申请/专利权人：株式会社日皮

申请日：2012-11-02

公开（公告）日：2020-09-15

公开（公告）号：CN106831980B

主分类号：C07K14/78(20060101)

分类号：C07K14/78(20060101);C12N9/48(20060101)

优先权：["20111104 JP 2011-242050"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.15#授权;2017.07.07#实质审查的生效;2017.06.13#公开

摘要：本发明提供一种DPP‑4抑制剂，该DPP‑4抑制剂以式1：Xe‑ProAlaHyp‑Xa‑Xb‑Xc‑Xd式中，Xe表示等电点为5.9～6.3的氨基酸残基，ProAlaHyp表示Pro、Ala或Hyp，Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly、Pro或缺失，Xc表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。所示的肽作为有效成分。该抑制剂通过增强肠促胰岛素的作用，可以期待降低血糖值的作用，可以用作糖尿病治疗药，此外，通过对免疫系统等发挥作用，可用于皮肤疾病的治疗等。

主权项：1.一种DPP-4抑制剂，包含来自胶原蛋白的肽，其中，所述肽为Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp。

全文数据：DPP-4抑制剂[0001]本申请为2012年11月2日提交的申请号为201280054376.X且发明名称为“DPP-4抑制剂”的专利申请的分案申请。技术领域[0002]本发明涉及包含2〜6个氨基酸的特定序列的肽的二肽基肽酶4抑制剂（以下，只称作DPP-4抑制剂）。背景技术[0003]糖尿病是引起高血糖、糖尿、体蛋白的解体、酮病、酸中毒等全身性代谢障碍的慢性疾病。通常，糖尿病大致分为以下两种类型:胰腺的辟田胞因为某种原因被破坏，调节血糖值的胰岛素枯竭的1型；以及血中虽然存在胰岛素，但胰岛素的作用差，或者来自胰腺的辟田胞的胰岛素分泌量减少，其结果，血糖值的调节功能不全的2型。[0004]近年来，作为调节血糖值的激素，身为消化道激素之一的肠促胰岛素受到关注。肠促胰岛素是随着食物的摄取由消化道分泌、并与胰辟田胞发生作用以促进胰岛素分泌的激素的总称，已知有葡萄糖依赖性胰岛素分泌刺激多肽（GIP:glucose-dependentinsulinotropicpolypeptide和膜高血糖素样肽-IGLP-1:glucagon_likepeptide-1这两种。分泌的肠促胰岛素与胰腺细胞表面的受体结合，通过胰岛素分泌促进和胰高血糖素的分泌抑制，显示出降低血糖值的作用。肠促胰岛素的胰岛素分泌促进作用依赖于血中葡萄糖浓度，只有在一定浓度以上的葡萄糖存在下才得以体现。即，通过现有的治疗方法即胰岛素直接给药，出现所担心的低血糖的危险性小，可以期待着安全地纠正饭后高血糖。实际上，已知通过静脉对2型糖尿病患者持续给予作为肠促胰岛素之一的GLP-I，可促进胰岛素分泌，血糖控制得到明显改善，显示出GLP-I补充疗法的有效性。[0005]另一方面，GLP-I被生物体内广泛存在的二肽基肽酶4EC3.4.14.5，以下只称作DPP-4。）快速分解。因此，作为糖尿病治疗方法，新开发了抑制DPP-4的活性以持续增强内源性GLP-I的作用的药物。需要说明的是，DPP-4虽然在T细胞等免疫系细胞表面作为CD26在细胞膜上表达，但作为可溶性蛋白还存在于血液中，是将GLP-I灭活的丝氨酸蛋白酶。其对从N末端起第2位具有Pro或Ala的生理活性肽具有特异性作用，使二肽从N末端游离出来。[0006]基于这样的DPP-4的作用，有包含从N末端起第2位配列有Pro的3〜12个氨基酸的肽的DPP-4抑制剂专利文献1。该DPP-4抑制剂是将奶酪悬浮于水性溶剂中，之后除去不溶性物质后得到的水溶性组分中所含的肽，经口摄取混合有该肽的饮品时，在生物体内能够降低血糖值。专利文献1中记载的DPP-4抑制剂是由天然物质得到的，所以毒性低、安全性尚。[0007]另外，还有由乳蛋白水解物构成、且刺激GLP-I的分泌、以及具有DPP-4抑制作用的肽专利文献2。专利文献2中公开的肽优选2〜8个氨基酸的长度、且包含Pro作为第二N末端残基的肽。在实施例中，作为某乳蛋白水解物，评价了500〜2000Da的肽组合物的DPP-4抑制效果，但它们的组成或肽序列尚不明确。[0008]而且，还有含有来自饮食用原材料的调制物作为有效成分的DPP-4抑制剂专利文献3。该DPP-4抑制剂含有固体浓度为3.5mgml以下、DPP-4抑制率为60%以上的来自饮食用原材料的调制物作为有效成分。在专利文献3的实施例中，评价了以绿豆、大豆、胶原蛋白、海藻、茶、核桃、甜茶、石榴、葡萄籽等为来源的肽的DPP-4抑制率。[0009]进一步，还以来自胶原蛋白或明胶的、用Gly-X-Y-Gly-Z-Wη式中，η表示0〜4的整数，X表示Pro或Leu，Y、Z和W各自独立表示相同或不同的任意的氨基酸残基其中，Gly除夕卜）。）表示的肽作为DPP-4抑制剂专利文献4。在实施例中，通过高效液相色谱法分级市售的胶原蛋白肽，鉴定了DPP-4抑制活性优异的组分的肽序列。[0010]另一方面，作为DPP-4抑制剂的作用，已知其抑制T淋巴球的增殖非专利文献1。非专利文献1指出：通过DPP-4抑制剂能够缓和自身免疫性脊椎炎、多发性硬化症、关节炎、风湿病等自身免疫疾病。另外，由于DPP-4与HIV-I对⑶4阳性T细胞的感染促进有关，所以还有报道称：通过DPP-4抑制剂和其他药物的联用，可以期待防御HIV-I的感染（非专利文献2。而且，还有报道称：由于皮肤细胞表达DPP-4，所以DPP-4抑制剂对皮脂腺细胞或表皮细胞的增殖或分化或细胞因子的产生有影响非专利文献3。使用DPP-4抑制剂抑制被痤疮丙酸杆菌刺激的T淋巴细胞的增殖，引起成纤维细胞的TGFP的表达抑制、增殖抑制、基质产生抑制，其结果暗示:使用DPP-4抑制剂，能够治疗青春痘、干癣、瘢痕疙瘩。[0011]现有技术文献[0012]专利文献[0013]专利文献1:日本特开2007-39424号公报[0014]专利文献2:日本特表2009-517464号公报[0015]专利文献3:日本特开2010-13423号公报[0016]专利文献4:国际公开第2008066070号[0017]非专利文献[0018]非专利文献I:RoleofdipeptidylpeptidaseIVDPIV-likeenzymesinTlymphocyteactivation:investigationsinDPIVCD26_knockoutmic，ClinChemLabMed.2009；473:268-74.[0019]非专利文南犬2:InhibitionofhumanimmunodeficiencyvirustypeIinfectioninaT-celllineCEMbynewdipeptidyl-peptidaseIVCD26inhibitors.ResVirol.1997Jul_Aug;148⑷：255-66.[0020]非专利文献3:TheectopeptidasesdipeptidylpeptidaseIVDPIVandaminopeptidaseNAPNandtheirrelatedenzymesaspossibletargetsinthetreatmentofskindiseases.FrontBiosci.2008JanI；13:2364-75.发明内容[0021]发明所要解决的课题[0022]上述专利文献1〜4中记载的DPP-4抑制剂均以奶酪或乳蛋白、其他饮食用原材料等天然物质为原料，所以安全性优异，但人们希望开发抑制效果更强的DPP-4抑制剂。[0023]即，专利文献1或专利文献2只限定于特定的肽序列，其他序列中的DPP-4抑制效果尚不明确。另外，专利文献1中记载的这些肽最初只限定于来自奶酪的水溶性组分的肽，所以关于其他序列的DPP-4抑制效果也尚不明确。另外，专利文献2选择2〜8个氨基酸的长度、且包含Pro作为第一、第二、第三或第四N末端残基、或者从C末端残基或最后起第二位的C末端残基中包含Pro的肽作为优选的肽。上述文献着眼于DPP-4对从N末端起第2位具有Pro或Ala的生理活性肽特异性地发挥作用的方面。但是，对于实施例中评价了DPP-4抑制效果的水解物，虽然评价了分子量分布与DPP-4抑制以及GLP-I分泌的关系，但使用的水解物的组成尚不明确。[0024]专利文献3也评价了猪或鱼的胶原蛋白肽的DPP-4抑制率，但并不存在具体的关于肽序列的记载。而且，肠促胰岛素作为DPP-4的底物被迅速分解，所以血中半衰期非常短。因此，通过DPP-4抑制剂来确保血中的肠促胰岛素浓度时，要求其在血液中迅速发挥DPP-4抑制作用，要求DPP-4抑制剂的生物体吸收性优异。[0025]另一方面，专利文献4的实施例中使用的肽是使用反相柱分离收集市售的胶原蛋白肽，并特定是DPP-4抑制活性优异的肽，并没有系统性地评价肽序列和DPP-4抑制活性。另夕卜，最初原料的胶原蛋白是进行胶原酶处理形成的市售的明胶。在利用胶原酶进行的分解中，由于N末端为Gly的肽是主要成分，所以制备N末端为Gly以外的肽或C末端为Gly的肽，无法评价DPP-4抑制活性。[0026]另一方面，如非专利文献1〜非专利文献3所示，DPP-4抑制剂对免疫系统发挥作用，还可用于皮肤疾病的治疗等医疗用途，因此其用途有可能扩大。[0027]在这样的状况下，希望开发来自安全性高的肽的DPP-4抑制剂。[0028]解决课题的方法[0029]本发明人为了解决上述课题，参照胶原蛋白的氨基酸一级结构合成了各种肽，评价DPP-4抑制剂。结果发现：即使从N末端起第2位的氨基酸残基是Hyp，也能够发挥DPP-4抑制活性；即使从N末端起第2位是Pro或Ala，也存在不具有DPP-4抑制活性的肽；以及从N末端起第3位的氨基酸残基是Gly时，DPP-4抑制活性优异等，完成了本发明。而且，本发明中使用的肽是包含2〜6个氨基酸的特定序列的肽，所以血中的转移性优异，可以迅速发挥DPP-4抑制作用，并且由于是来自胶原蛋白的氨基酸序列，所以安全性优异。[0030]S卩，本发明提供DPP-4抑制剂，该DPP-4抑制剂以式（I:Xe-ProAlaHyp-Xa-Xb-Xc-Xd式中，Xe表示等电点为5.9〜6.3的氨基酸残基，ProAlaHyp表示Pro、Ala或Hyp，Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly、Pro或缺失，Xe表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）所示的肽作为有效成分。[0031]另外，本发明还提供上述DPP-4抑制剂，其中，所述肽为下述式A或式⑶中的任意一种：[0032]式（厶）：617-?1'〇厶1-?-?13-?3-?1式中，？1'〇厶1表不？1'〇或厶1，父表不办卩、？1'〇和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xc表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）[0033]式⑶：LeuIleAla-HypPro-Xa-Xb-Xc式中，LeuIleAla表不Leu、Ile或Ala，HypPro表示Hyp或Pro，Xa表示Hyp、Pro、IIe和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xc表示Ala或缺失。）[0034]另外，本发明还提供上述DPP-4抑制剂，其中，所述肽为下述式A-I、式A-2、式B-I或式B-2中的任意一种：[0035]式六-1:617-?1'〇-?^-?13-?3-?1式中，乂3表示办口以及\%1以外的等电点为3.0〜6.2的氨基酸残基，Xb表示Gly，Xe表示Pro或缺失，Xd表示Ala以外的氨基酸残基或缺失。）、[0036]式A-2=Gly-Ala-Xa-Xb-Xc-Xd试中，Xa表示等电点为5.8〜6.2的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）、[0037]式B-I:Leu-Pro-Xa-Xb-Xc式中，Xa表示Gly，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。）、[0038]式（B_2:LeuIle-Hyp-Xa-Xb_Xc式中，LeuIle表不Leu或Ile，Xa表不Gly，Xb表示Pro或缺失，Xc表示Ala或缺失。）。[0039]除此之外，本发明还提供上述DPP-4抑制齐丨」，其中，所述肽为选自Leu-Pro-Gly、Leu-Pro-Gly-Pro-Ala、Ile-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly-Pro-Ala、Gly-Pr〇-Ala_Gly、Gly-Pr〇-Ala-Gly-ProNGly-Pro-Ala-Gly-Pro-ArgNGly-Pro-Ala-Gly-Pro-HypNGly-Pro-Ala-Gly-Pro-IIe、Gly-Pr〇-Leu_Gly-Pr〇-Val、Gly-Pro_Ile-Gly-Pro-Val、Gly_Ala_IIe-Gly-Pro-Ala、Gly-Ala-IIe-Gly-Pr〇-Ser、Gly-Ala-Val-Gly-P;r〇-Ala、Gly-Ala-Val-Gly-P;ro、和Gly-Ala的任意一种以上。[0040]而且，本发明还提供上述DPP-4抑制剂，其中，所述肽为式A-1、式A-2所示的任意一种以上和式B-1、式B-2所示的任意一种以上的混合物：[0041]式A-I:Gly-Pro-Xa-Xb-Xc-Xd，式中，Xa表示Hyp以及Val以外的等电点为3·0〜6·2的氨基酸残基，Xb表示Gly，Xc表示Pro或缺失，Xd表示Ala以外的氨基酸残基或缺失、[0042]式A-2:Gly-Ala-Xa-Xb-Xc-XcU式中，Xa表示等电点为5.8〜6.2的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xc表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失、[0043]式B-1:Leu-Pro-Xa-Xb-Xc，式中，Xa表不Gly，Xb表不Pro或缺失，Xc表不Ala或缺失、[0044]式B—2:LeuIle-Hyp-Xa—Xb—Xc，式中，LeuIIe表不Leu或IIe，Xa表不Gly，Xb表不Pro或缺失，Xc表示Ala或缺失。[0045]发明效果[0046]根据本发明，提供安全性优异、并且DPP-4抑制活性也优异的新的DPP-4抑制剂。附图说明[0047]图1是显示实施例6中合成的肽Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Val的DPP-4抑制曲线的图。[0048]图2是显示实施例17中合成的肽Leu-Pr0-Gly的DPP-4抑制曲线的图。[0049]图3是显示氨基酸的等电点的一览表。具体实施方式[0050]第一本发明涉及DPP-4抑制剂，该DPP-4抑制剂以式（I:Xe-ProAlaHyp-Xa-Xb-Xc-Xd式中，Xe表示等电点为5.9〜6.3的氨基酸残基，ProAlaHyp表示Pro、Ala或Hyp，Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly、Pro或缺失，Xe表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）所示的肽作为有效成分。[0051]人的DPP-4是由766个氨基酸构成的IlOkDa的膜蛋白，是在氨基侧末端配置有Mi旋结构域、在羧基侧末端配置有αβ水解酶结构域、且所述αβ水解酶结构域中存在3个催化残基Ser630、HiS740、ASp708的酶。在血中，胞外区和膜结合区被切断，以可溶型的形式存在。鉴于使二肽从自N末端起第2位具有Pro或Ala的肽中游离出来的特异性，例如如上述专利文献1所示，从氨基末端起第2位配有Ala或Pro的各种肽作为DPP-4抑制剂被提案，测定其IC5〇。另外，已知抑二肽素AIle-Pro-Ile虽然是DPP-4的底物，但值均低，所以像抑制剂那样发挥作用，在专利文献1的实施例中，也同时记载着各种肽和抑二肽素A的IC5q的测定值。[0052]在这样的状况下，为了开发安全性优异、并且DPP-4抑制效果也优异的肽，作为含有大量的Pro的肽，参照胶原蛋白的氨基酸序列合成了各种肽。[0053]需要说明的是，胶原蛋白是以3条多肽链的三重螺旋结构作为基本单元，是构成生物体的真皮、韧带、肌腱、骨、软骨等的蛋白。多个胶原蛋白分子缔合形成胶原蛋白纤维。构成胶原蛋白分子的氨基酸用-Gly-氨基酸X-氨基酸Y-表示，每3个Gly残基重复，具有所谓的被称作“胶原蛋白样序列”的一级结构。作为胶原蛋白所特有的氨基酸，有在Pro或Lys上加成有1个羟基的羟基脯氨酸Hyp或羟基赖氨酸Hyl等，在所述胶原蛋白样序列中，存在具有Pro作为所述氨基酸X的序列、或作为氨基酸Y存在许多Hyp，通过该胶原蛋白样序列维持着三重螺旋结构。在加工强韧的胶原蛋白时，利用酸或碱、酶进行水解，加工成明胶等。作为这样的酶，有胶原酶并经常使用，胶原酶主要是产生N末端为Gly的肽的肽链内切酶，因此，现有的胶原蛋白分解物中，N末端为Gly的肽是主要成分。因此，本发明并不限于这样的酶分解，为了研制DPP-4抑制活性优异的肽，参照胶原蛋白的氨基酸序列选出一部分序列、或者改变所选出的一部分序列以合成各种肽，评价对DPP-4的抑制率。[0054]本发明中评价的肽是参照胶原蛋白的氨基酸序列的肽，所以在生物体内按照摄取胶原蛋白时的常规工序进行代谢，安全性高。作为参考，将来自牛的I型胶原蛋白αΐ链的序列记载在SEQIDNO:14中。该序列作为NCBI的检索号NP001029211来注册。需要说明的是，胶原蛋白中所含的Hyp是在胶原蛋白生成后用脯氨酸羟化酶修饰Pro而得到的产物。SEQIDNO:14是翻译后修饰前的氨基酸序列，不包括Hyp。以下，对本发明进行详细说明。[0055]本发明的DPP-4抑制剂以式（I:Xe-ProAlaHyp-Xa-Xb-Xc-Xd式中，Xe表示等电点为5.9〜6.3的氨基酸残基，？1'〇^]^办口表示?1'〇、4]^或办口，乂3表示办口、？1'〇和4找以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly、Pro或缺失，Xc表示Pro、Ala或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）所示的肽作为有效成分。研究氨基酸序列和DPP-4抑制活性时明确了：当从N末端起第3位的氨基酸残基为Hyp或Pro时，不管其他氨基酸残基如何，DPP-4抑制活性均低或者不具有DPP-4抑制活性。另外，从N末端起第2位的氨基酸残基为Pro、Ala或Hyp时，DPP-4抑制活性优异，当满足上述条件时，N末端的氨基酸残基可以在等电点为5.9〜6.3的范围内广泛选择。作为Xe，优选Gly、Ala、lie、Leu、Pro,更优选为Gly、Ala、IIe或Leu。[0056]作为上述式⑴所示的肽，可以是式A:Gly-ProAla-Xa-Xb-Xc_Xd式中，ProAla表示Pro或Ala，Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）。[0057]N末端为Gly时，Xa优选为Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸残基。DPP-4具有使二肽从自N末端起第2位具有Pro或Ala的肽中游离出来的特异性，所以推测：从N末端第2位的氨基酸残基为Pro或Ala的肽具有DPP-4抑制活性。但是明确了：即使第2位的氨基酸残基为Pro或Ala，但若从N末端起第3位的氨基酸残基为Hyp或Pro,则DPP-4抑制活性极低、或者完全不存在。[0058]而且，从N末端起第2位的氨基酸残基为Pro时，作为Xa，优选Ala、Gln、Glu、Ile、Leu、Val等的等电点为pH3.0〜6.2的办？以外的氨基酸残基。特别优选为六1、6111、6111、116、Leu、Val〇[0059]另一方面，从N末端起第2位的氨基酸残基为Ala时，作为Xa，有VaULeu或Ile等的等电点为PH5.8〜6.2的氨基酸残基或缺失。如后述的实施例所示，这与从N末端起第4位以后的氨基酸序列无关，是DPP-4抑制活性优异的缘故。需要说明的是，在本发明中，氨基酸的等电点依据图3所示的数值。[0060]在上述式㈧中，Xb表示Gly或缺失，当Xb缺失时，形成三肽。[0061]Xc表示Pro或缺失，Xc缺失时，形成四肽。另外，Xd可以是任一种氨基酸残基，或者可以缺失。本发明中使用的上述通式A所示的肽从N末端起具有Gly-ProAla-的序列，如后述的实施例所示，在2〜6个氨基酸的范围内，随着肽链的变长，DPP-4抑制活性有上升的趋势，但若超过5个氨基酸残基，则活性上升率不变。这意味着:DPP-4抑制活性由N末端起第4位的序列决定，与从N末端起第6位氨基酸残基的种类无关。结合作为Xd的各种氨基酸残基来评价DPP-4抑制活性时，在结合亲水性且等电点超过pHIO的Arg、作为亚氨基酸的一种的Hyp、疎水性且等电点在弱酸性侧的11e、VaI、Ser、Ala等范围宽的氨基酸残基的肽中，发挥DPP-4抑制活性。[0062]作为本发明中使用的式A所示的肽，可以是式A-I=Gly-Pro-Xa-Xb-Xc-Xd式中，Xa表示Hyp以外的等电点为3.0〜6.2的氨基酸残基，Xb表示Gly或缺失，Xc表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）。[0063]作为上述式A-I所示的Xa，优选Ala、Gln、Glu、lie、Val或Leu，作为Xd，优选Ala、Hyp、Leu、Val、Arg或缺失。[0064]另外，作为本发明中使用的式A所示的肽，可以是式A-2:Gly-Ala-Xa-Xb-Xc-Xd式中，Xa表示等电点为5.8〜6.2的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xe表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）。[0065]作为上述式A-2所示的Xa，优选Leu、Ile、Val或缺失，作为Xd，优选Ala、Ser或缺失。[0066]本发明的DPP-4抑制剂中，作为上述式A所示的肽，有617-?仰41-617、617-Pro-Ala-Gly-Pro、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Hyp、Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-IIe、Gly-Pr〇-Leu-Gly-Pr〇-Val、Gly-Pro_Ile-Gly-Pro-Val、Gly-Pro_Val、Gly-Pro-GlnNGly-Pro-GluNGly-AlaNGly-Ala-IIe-Gly-Pro-AlaNGly-Ala-IIe-Gly-Pro-SerNGly-Ala-Val-Gly-Pr〇-Ala、Gly-Ala-Val_Gly-Pro〇[0067]另外，本发明的DPP-4抑制剂可以是式B:LeuIleAla-HypPr〇-Xa-Xb-Xc式中，LeuIIeAla表不Leu、11e或Ala，HypPro表不Hyp或Pro，Xa表不Hyp、Pro、11e和Arg以夕卜的氨基酸残基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xc表示Ala或缺失。）所示的肽。[0068]胶原蛋白中包含-Gly-氨基酸X-氨基酸Y-所示的胶原蛋白样序列，但在N末端不限于Gly的情况下评价DPP-4抑制活性时，明确了当从N末端起第3位的氨基酸残基为Gly时DPP-4抑制活性优异。此时，N末端的氨基酸残基为Leu、IIe或Ala，随着肽链变长，DPP-4抑制活性有增加的趋势。从N末端起第2位的氨基酸可以是Pro也可以是HypJPP-4具有使二肽从自N末端起第2位具有Pro或Ala的肽中游离出来的特异性，但在N末端为Phe、Pro或Ala时，即使从N末端起第2位的氨基酸为Pro或Hyp，DPP-4抑制活性也低或完全不存在。这意味着：DPP-4抑制活性还受到N末端的氨基酸残基种类的影响。但是，即使在这种情况下，若结合Gly作为从N末端起第3位的氨基酸残基，则DPP-4抑制活性提高。Xa缺失时形成二肽，Xb缺失时形成三肽。需要说明的是，若参照胶原蛋白的氨基酸序列，则在式⑶中无法假设Xa的氨基酸残基为Ile，Xa为Hyp、Pr〇、Ile和Arg以外的氨基酸残基或缺失。[0069]作为本发明中使用的式⑶所示的肽，可以优选使用式B-1:Leu-Pro-Xa-Xb-Xc式中，Xa表示Gly或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xc表示Ala或缺失。）。[0070]另外，作为本发明中使用的式⑶所示的肽，可以是式B-2:LeuIIe-Hyp-Xa-Xb-Xc式中，Leu1Ie表示Leu或lie，Xa表示Gly或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。）。[0071]而且，作为本发明中使用的式⑶所示的肽，可以是式B-3:Ala-HypPr〇-Gly式中，HypPro表示Hyp或Pro。）。[0072]本发明的DPP-4抑制剂中，作为上述式⑶所示的肽，有Leu-Pro、Leu-Pro_Gly、Leu-Pro-Gly-Pro-Ala、Ala-Pro-Gly、IIe-Hyp-Gly和Leu-Hyp-Gly-Pro-Ala〇[0073]本发明的DPP-4抑制剂中使用的上述肽可以是构成医学上可接受的盐的肽。需要说明的是，医学上可接受的盐是指，药理学上可接受且对给药的受试者基本无毒的作为本发明化合物的盐的形式。作为上述肽的药学上可接受的盐，有钠盐、钙盐、镁盐、钙盐等无机盐；乙酸盐、丙酸盐、羟基乙酸盐、乳酸盐、羟基丁酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、琥珀酸盐、己二酸酸、酒石酸、枸橼酸盐、戊二酸盐等有机酸盐;盐酸盐、磷酸盐、盐酸盐、硫酸盐、羧酸盐、膦酸盐、磺酸盐等加成盐。[0074]如上所述，本发明的DPP-4抑制剂是参照胶原蛋白的氨基酸一级序列来选择DPP-4抑制效果优异的抑制剂、或者改变一部分序列而得到的抑制剂，可以通过肽合成来制备。但是，也可以是通过其他方法制备的抑制剂。[0075]本发明的DPP-4抑制剂，通过口服给药，可以在生物体内通过抑制DPP-4来降低血糖值，可以用作糖尿病的预防药、治疗药。口服给药时，作为本发明的DPP-4抑制剂的剂型，除了直接使用肽以外，还可以混合其他的赋形剂以制成片剂、细粒剂、丸剂、锭剂等，也可以装在胶囊中制成胶囊剂，更可以制成液体制剂等。口服给药时，考虑到治疗或预防的目的、症状、体重、年龄等条件，可以适当选择。另外，还可以作为补充物来摄取。[0076]关于本发明的DPP-4抑制剂的给药量，可以根据给药形式、给药目的、受试者的年龄等适当选择。通常，口服给药时，成人每天0.001〜l〇〇mgkg，优选0.01〜50mgkg，更优选为0·1〜20mgkg。当为注射剂时，成人每天例如0·0001〜50mgkg，优选0·001〜20mgkg，特别优选为0.01〜l〇mgkg。[0077]作为这样的肽，可以优选使用式㈧：Gly-ProAla-Xa-Xb-Xc-Xd式中，ProAla表示Pro或Ala，Xa表示Hyp、Pro和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Gly或缺失，Xc表示Pro或缺失，Xd表示氨基酸残基或缺失。）所示的任意一种以上和式⑶：LeuIleAla-HypPr〇-Xa-Xb-Xc式中，LeuIIeAla表不Leu、IIe或Ala，HypPro表不Hyp或Pro，Xa表不Hyp、Pro、Ile和Arg以外的氨基酸残基或缺失，Xb表示Pro或缺失，Xe表示Ala或缺失。）所示的任意一种以上的混合物作为DPP-4抑制剂。这是由于:虽然均来自胶原蛋白的氨基酸序列，但式A的N末端为Gly，而式B的N末端为Gly以外的氨基酸残基，所以摄取后的代谢速度等不同，可以期待并用效果的缘故。[0078]本发明的DPP-4抑制剂，可以将其混合在食品中经口摄取。作为这样的混合有本发明的DPP-4抑制剂的食品，有包含野菜或果实、乳酸菌等的果汁等饮料、果冻、酸奶、布丁、冰激凌等半流动性食品等，此外还可以混合在其他食材中制成固体食品。[0079]另外，还指出DPP-4抑制剂具有T淋巴细胞的增殖效果，其缓和自身免疫性脊椎炎、多发性硬化症、关节炎、风湿病等自身免疫疾病。因此，本发明的DPP-4抑制剂也有可能能够用于上述疾病。此时的用途并不限于内服，还可以是注射到炎症部位等的外科处方。[0080]实施例[0081]接下来，例举实施例以具体说明本发明，但这些实施例对本发明没有任何限制。[0082]DPP-4抑制活性的测定方法[0083]lDPP-4抑制率的测定方法[0084]将Img试样溶解在Iml50mM的Tris-盐酸缓冲液pH7.5中，将所得的35μ1样品液和15μ1溶解在50mM的TriS-盐酸缓冲液ρΗ7.5中的DPP-4^夕''7公司制、来自猪肾脏；8.6mUml在微板孔NUNC公司制、商品名“237015”）中混合，在37°C下培养10分钟。[0085]向其中添加50μ1预先保温在37°C的底物溶液将甘氨酰Pro-4-甲基香豆素-7-酰胺Gly-Pro-MCA溶解在50mM的Tris-盐酸缓冲液pH7.5中使浓度达到ΙΟμΜ的溶液并进行混合，在37°C下反应20分钟。[0086]使用酶标仪型荧光检测器口于电器公司制、商品名“SH-9000”），随时间测定通过DPP-4而游离的7-氨基-4-甲基香豆素（AMC的荧光强度。需要说明的是，在激发波长38〇111]1、测定波长46〇111]1下进行测定。需要说明的是，使用等量的5〇11^的1'1^8-盐酸缓冲液pH7.5代替样品来作为对照，测定其荧光强度。[0087]DPP-4的活性用反应时间中的荧光强度变化量的平均梯度表示，关于DPP-4抑制率，以对照为100%，从所述对照中减去样品的活性而得到的值作为抑制率（％而算出。[0088]2IC50值的测定方法[0089]根据上述的DPP-4抑制率的测定方法，使样品浓度在0.001〜7.2μπι〇Iml之间变化，得到抑制率，算出DPP-4活性的50%抑制浓度（IC5q值）。[0090]实施例1[0091]利用使用了YK，彳才システΛX'公司制的肽自动合成装置（433A的Fmoc固相合成法，合成表1所示的Gly-Pro-Ala-Gly-Pro。[0092]进行合成时，将位于寡肽的C-末端的氨基酸担载在树脂上，利用使N-末端的每一个氨基酸伸长的逐步延伸法进行合成，伸长反应中的肽耦合反应使用二异丙基碳化二亚胺DIC和1-羟基苯并三唑HOBt作为缩合剂。需要说明的是，伸长的N-末端氨基酸的氨基用9-芴基甲氧基羰基Fmoc保护起来，但由于寡肽的构成氨基酸中不包含具有反应活性的侧链，所以特别是没有对侧链进行保护。[0093]首先，将用Fmoc保护位于寡肽C-末端的Pro的N-末端、并将C-末端担载在树脂上而得到的0·5gFmoc-Pro-Wang树脂0·5-0·8mmolg、Bachem公司制）担载在树脂上。将其装入肽自动合成装置的反应容器中，使用20%哌啶-DMF溶液进行10分钟的Fmoc的脱保护。用DMF清洗树脂1分钟，之后在反应溶液中分别加入lmmol的Fm〇c-Gly-〇H、DIC和HOBt。反应1小时后，确认没有检测到未反应的N-末端，用DMF清洗1分钟。再用20%哌啶-DMF进行Fmoc的脱保护，用DMF清洗树脂后，分别加入Immol的Fmoc-Ala-〇H、DIC和HOBt进行反应。以下，按照相同的方法，对Pro、Gly也进行上述操作，使每一个氨基酸伸长。得到的Fmoc-Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Wang树脂用20%哌啶-DMF溶液进行10分钟的脱保护，之后减压干燥。得到的干燥树脂用TFAIOmLX3次进行处理，将寡肽粗产物从树脂中洗脱到TFA中。[0094]在室温下减压馏去所得的TFA溶液，之后在冰冷下向残余物中加入IOmL二乙醚，得到沉淀物。沉淀物进一步用二乙醚（10mLX5次清洗，将沉淀物减压干燥。此时得到的粗产物的重量为38.5mg收率为29.8%。将得到的粗产物溶解在纯净水中，利用反相高效液相色谱法HPLC进行分离收集，进行纯化。得到的纯化物通过薄层色谱法TLC、HPLC确认纯度后，通过Edman法确定氨基酸序列，再使用质量分析装置MLDI-TOF确认是目标分子量。[0095]最终的目的物的重量为30.7mg，收率为23.8%。[0096]使用所得的肽测定DPP-4抑制率和IC5q值。结果见表1。[0097]实施例2〜实施例9[0098]使用Fmoc-ArgPbf-Wang树脂、Fmoc-Hyp-Wang树脂、Fmoc-Ile-Wang树脂、Fmoc-Val-Wang树脂、Fmoc-Gln-Wang、Fmoc-Pro_Wang树脂作为寡肽的C-末端氨基酸，使用Fmoc-Gly-〇H、Fmoc-Pr〇-〇H、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Ile-ΟΗ作为Fmoc基保护氨基酸，根据实施例1来合成表1所不的Gly-Pro-Ala-Gly-Pro-Arg实施例2、Gly-Pr〇-Ala_Gly-Pr〇-Hyp实施例3、Gly-Pr〇-Ala-Gly-Pr〇-Ile实施例4、Gly-Pr〇-Leu-Gly-Pr〇-Val实施例5、Gly-Pr〇-Ile-Gly-Pro-Val实施例6、Gly-Pro_Val实施例7、Gly-Pro_Gln实施例8、Gly-Pr〇-Ala-Gly实施例9。[0099]需要说明的是，实施例2的肽合成不同于实施例1，由于使用包含2个氨基的Arg，所以使用Arg侧链的胍基已用Pbf基2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基保护起来的Fmoc-ArgPbf-Wang树脂，最后通过TFA除去Pbf基。[0100]同样，在实施例8的肽合成中，由于使用侧链包含酰胺基的Gln，所以使用Gln侧链的酰胺基已用Trt基三苯甲基保护起来的Fmoc-GlnTrt-Wang树脂，最后通过TFA除去Trt基。[0101]使用得到的肽，与实施例1同样操作，测定DPP-4抑制率。结果见表1。另外，制作实施例6中合成的肽Gly-Pro-Ile-Gly-Pro-Val的DPP-4抑制曲线。该抑制曲线见图1。[0102]实施例10〜实施例15[0103]使用氨基已用Fmoc基保护起来的氨基酸，依照实施例1合成表1所示的实施例10〜15的肽，制作DPP-4抑制曲线。结果见表1。需要说明的是，实施例10的肽合成与实施例1不同，由于使用包含2个羧基的Glu，所以使用Glu侧链的羧基已用叔丁基But基保护起来的Fmoc-GluOBut-Wang树脂，最后通过TFA除去But基。[0104]另外，关于实施例13的肽，使用Fmoc-SerBut-Wang树脂作为寡肽的C-末端氨基酸，依照实施例1合成Gly-Ala-IIe-Gly-Pro-Ser。需要说明的是，与实施例1不同，由于使用包含轻基的丝氨酸，所以使用Ser侧链的轻基已用叔丁基（But基）保护起来的Fmoc-SerBut-Wang树脂，最后通过TFA除去But基。[0105]比较例1〜比较例3[0106]使用氨基已用Fmoc基保护起来的氨基酸，依照实施例1合成表1所示的比较例1〜比较例3的肽。使用得到的肽，测定DPP-4抑制率和IC5q值。结果见表1。需要说明的是，比较例1〜比较例3的肽均为构成SEQIDNO:14的一部分氨基酸序列的肽。[0107]需要说明的是，在本申请中，以满足根据上述测定方法测定的DPP-4抑制率为30%以下、或IC5Q为ΙΟμπιοΙml以上的任一种肽作为比较例。[0108][^1][0110]结果）[0111]如表1的实施例1〜6、9、12〜15所示，当N末端为Gly、且从N末端起第2位的氨基酸残基为Pro或Ala的4〜6氨基酸的肽的N末端的第4位氨基酸残基为Gly时，不论从N末端起第3位的氨基酸的种类如何，DPP-4抑制活性均优异。特别是，如实施例1〜4和实施例9所示，具有Gly-Pro-Ala-Gly的序列的肽，随着肽链的变长，其DPP-4抑制活性增加。[0112]比较表1的比较例1〜比较例3和实施例7、8、10以及11可知：当为二肽或三肽时，即使从N末端起第2位是Pro或Ala，但若第3位是Hyp，则DPP-4抑制活性也极低或者不存在DPP-4抑制活性。[0113]实施例16〜实施例25[0114]使用氨基已用Fmoc基保护起来的氨基酸，依照实施例1合成表2所示的肽。另外，制作实施例17中合成的肽Leu-Pr0-Gly的DPP-4抑制曲线。该抑制曲线见图2。[0115]比较例4〜比较例7[0116]使用氨基已用Fmoc基保护起来的氨基酸，依照实施例1合成表2所示的比较例4〜比较例7的肽。使用得到的肽，测定DPP-4抑制率和IC5q值。结果见表2。需要说明的是，比较例4〜比较例7的肽均为构成SEQIDNO:14的一部分氨基酸序列的肽。[0119]结果）[0120]由表2的实施例16〜实施例25可知：即使从N末端起第2位的氨基酸残基是Hyp，也可发挥DPP-4抑制活性。另一方面，比较实施例20和比较例4〜7可知：从N末端起第2位的氨基酸残基为Pro或Hyp的二肽，根据N末端的氨基酸残基的种类，而具有DPP-4抑制活性大不相同的倾向，当为Phe、Pro时，完全不存在DPP-4抑制活性。[0121]比较实施例25和比较例6时，若在Ala-Hyp的二肽上结合Gly作为从N末端起第3位的氨基酸残基，则可发挥DPP-4抑制活性。如实施例21〜实施例25所示，并不限于N末端的氨基酸残基，均可观察到该倾向。而且，如实施例16〜实施例18所示，从N末端起第2位的氨基酸残基为Pro时，也可观察到下述倾向：若在第3位结合Gly，则DPP-4抑制活性增加，若肽链变长，则DPP-4抑制活性进一步增强。[0122]本发明基于2011年11月4日申请的日本国专利申请2011-242050号。日本国专利申请2011-242050号的说明书、专利申请的范围、附图全体均作为参照而纳入本说明书中。[0123]产业实用性[0124]根据本发明，可以制备来自胶原蛋白的安全性优异的DPP-4抑制剂，本发明是有用的。

权利要求：1.一种DPP-4抑制剂，包含来自胶原蛋白的肽，其中，所述肽为Gly-Pr0-Ala-Gly-Pr0-Hyp02.根据权利要求1所述的DPP-4抑制剂，其中，进一步包含选自由1^11-?仰-617、1^11-Pro-Gly-Pro-Ala、Ile-Hyp-Gly、Leu-Hyp-Gly-Pro-Ala、Gly-Pr〇-Ala-Gly、Gly-Ala_IIe-Gly-Pr〇-Ala、Gly-Ala—Ile—Gly-Pro—Ser、Gly-Ala-Val-Gly-Pro-Ala、Gly-Ala-Val-Gly-Pro和Gly-Ala组成的组中的一种以上的肽。

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