表达调控中发挥重要作用。sRNA主要通在转录后过与mRNA相互作用发挥调控功能，。迄今为止，大部分细菌sRNA的研究集中在大肠杆菌等模式生物，但随着研究的深入，已有越来越多的研究转向致病菌，如霍乱弧菌、产单核细胞李斯特菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌、沙门氏菌、肺炎链球菌和金黄色葡萄球菌等，在这些病原体中，已经正式sRNA在转录后水平调控基因的表达，并在压力应答和毒力调控中发挥重要作用。挖掘乳酸乳球菌的sRNA，对sRNA在环境压力下的调控机制进行分析，可更好地提高菌株某方面的耐受力或增加产物产量。sRNA几乎不会增加菌株的代谢负担，而且不会影响正常的生长和生产过程，同时可以有效地调节菌株基因的表达，进而提高菌株的耐受性，在构建工程菌株方面具有重要的意义。[0003]Nisin乳链菌肽是由一些乳酸乳球菌在代谢过程中合成和分泌的具有较强抑菌作用的分子小肽，对于大多数革兰氏阳性菌具有抑菌效果，与化学合成防腐剂相比更是具有高效、安全、无毒、无副作用的优点。Nisin生产的困境在于乳酸乳球菌在发酵过程中，菌体生长的最适环境与nisin稳定的pH之间存在矛盾。乳酸乳球菌在pH中性环境下生长势头良好，但随着发酵时间的延长，自身代谢的乳酸使发酵液的PH持续降低，抑制菌体的生长，而且乳酸大量积累本身还会抑制nisin的合成;而nisin则在pH2.0条件下非常稳定，随着pH值的升高，稳定性越差，活性越低。故通过筛选出耐酸相关sRNA构建耐酸菌株使其在低pH下正常生长生产具有很好的工业价值和研究意义。发明内容[0004]本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013。[0005]本发明的第二个目的是提供一种含有乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013的载体。[0006]本发明的第三个目的是提供一种含有上述载体的重组乳酸乳球菌。[0007]本发明的第四个目的是提供一种含有上述载体的重组乳酸乳球菌在发酵生产乳链菌肽的应用。[0008]本发明的技术方案概述如下：[0009]乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAS013,该核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示;或与序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与耐酸相关的核苷酸序列。[0010]含有乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAS013的载体，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。[0011]含有上述载体的重组乳酸乳球菌。[0012]上述重组乳酸乳球菌在发酵生产乳链菌肽的应用。[0013]本发明优点：[0014]实验结果表明：乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013过表达后，含有s013过表达的乳酸乳球菌在酸性环境下的生存能力明显增强，提高在酸性发酵液的存活率，增加nisin的稳定性，从而提高nisin产量。附图说明[0015]图1为乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAS013过表达载体PLEB124-S013的物理图谱。[0016]图2为菌株在不同pH胰蛋白胨水溶液应激3h后存活率。[0017]图3为菌株生物量随时间变化图。[0018]图4为菌株的nisin效价随时间变化图。[0019]图2-图4中：[0020]含有空质粒PLEB124的乳酸乳球菌乳亚种YFll对照菌株命名为乳酸乳球菌乳亚种YFl1+，图示中记为对照菌；[0021]含有载有乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAS013的PLEB124载体的重组乳酸乳球菌本发明的菌株菌株命名为乳酸乳球菌乳亚种YFll—s013,图示中记为s013菌；具体实施方式[0022]下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。[0023]各实施例所用的乳酸乳球菌乳亚种Lactococcuslactissubsp.lactisYFll菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNO.12429,保藏时间为2015年5月10日。地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。[0024]本发明中所用的实验方法如未作特别说明均是采用了常规方法。[0025]所用质粒PLEB124购买于苏州金唯智生物科技有限公司。[0026]实施例1[0027]乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013简称s013序列的获得[0028]1、文库的构建及测序[0029]SmallRNA文库：提取样品总RNA后用切胶回收片段（18-150nt，按照IlluminaTruSeq™SmallRNASamplePreparationprotocol构建small文库，最后建好的文库用IlluminaHiSeq2000进行测序。[0030]链特异性文库:将提取样品总RNA去除rRNA后打断成短片段，以mRNA为模板先后合成两条cDNA链，适当修饰后将第二条cDNA链，PCR扩增后将建好的测序文库用IlIuminaHiSeq2000进行测序。[0031]2、数据预处理与生物信息学分析[0032]测序所得的原始数据需要去除杂质数据:含adaptor的reads、N的比例大于10%的reads、低质量reads，最后获得cleanreads。然后对cleanreads进行拼接处理，获得Full-lengthTags，将tags比对到基因组、基因、rRNA和tRNA上，得到比对统计信息。[0033]基因表达量的计算使用RPKM法ReadsPerKbperMillionreads，其计算公式为：[0035]其中，RPKM为某基因的表达量，C为唯一比对到该基因的reads数，N为唯一比对到参考基因的总reads数，L为该基因编码区的碱基数。[0036]3、样品的制备与总RNA的提取[0037]取出-80°C保藏的乳酸乳球菌乳亚种YF11菌株，接种到种子培养基中，30°C活化培养三代，然后以10%的接种量分别转接到pH7.0和pH5.0的发酵培养基中，继续应激培养Ih，4°C，8000rpm离心5min去上清收集菌体，无菌生理盐水洗涤菌体三次，用液氮迅速冷冻。在冰上使用细胞破碎仪对菌体进行机械破壁超声5s，暂停5s，持续IOmin后用trizol试剂重悬并混匀。使用ZRRNAMiniPrepTM提取菌体总RNA，RNA样品-80°C保存在加有RNA酶抑制剂的RNasefree水中。按照试剂盒说明书进行操作。检测提取的总RNA的浓度和纯度，使用合格的样品进行后续cDNA的合成。[0038]使用RevertAidFirstStrandcDNASynthesisKit试剂盒，按照cDNA的合成体系将各反应物加入PCR管中，3000rmin离心3〇8。〇0嫩合成程序：25°：温育51^11，42°：水浴60min进行合成cDNA反应，70°C加热5min终止反应。测定cDNA样品的浓度和纯度，-20°C保存备用。[0039]表I:cDNA的合成体系组成：[0041]乳酸乳球菌种子培养基配方:酵母粉15g，蛋白胨15g，KH2P〇420g，蔗糖15g，NaCl1.5g，[0042]1^〇4.7出00.158，加水至比，调节?!1至7.2，琼脂粉158固体培养基），121°：高温蒸气灭菌20min;[0043]乳酸乳球菌发酵培养基配方酵母粉15g，蛋白胨15g，KH2P〇42%，蔗糖2%，玉米浆3g，半胱氨酸2.6g，NaCl1.5g，MgS〇4·7H200.15g，加水至1L，调节pH至7.2，121°C高温蒸气灭菌20min。[0044]4、实时荧光定量PCR验证[0045]将所得的cDNA按试剂说明书（LightCycler@480SYBRGreenIMaster稀释至一定浓度用作qRT-PCR反应的模板，按照RT-PCR反应体系将模板加入离心管中，将样品转移至96孔板，设置3个平行，再加入其他反应物，以上操作步骤均在冰上进行，验证引物设计如表2所示。3000rmin简短离心后，进行RT-PCR反应。RT-PCR反应程序为:95°C预变性IOmin;95。:变性10s，50°C复性10s，72°C延伸lmin，共55个循环；72°C延伸5min;熔解曲线65°C起始Imin，95°C终止。[0046]RT-PCR反应体系：[0047]表2模板DNA1.0μLPrimerF10μI0.5uL：[0043]PrimerR10UMiD.5μL2XUltraSYBRMixwithROX1:1LDNaseRNase—freewaterUpto：25.0μL[0049]引物序列如下：[0051]说明：用SEQIDNO.3、SEQIDNO.4,结合表2其它组分，扩增得到16SRNA目标片段；用SEQIDNO.5、SEQIDNO.6,结合表2其它组分，扩增得到s013目标片段。[0052]5、小RNA的预测与确定[0053]对于sma11RNA文库，根据比对信息，过滤后得到那些比对到基因间区IGRIntergenicregion和AMAntisensetomRNA类型的All-unitags且总表达量大于20的All-unitags列为候选的sRNA将其列为候选sRNA，该sRNA为乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013,其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。[0054]对于链特异性文库，从中挑选出长度大于等于IOObp且平均覆盖深度大于等于2的genemodelTAR，再从中找出位于基因间区（一个基因3’端下游IOObp到下一个基因5’端上游IOObp之间）的作为新转录本，这些转录本与蛋白库NR比对不上的作为候选sRNA。对候选的小RNA，为了验证所预测的候选sRNA在发酵培养基中酸应激Ih后表达量的变化情况，采用检测目的sRNA相对于内参基因16SrRNA的相对定量方法，S卩2-ΔACp法。具体计算方法如下：[0055]ΔCp=Cp目的基因）-Cp内参基因）[0056]ΔΔCp=ΔCp实验组-ΔCp对照组）[0057]相对倍数实验组对照组）=24Aep，以pH=7.0条件下的为对照组，相对转录水平设为1，其他条件为实验组。重复3次实验，计算平均值。[0058]为了验证深度测序所得候选sRNA在酸胁迫下相对表达差异，通过qRT-PCR的方法检测sRNA基因经过酸应激处理后表达量的变化，使用法分析耐酸相关sRNA在pH5.0实验组和pH7.0对照组应激下的差异表达相对倍数。从荧光定量RCR结果中筛选出了在酸性胁迫下表达量明显上调的sRNA。[0059]荧光定量PCR验证sRNA上调情况见表3[0060]表3荧光定量PCR验证sRNA上调情况[0062]实施例2、s013的功能分析[0063]为了分析S〇13在乳酸乳球菌的生存和耐受性方面发挥的作用，构建了s013过表达菌株并进行了相关的检测实验。[0064]1、sO13过表达菌株的构建及验证[0065]以乳酸乳球菌乳亚种YFll的基因组为模版，根据s013的核苷酸序列设计引物sRNA-F与sRNA-R进行PCRl扩增。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳纯化后用DNA纯化回收试剂盒回收后与质粒PLEB124用BamHI和HindIII双酶切，然后用T4DNA连接酶连接。连接产物转化TGl大肠杆菌感受态细胞，转化产物涂布具有红霉素（150ugml抗性的LB平板。对平板上的菌落用引物General-sRNA-F、General_sRNA-R进行PCR2反应验证，扩增出205bp的片段认为是阳性克隆，将阳性菌落于LB液体培养基中过夜培养，提取质粒送测序。结果正确的质粒即为过表达载体（含有乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013的载体），将其命名为pLEBl24-sO13，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。将过表达载体pLEB124-sO13电转到乳酸乳球菌乳亚种YFl1感受态细胞中，涂布含有红霉素20ugml抗性的种子培养基平板，30°C培养36小时，用引物General-sRNA-F、General-sRNA-R进行PCR3筛选阳性克隆转化子即为乳酸乳球菌过表达株，即为本发明的含载有乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAs013的PLEB124载体的重组乳酸乳球菌菌株命名为乳酸乳球菌乳亚种YFl1—s013，简称YFl1—s013,图示中记为s013菌；[0066]1引物序列[0067]sRNA-F：CCCAAGCTTTTGTTTTTTGACAAGTTCTAAGAASEQIDNO.7[0068]sRNA-R：CGCGGATCCAAAAAAAGCACCCATAGAACTATSEQIDNO.8[0069]GeneraI-sRNA-F：ATTACTGAAGGGAACCTAGAATAGTSEQIDNO.9[0070]General-sRNA-R：CGACCTGAGGTAATTATAACCCSEQIDNO.10[0071]2PCRl反应体系：[0073]PCRl反应条件：95°C预变性2min;95°C变性20s，Tm-5°C复性20s，72°C延伸20s，共35个循环;72°C延伸5min。重叠延伸PCR反应程序:95°C预变性2min;95°C变性20s，Tm+5°C复性20s每个循环温度下降0.5°C，直至Tm-5°C，72°C延伸20s，进行20个循环；95°C预变性2min;95°C变性20s，Tm-5°C复性20s，72°C延伸20s，再进行15个循环；72°C延伸SmiruPCR〗、PCR3反应体系：[0075]PCR2PCR3反应条件：97°C预变性7min;94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸lmin，共30个循环;72°C延伸5min。[0076]2、不同的乳酸乳球菌在不同pH的胰蛋白胨水溶液中应激后生存能力分析。[0077]乳酸乳球菌由于发酵后期发酵液的pH值降低会严重影响菌体的生长。为研究小RNA分子在酸性应激下的生存能力，用胰蛋白胨水溶液作应激培养基，应激3小时后稀释涂布计算存活率。[0078]使用的菌株:YFll+菌和YFll—s013菌。[0079]具体方法包括以下步骤：[0080]将YFll+菌和YFll—S013菌分别接入种子培养基中，30°C静置培养。活化三代后，取6mL对数生长后期（约8h，8000rmin，4°C离心IOmin，弃上清收集菌体。用等体积生理盐水悬浮菌体，8000rmin，4°C离心IOmin，弃上清收集菌体，再重复一次该洗涤步骤。用3mL生理盐水悬浮菌体，各取500yL菌悬液接入8mL不同pH梯度的胰蛋白胨水培养基胰蛋白胨水培养基:胰蛋白胨2%，氯化钠他：10.5%，分别调节至?!17.0,5.0,4.0,3.0,2.0，121°：高温蒸气灭菌20min中，于30°C静置应激3h。将pH7.0、pH5.0、pH4.0条件下的菌体培养液用生理盐水稀释至1〇Λ将PH3.0和pH2.0条件下的菌体培养液用生理盐水稀释至ΚΓ6。每个样品取IOOyL稀释液涂布于pH7.2的种子培养基平板上，30°C倒置培养。统计各个平板上菌落数，三个平行样本取平均值;其pH5.0、pH4.0、pH3.0和pH2.0条件下的菌落数分别除以pH7.0条件下的菌落数计算系列pH梯度胰蛋白胨水培养基胁迫3h后的存活率;之后将实验组和对照组菌株在相同pH条件下的存活率作比值以此衡量s013菌耐酸性变化情况。[0081]检测结果如图2所示，在pH5.0胁迫条件下，过表达s013菌株的存活率较比对照菌株有显著的提高了1.86倍，说明pH5.0酸性条件过表达S013菌株的生长以显示出耐酸优势；而当pH达到4.0时，sRNA过表达菌株s013的存活率已经明显高于对照菌株，存活率提高了2.16倍，过表达s013菌株的耐酸性得到明显体现;在pH3.0酸胁迫下，sRNA过表达菌株s013的存活率较比对照菌株提高了1.93倍，酸性环境对菌株的抑制作用加剧，但是过表达s〇13菌株依然呈现出良好的酸耐受性;在较为极端的pH2酸胁迫条件下，过表达s013使乳酸菌在应对极端酸性环境方面起到了较为显著的调节作用，存活率仍旧提高了1.21倍。[0082]3、s013过表达菌株生长状况的测定[0083]为检测小RNAs013对菌体生存能力的影响，进行了发酵实验：取出-20°C保存的YFll+菌和YFll—s013菌活化3代后按5%的接种量接入到发酵培养基乳酸乳球菌发酵培养基gL:酵母膏15,蛋白胨15,磷酸二氢钾20,蔗糖20,玉米浆3,半胱氨酸2.6,无碘精盐1.5，MgS04·7H200.15，pH7.2中，30°C恒温静置培养，每隔2h取发酵液样品，8000rmin离心5min分离菌体。用等体积的生理盐水重新悬浮菌体，然后对菌悬液进行稀释测定OD600值，以生理盐水为对照，保证OD6qq测量值在0.3-0.7之间线性范围内，绘制发酵液生物量随时间变化曲线如图3。可以看出，过表达菌株s013菌体量同期对比较空质粒对照组高，生长情况比空质粒对照组的好。推测该小RNA分子与菌体的生存能力相关。[0084]4.nisin效价测定试验[0085]取出-20°C保存的YFll+菌和YFll—s013菌活化3代后按5%的接种量接入到发酵培养基中，30°C恒温静置培养，每隔2h取分别取500yL这四种菌的发酵液样品与500yL无菌HCl溶液0.02molL混匀，然后煮沸5min，8000rmin再离心5min。取上清液用无菌HCl溶液0.02molL稀释分别制成这两株菌在不同时间点的样品。[0086]将4°C保存的藤黄八叠球菌MicrococcusflavusATCC10240,购买于2012年6月17日，购于上海研生实业有限公司）斜面取出，用2mL无菌生理盐水洗下菌苔，将得到的菌悬液收集到无菌离心管中，取IOOyL菌悬液混勾于6mL无菌生理盐水。nisin效价培养基26mL加热融化后冷却至70°C左右，加入1.5%的吐温-20390yL，再冷却至50°C左右，加入上述菌悬液迅速摇匀，倒入9mm无菌培养皿内。待其凝固后用灭菌直径7mm的打孔器在平板上均勾打出8个孔其中6个孔加入样品，2个孔加入nisin标准液）。称取8mgnisin标准品溶于8mL无菌HCl溶液0.02molL制成10000IUmL的标准溶液，然后以此稀释制成2000IUmL、100011]!1^、20011]11^、10011]11^、5011]11^和2511]11^系列11丨8丨11标准溶液。每个样品设置三个平行，每个孔内加入IOOyL的样品或标准溶液，加样时尽量让两株菌在同一时间点取得的样品分布在同一平板上，37°C恒温培养24h。用游标卡尺测量抑菌圈直径，并以直径平均值为横坐标，nisin效价的对数值为纵坐标，绘制标准曲线。然后将样品的抑菌圈直径值代入标准方程计算得到样品的nisin效价。[0087]由图4可以看到对照菌株的nisin效价在第8h时较s013菌株高，随后第IOh时s013菌nisin效价有明显提高，而对照菌株的nisin效价开始下降，可能是由于菌株过表达需要能量，因此菌株生长过程相对缓慢，使nisin的生产过程减缓，比对照菌株达到nisin峰值所需时间要长。s013菌株的nisin效价峰值为3175.02IUmL，显著高于对照菌株的2848.50IUmL，提高了11.46%。在发酵进行到12h时，菌株nisin效价都有较为显著的下降，但s013菌菌株仍高于对照菌株较比对照菌株的nisin效价高。

权利要求：1.乳酸乳球菌乳亚种YFll的非编码小RNAS013,其特征是其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.1所示;或与序列表SEQIDNO.1所示的核苷酸序列具有90%以上同源性并与耐酸相关的核苷酸序列。2.含有权利要求1所述非编码小RNAs013的载体，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNO.2所示。3.含有权利要求2所述载体的重组乳酸乳球菌。4.权利要求3的重组乳酸乳球菌在发酵生产乳链菌肽的应用。

百度查询： 天津大学 乳酸乳球菌乳亚种YF11的非编码小RNA s013

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