申请/专利权人：台州市中心医院(台州学院附属医院)

申请日：2020-06-17

公开（公告）日：2020-10-13

公开（公告）号：CN111763752A

主分类号：C12Q1/689(20180101)

分类号：C12Q1/689(20180101);C12Q1/6844(20180101);C12Q1/6804(20180101);C12Q1/04(20060101);C12R1/35(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-发明专利申请公布后的驳回

法律状态：2023.07.07#发明专利申请公布后的驳回;2020.10.30#实质审查的生效;2020.10.13#公开

摘要：本发明公开了支原体技术领域的一种基于RPA对泌尿生殖道支原体的快速检测方法，该基于RPA对泌尿生殖道支原体的快速检测方法包括如下步骤：S1：引物和探针的设计和筛选：根据MH的16SrRNA基因和gap基因，使用oligo5软件严格按照扩增试剂盒分析设计手册设计了5对引物，并进行BLAST验证，试剂盒用于筛选最佳的RPA引物，将五对引物分别对同一个MH阳性标本进行RPA扩增，每个50μl反应体系包含29.5μl的无引物复水缓冲液，本发明能够快速、灵敏、即时的检测支原体，能够有效对适龄妇女及男性进行支原体的筛查。

主权项：1.一种基于RPA对泌尿生殖道支原体的快速检测方法，其特征在于，该基于RPA对泌尿生殖道支原体的快速检测方法包括如下步骤：S1：引物和探针的设计和筛选：根据MH的16SrRNA基因和gap基因，使用oligo5软件严格按照DNA扩增试剂盒分析设计手册设计了5对引物，并进行BLAST验证，Basic试剂盒用于筛选最佳的RPA引物，将五对引物分别对同一个MH阳性标本进行RPA扩增，每个50μl反应体系包含29.5μl的无引物复水缓冲液，2.4μl的正反向引物，10.2μl的dH2O和3μl的模板，最后加入2.5μl醋酸镁启动反应，反应管短暂离心并旋转以混合试剂，快速放入到恒温仪中孵育，用纯化试剂盒进行纯化，并进行2％琼脂糖凝胶电泳，进行显色检测，筛选出最优引物后根据DNA扩增试剂盒分析设计手册和GenlineHybridetect-1试纸条设计探针，并对其进行标记，反向引物的5‘端用生物素标记，在探针的5‘端用6-羧基荧光素基团6-FAM、3‘端的C3间隔基SpC3标记，四氢呋喃THF残基标记中间内部碱基；S2：基础RPA分析：使用Basic试剂盒进行检测，反应过程与上述引物筛选过程一致，扩增、纯化和电泳；S3：测流纸条RPA分析：TwistAmpNFO试剂盒与杂交检测试纸条联合使用检测样本，严格按照TwistAmpNFO试剂盒说明书进行RPA扩增，每50μl反应体系中包括29.5μl复水缓冲液、4.2μlRPA正反向引物、0.6μl标记探针、10.2μldH2O和3μl模板，振荡混匀后加入2.5μl醋酸镁启动反应，反应管离心舜离后立即转移到孵育器中孵育，该过程应避免产生气泡，TwistAmpNFO试剂盒扩增产物无需进行纯化，可直接将10μl的反应产物稀释到100μl的缓冲液中，试纸条垂直放入缓冲液中，5min后即可读出反应结果，当出现控制线和测试线时，认为是阳性的结果，而当只有控制线时，认为是阴性的，当控制线和测试线均不可见时，认为该结果是无效的；S4：传统PCB检测：共25μl反应体系，包括2×TaqPCRMasterMix12.5μl、正反向引物各1μl、DNA模板2μl和8.5μldH2O，PCR扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，放入仪器进行成像观察；S5：特异度和灵敏度分析：对七种病原体进行特异度分析，分别为生殖道常见病原体，解脲支原体、人型支原体、生殖支原体、沙眼衣原体、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、乳酸杆菌，基础RPA和LF-RPA均进行了特异度分析，基础RPA、LF-RPA和PCR三种检测方法的灵敏度均采用系列稀释法进行评价，DNA浓度分别为16ngul、1.6ngul、160pgul、16pgul、1.6pgul、160fgul、16fgul、1.6fgul，从而确定其检出限；S6：RPA反应条件：为了确定RPA的最佳反应条件，即反应温度和反应时间对扩增产物的影响，根据酶的最适温度设置了六个温度梯度，反应时间则设置了六个等梯度时间，将反应管置于冰上停止反应，直到进一步的处理，通过对RPA-AGE和RPA-LFD的检测结果确定了基础RPA扩增和RPA-LFD的最优反应条件；S7：临床样本的检测：取送检的支原体培养液60例，提取DNA，分别用基础RPA、RPA-LFD进行检测，将结果与得出的培养结果进行比较，分别测定其灵敏度和特异度；S8：数据分析：使用SPSSStatisticsv.26分析实验数据，评价LF-RPA和基础RPA检测的特异性、敏感性和准确性，采用McNemar卡方检验比较LF-RPA、基础RPA和常规PCR方法的敏感性，用Kappa值衡量LF-RPA、基础RPA和常规培养结果之间的符合度。

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权利要求：

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