申请/专利权人：安徽微分基因科技有限公司

申请日：2020-06-19

公开（公告）日：2020-09-18

公开（公告）号：CN111676289A

主分类号：C12Q1/6886(20180101)

分类号：C12Q1/6886(20180101);C12Q1/6869(20180101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2024.02.13#发明专利申请公布后的驳回;2020.10.20#实质审查的生效;2020.09.18#公开

摘要：本发明涉及基因检测技术领域，且公开了一种EGFR基因19号外显子E746‑A750突变基因的检测方法，包括以下步骤：S1、用E746‑A750位点的PCR扩增引物对不同突变频率的E746‑A750标准品WT‑E746‑A750、10％‑E746‑A750、1％‑E746‑A750、0.1％‑E746‑A750进行Taq酶PCR扩增；S2、对不同突变频率的E746‑A750标准品WT‑E746‑A750、10％‑E746‑A750、1％‑E746‑A750、0.1％‑E746‑A750PCR扩增产物进行二代测序文库构建；只需对不同突变频率的E746‑A750标准品WT‑E746‑A750、10％‑E746‑A750、1％‑E746‑A750、0.1％‑E746‑A750PCR扩增产物进行二代测序文库构建及Cas9酶的消化和MiseqPE300测序，就可以实现对EGFR基因突变型的E746‑A750位点基因的富集及测序检测；相比于现有技术中检测EGFR基因19号外显子E746‑A750突变基因的方法，本技术方案的方法在保证准确率和高检出率的前提下，更重要的是：对于降低检测的背景噪音和检测低频突变更加的可靠。

主权项：1.一种EGFR基因19号外显子E746-A750突变基因的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、用E746-A750位点的PCR扩增引物对不同突变频率的E746-A750标准品WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750进行Taq酶PCR扩增；S2、对不同突变频率的E746-A750标准品WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750PCR扩增产物进行二代测序文库构建；S3、对合成的上下游sgRNA探针E746-A750-prob-PF、E746-A750-prob-PR进行变性退火；S4、对退火后的sgRNA探针E746-A750-prob-PF-PR进行转录及转录后磁珠纯化；S5、对构建完成的不同突变频率的E746-A750标准品WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750DNA文库进行Cas9酶的消化系统消化、Agilent4200检测不同突变频率的E746-A750标准品WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750DNA文库的消化结果；S6、用二代测序通用引物PCRPrimerMix2对消化完成的不同突变频率的E746-A750标准品WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750DNA文库进行PCR富集，对PCR富集的已消化不同突变频率的E746-A750标准品WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750DNA文库进行DNA磁珠纯化；S7、对纯化后PCR富集的已消化不同突变频率的E746-A750标准品WT-E746-A750、10％-E746-A750、1％-E746-A750、0.1％-E746-A750DNA文库进行MiseqPE300测序；S8、对MiseqPE300测序结果进行数据分析，给出结论。

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