申请/专利权人：黄河科技学院

申请日：2017-01-19

公开（公告）日：2020-09-25

公开（公告）号：CN106834375B

主分类号：C12P17/16(20060101)

分类号：C12P17/16(20060101);C12R1/645(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.09.25#授权;2017.07.07#实质审查的生效;2017.06.13#公开

摘要：本发明属于一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为25℃条件下静置培养40天，获得发酵物；培养基B的配方为：50~70g大米，100ml水；（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，在温度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。本发明的提取方法简单易行，成本更低，并具有可持续性。

主权项：1.一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）菌种活化：将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；（2）发酵培养：将步骤（1）制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为24~26℃条件下静置培养38~42天，获得发酵物；培养基B的配方为：50~70g大米，100ml水；（3）乙酸乙酯提取物的制备：将步骤（2）制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，在温度30～34℃，真空度0.07～0.08MPa减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；（4）可皆霉素的制备：将步骤（3）制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素；步骤（1）所用的狭旋毛壳菌种保藏的分类学名称为狭旋毛壳CLC001，保藏号为CCTCCNO：M2016231，保藏于中国典型培养物保藏中心；所述步骤（3）中将发酵物用乙酸乙酯浸取时的工艺条件如下：加入乙酸乙酯，20～25℃下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并提取液；所述步骤（4）中上柱分离的具体步骤如下：用80～100目硅胶拌样后装柱，固定相为200～300目硅胶，以二氯甲烷－甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷－甲醇的体积比为100:（2～4）的流份，30～40℃下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷－甲醇体积比为1：1混合溶剂溶解，经SephadexLH-20层析，得可皆霉素；所述步骤（4）中将乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80～100目硅胶的重量比为1︰2。

全文数据：一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法技术领域[0001]本发明属于可皆霉素生产技术领域，具体涉及一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法。背景技术[0002]狭旋毛壳属于子囊菌门毛壳属真菌，具有重要的经济学价值和生态意义。研究表明：毛壳菌作为生防菌能够应用于植物病害的防治。可皆霉素（Cochliodinol，分子式为C32H3QN2O4;分子量：506·22;CAS登录号：11051-88-0仅在毛壳属（Cftaetom·™，C.cocWioces中分离得到，其结构式为：[0003]Brewerr的科研团队发现，在l-10ygml时，可皆霉素抑制多属真菌的生长，并能抑制真菌BotiTiisaiiii和FusarirffimMiiiforme孢子的萌发，其形成三乙胺盐后，水溶性显著增加，且溶解后能显著抑制多种微生物质的生长;同时发现可皆霉素在低浓度时，能够抑制多种镰刀菌的生长，而镰刀菌可侵染多种植物粮食作物、经济作物、药用植物及观赏植物），引起植物多种病害，造成作物大量死亡，是生产上防治最具挑战性的病害之一。由此可见，其在植物病害防治方面的潜在应用价值非常大。另外，Casellada等研究发现可皆霉素具有显著细胞毒性，可以抑制人口腔上皮癌细胞KB和乳腺癌细胞MDA-MB-435的增殖，IC50分别为0.53μΜ、2·20μΜ〇[0004]综上所述，可皆霉素具有多种生物活性，但由于合成成本高，得率低，无法获得大量纯品，难以进行更深入研究。发明内容[0005]本发明的目的是提供一种生产成本低、产量高的利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法。[0006]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是，一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：1菌种活化:将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；2发酵培养:将步骤1制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为25°C条件下静置培养40天，获得发酵物;培养基B的配方为:50~70g大米，100ml水;培养基B的制备方法如下：将大米和水按比例混合，121°C下高压灭菌40分钟；3乙酸乙酯提取物的制备:将步骤2制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，在温度30〜34°C，真空度0.07〜0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；4可皆霉素的制备:将步骤3制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。[0007]步骤（1所用的狭旋毛壳菌种保藏的分类学名称为狭旋毛壳UflangxsiispiraJeCLCOOl，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学;保藏日期：2016年4月28日，保藏号为CCTCCΝ0:Μ2016231。该菌在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素。该菌的18SrDNA如序列表所示，BP[0008]所述步骤4中上柱分离的具体步骤如下：用80〜100目硅胶拌样后装柱，固定相为200〜300目硅胶，以二氯甲烷一甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:2〜4的流份，30〜40°C下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷一甲醇体积比为1:1混合溶剂溶解，经SephadexLH-20层析，流动相二氯甲烷一甲醇体积比为1:1，得可皆霉素。[0009]所述步骤（1中平板培养基配方为:酵母膏l〇gL，葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，琼脂粉20gL，pH6.0±0.1。[0010]所述步骤3中将发酵物用乙酸乙酯浸取时的工艺条件如下：加入乙酸乙酯，20〜25°C下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并提取液。[0011]所述步骤4中将乙酸乙酯提取物与80〜100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80〜100目硅胶的重量比为1:2。[0012]本发明产生的有益效果是：本发明中提供的狭旋毛壳（ChaeioniuΏangxsiispiraleCLCOO1可在发酵过程中代谢产出大量可皆霉素;本发明的提取方法简单易行，相对于其它培养基，该方法成本更低，并具有可持续性，提取得到可皆霉素单体，提取过程中用到的溶剂可回收利用，提取量大，可工业化生产。具体实施方式[0013]下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。[0014]实施例1一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：1菌种活化:将狭旋毛壳菌种保藏的分类学名称为狭旋毛壳CLC001，保藏号为CCTCCNO:M2016231，保藏于中国典型培养物保藏中心接种到90mm平板培养基上，25°C恒温培养72小时，获得活化菌种；2发酵培养:将步骤（1制备的活化菌种用手术刀片将其分为12份，取一份接种于培养基B中，温度为25°C条件下静置培养40天，获得发酵物;培养基B的配方为:60g大米，100ml水;培养基B的制备方法如下:将大米和水按比例混合，121°C下高压灭菌40分钟；3乙酸乙酯提取物的制备:将步骤2制备的发酵物用乙酸乙酯浸取加入乙酸乙酯300ml，20〜25°C下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并三次的提取液），得提取液，在温度30〜34°C，真空度0.07〜0.08MPa下减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物;通过HPLC检测，可皆霉素在乙酸乙酯提取物中的含量为68.90%;4可皆霉素的制备:将步骤3制备的乙酸乙酯提取物用80〜100目硅胶拌样后装柱乙酸乙酯提取物与80〜100目硅胶的重量比为1:2，固定相为200〜300目硅胶，以二氯甲烷一甲醇梯度洗脱二氯甲烷一甲醇体积比为1〇〇:〇;1〇〇:1;1〇〇:2;100:4;100:8，硅胶薄层层析，紫外254nm检测，合并二氯甲烷-甲醇的体积比为100:2和100:4的流份，40°C下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷一甲醇体积比为1:1的混合溶剂溶解，经SephadexLH-20羟丙基葡聚糖凝胶）层析，流动相二氯甲烷一甲醇体积比为1:1，得纯品可皆霉素400mg纯度为98·3%。[0015]本实施例制备得到的可皆霉素的结构鉴定如下：【性状】紫色粉末【鉴定】分子式：C32H3QN2O4，分子量：506·2206仪器设备:Agilent1100液相色谱仪，1H,13CNMR图谱由Brukeram-400MHz核磁共振仪测定TMS为内标），质谱由Agilent6490型质谱仪测定。[0016]利用ESI-MSHNMR和13CNMR试验，标准数据如下：ESI-MSώζ:505.2124[M-H]+;1HNMRCDCl3,400MHz5：8.411H,s,2,5-〇H,8.131H,s,1-NH,7.601H,s,H-2,7.441H,s,H-4,7.341H,d,J=8.4,H-7,7.081H,d,J=8.4,H-6,5.401H,m,H-II,3.461H,m,H-10,1.753H,s,13-CH3,1.741H,s,H-CH3;13C匪RCDCl3,100MHz5:134.4C-8,133.9C-5,131.7C-12,127.2C-2,126.3C-9,124.5C-Il,123.6C-6,120.9C-4,111.1C-7,110.8C-3,C-6,104.4C-3,34.7C-10,25.8C-14,17.9C-13.利用TLC，在UV254nm呈强荧光；以硫酸显色剂，110°C下15秒钟，呈现棕色。[0017]【含量测定】利用HPLC，色谱条件：SepaxGP-C185ym250mmX4.6mm色谱柱。流动相：乙腈:水：甲酸为10:90:0.1;流速:1.25111171^11，检测波长25411111，保留时间值9.451^11。[0018]最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明，而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解:依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

权利要求：1.一种利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，包括以下步骤：1菌种活化:将狭旋毛壳菌种接种平板培养基上，培养，获得活化菌种；2发酵培养:将步骤（1制备的活化菌种接种于培养基B中，温度为24〜26°C条件下静置培养38〜42天，获得发酵物;培养基B的配方为:50~70g大米，100ml水；3乙酸乙酯提取物的制备:将步骤2制备的发酵物用乙酸乙酯浸取，得提取液，减压回收乙酸乙酯后得到乙酸乙酯提取物；4可皆霉素的制备:将步骤3制备的乙酸乙酯提取物上柱分离，得可皆霉素。2.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，步骤（1所用的狭旋毛壳菌种保藏的分类学名称为狭旋毛壳CLCOO1，保藏号为CCTCCNO:M2016231，保藏于中国典型培养物保藏中心。3.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，所述步骤2中培养基B的制备方法如下:将大米和水按比例混合，121°C下高压灭菌40分钟。4.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，所述步骤4中上柱分离的具体步骤如下：用80〜100目硅胶拌样后装柱，固定相为200〜300目硅胶，以二氯甲烷一甲醇梯度洗脱，硅胶薄层层析检测，合并二氯甲烷一甲醇的体积比为100:2〜4的流份，30〜40°C下减压回收二氯甲烷和甲醇，再用二氯甲烷一甲醇体积比为1:1混合溶剂溶解，经SephadexLH-20层析，得可皆霉素。5.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，所述步骤1中平板培养基配方为:酵母膏10gL，葡萄糖40gL，蛋白胨10gL，琼脂粉20gL，pH6.0土0·1〇6.如权利要求I所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，所述步骤3中将发酵物用乙酸乙酯浸取时的工艺条件如下:加入乙酸乙酯，20〜25°C下冷浸12h，用纱布过滤，得到乙酸乙酯提取液，反复提取3次，合并提取液。7.如权利要求1所述利用狭旋毛壳菌发酵生产可皆霉素的方法，其特征在于，所述步骤4中将乙酸乙酯提取物与80〜100目硅胶拌样时，乙酸乙酯提取物与80〜100目硅胶的重量比为1:2。

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