申请/专利权人：浙江大学

申请日：2018-09-30

公开（公告）日：2020-10-13

公开（公告）号：CN109289053B

主分类号：A61K47/59(20170101)

分类号：A61K47/59(20170101);A61K9/51(20060101);A61K47/34(20170101);A61K31/337(20060101);A61P35/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.13#授权;2019.03.01#实质审查的生效;2019.02.01#公开

摘要：本发明公开了一种卡巴他赛‑寡聚乳酸偶联前药及其制备方法，包括：缩合剂和催化剂作用下，卡巴他赛与寡聚乳酸发生酯化反应，得到所述的卡巴他赛‑寡聚乳酸偶联前药。本发明同时公开了上述卡巴他赛‑寡聚乳酸偶联前药制剂及制备方法以及应用。本发明将寡聚乳酸与卡巴他赛共价偶联，可以调控卡巴他赛在体内的释放速率，防止卡巴他赛因暴释而析出，延长其在体内的循环周期，增加最大耐受剂量。同时，寡聚乳酸已被美国FDA批准上市使用，具有很好的应用前景。卡巴他赛‑寡聚乳酸前药与两亲性高分子PEG5k‑PLA8k组装形成纳米粒，具有被动靶向作用，易通过EPR效应滞留于肿瘤部位，从而较大地降低药物对正常组织的毒副作用。

主权项：1.一种卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药，其特征在于，结构如下式所示： m＝1-10,n＝5～40。

全文数据：卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药、制剂及其制备方法与应用技术领域本发明属于药物合成技术领域，具体是涉及一种卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药、制剂及其制备方法与应用。背景技术卡巴他赛cabazitaxel是一种紫杉烷类衍生物，于2010年6月经美国FDA批准上市用于激素难治性转移性前列腺癌的治疗。相比于紫杉醇、多西他赛，卡巴他赛具有更强的抑制肿瘤增殖的活性，并且卡巴他赛与P-糖蛋白P-glycoprotein的亲和力较低，药物耐受性的几率低，可以用于治疗多药耐药性肿瘤。其主要是通过与肿瘤细胞内的微管蛋白结合，使微管更趋于稳定，抑制微管解聚，影响有丝分裂的进行，从而抑制肿瘤细胞增殖。卡巴他赛虽然药物耐受性几率低、抗肿瘤效果强，但是其水溶性差，需要通过添加表面活性剂氢化蓖麻油、吐温80和乙醇。而表面活性剂在临床应用时表现出一定的生理毒性，且卡巴他赛本身具有较强的骨髓抑制毒性，这两点均较大程度地影响了其在临床上的应用。在临床Ⅰ期试验中，卡巴他赛的最大耐受剂量MTD仅为25mgm2，远小于紫杉醇的175mgm2以及多西他赛的60-100mgm2。为了降低卡巴他赛的毒副作用，延长其在体内的循环周期，需要对卡巴他赛进行结构设计。目前主要是将卡巴他赛制成纳米制剂以增加其水溶性。发明内容本发明提供了一种卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药、制备方法、制剂以及应用。发明将无毒且具有很好的生物相容性和生物可降解性的寡聚乳酸链PLA与卡巴他赛CTX2’位上的羟基共价偶联，得到卡巴他赛-寡聚乳酸前药，再将合成得到的卡巴他赛-寡聚乳酸前药与两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸PEG5k-PLA8k共溶形成纳米粒，具有较好的抗肿瘤活性。一种卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药，结构如下式所示：m＝1-10,n＝2-100。m＝1-10。作为优选，m＝2或3。n＝2-100。作为优选，n＝5～40，进一步优选为n＝8～36，作为进一步优选，n为8、18、36。本发明提供了一种上述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药的制备方法，包括：缩合剂和催化剂作用下，卡巴他赛与寡聚乳酸发生酯化反应，得到所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药；所述寡聚乳酸结构式如下：作为优选，m＝2或3。作为优选，所述寡聚乳酸为寡聚乳酸600、寡聚乳酸1200以及寡聚乳酸2600。作为优选，所述寡聚乳酸为下列之一：作为优选，缩合剂为1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺EDC，催化剂为4-二甲氨基吡啶DMAP。作为优选，反应溶剂为二氯甲烷或氯仿。作为优选，反应温度为40～50℃。反应时间为2～24小时。作为优选，所述催化剂、缩合剂、寡聚乳酸与卡巴他赛的摩尔比分别独立的为1～2：1。一种卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂，包括所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药和聚乙二醇-聚乳酸。作为优选，以卡巴他赛的质量计算，所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药与聚乙二醇-聚乳酸的质量比为1:10～30。作为优选，所述聚乙二醇-聚乳酸为PEG5k-PLA8k。本发明中，所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂为平均粒径均在20-30nm的纳米颗粒。一种所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂的制备方法，包括：将卡巴他赛-寡聚乳酸前药与聚乙二醇-寡聚乳酸溶于有机溶剂并混合均匀，匀速滴入水相后除去有机溶剂，得到均匀分散的纳米粒。制备过程中，可选择分别将卡巴他赛-寡聚乳酸前药和聚乙二醇-聚乳酸溶解在一定体积的有机溶剂中，然后再将两个有机溶液混合均匀，最后将混合均匀的溶液加入到水相中。作为优选，混合前卡巴他赛-寡聚乳酸前药在有机溶剂中的浓度为0.5～1.5mgml，聚乙二醇-聚乳酸PEG5k-PLA8k的浓度为10～30mgml，以质量比为1:10～30以卡巴他赛质量计，卡巴他赛-寡聚乳酸前药与聚乙二醇-聚乳酸质量比制备纳米粒。作为进一步优选，制备纳米粒时卡巴他赛-寡聚乳酸前药在有机溶剂中的浓度为1mgml，聚乙二醇-聚乳酸PEG5k-PLA8k的浓度为20mgml，以质量比为1:20制备纳米粒。此纳米粒制备过程中，有机试剂选择丙酮溶剂。混合均匀并滴加完成后，卡巴他赛-寡聚乳酸前药在水中的浓度为0.05～0.2mgml，聚乙二醇-寡聚乳酸PEG5k-PLA8k的浓度为1～3mgml。作为进一步优选，卡巴他赛-寡聚乳酸前药在水中的浓度为0.1mgml，聚乙二醇-寡聚乳酸PEG5k-PLA8k的浓度为2mgml。本发明提供了以上卡巴他赛-寡聚乳酸纳米粒的粒径分布图以及扫描电镜图，其平均粒径均在20-30nm范围内。本发明还提供了前药纳米粒在37℃、含有0.3％吐温80的磷酸缓冲液中的释放实验。实验结果表明卡巴他赛-寡聚乳酸前药纳米粒中卡巴他赛释放缓慢，且寡聚乳酸链越长，其释放速率越慢。本发明制备得到的卡巴他赛-寡聚乳酸前药纳米粒缓慢释放药物分子，可以延长体内循环周期。纳米粒粒径较小，易通过实体瘤部位的高通透性和滞留效应EPR效应，在肿瘤部位积聚，降低对正常组织的损害，更好地发挥抗肿瘤效果。并且寡聚乳酸以及聚乙二醇-聚乳酸均已被美国FDA批准上市使用，具有更好的临床转化功能。一种所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明还提供了卡巴他赛-寡聚乳酸纳米粒的细胞毒性实验、动物毒性实验以及裸鼠药效实验。细胞毒性实验结果进一步表明卡巴他赛-寡聚乳酸纳米粒药物释放缓慢，可以延长体内循环周期。动物毒性实验结果表明卡巴他赛-寡聚乳酸前药纳米粒小鼠体重及白细胞数量未出现明显减少，而游离型卡巴他赛组小鼠体重及白细胞均显著下降，且出现死亡情况，这说明卡巴他赛-寡聚乳酸前药纳米粒显著地降低了卡巴他赛的全身毒性，增大了MTD值。裸鼠肿瘤实验进一步评价了卡巴他赛-寡聚乳酸前药纳米粒的药效。结果表明：与生理盐水对照组相比，卡巴他赛-寡聚乳酸前药纳米粒组的肿瘤缩小了3-7倍；相比于游离型卡巴他赛组，卡巴他赛-寡聚乳酸前药纳米粒组缩小了1-2倍。本发明在卡巴他赛羟基位点偶联不同分子量的寡聚乳酸链PLA，得到卡巴他赛寡聚乳酸系列前药。将卡巴他赛寡聚乳酸系列前药与两亲性聚合物聚乙二醇-聚乳酸PEG5k-PLA8k共溶于有机试剂丙酮中，滴入纯化水后除去有机试剂形成直径约25nm的纳米粒。纳米粒具有被动靶向作用，可以通过肿瘤部位的EPR效应更好地滞留在肿瘤部位，从而发挥药效。同时，卡巴他赛-寡聚乳酸前药可以缓慢释放出卡巴他赛分子，延长了药物在体内的循环周期，极大地降低了卡巴他赛的毒性，提高了MTD。与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：1将多种不同分子量的寡聚乳酸与卡巴他赛共价偶联，可以调控卡巴他赛在体内的释放速率，防止卡巴他赛因暴释而析出，改善药代动力学，延长其在体内的循环周期。2寡聚乳酸是一种无毒且具有很好的生物相容性和生物可降解性的聚合物，最终降解产物CO2和H2O可通过肾脏排出体外。同时，寡聚乳酸已被美国FDA批准上市使用，具有很好的应用前景。3卡巴他赛-寡聚乳酸前药与两亲性高分子PEG5k-PLA8k组装形成纳米粒，具有被动靶向作用，易通过EPR效应滞留于肿瘤部位，从而较大地降低药物对正常组织的毒副作用和增加最大耐受剂量MTD。附图说明图1为实施例1oLA8-CTX偶联前药1的合成路线；图2为实施例2oLA18-CTX偶联前药2的合成路线；图3为实施例3oLA36-CTX偶联前药3的合成路线；图4-6为实施例4-6oLAn-CTX纳米制剂的粒径分布；图7-9为实施例4-6oLAn-CTX纳米制剂的透射电镜；图10为实施例7oLAn-CTX纳米制剂的体外释放；图11-12为实施例9oLAn-CTX纳米制剂的体内毒性实验。图13为实施例10oLAn-CTX纳米制剂的抑肿瘤效果实验。具体实施方式以下具体实施方式用来进一步说明本发明。实施例中采用的mPLA600·SA、mPLA1200·SA、mPLA2600·SA均为丁二酸酐乙二醇改性的寡聚乳酸，均购自AdvancedPolymerMaterialsInc.Montreal,Canada公司。实施例1oLA8-CTX偶联前药1的合成，如图1所示：在装有球形冷凝管的100ml圆底烧瓶中依次加入CTX卡巴他赛，100mg，0.1196mmol、mPLA600·SA129.2mg，0.1794mmol以及DMAP21.9mg，0.1794mmol，溶解于4ml无水二氯甲烷，再快速滴加EDC27.9mg，0.1794mmol。43℃搅拌过夜，利用薄层色谱观察反应情况展开剂：DCM：MeOH＝20:1。当反应基本结束时，冷却反应液，然后分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机层用无水硫酸钠干燥，干燥完全后过滤。滤液旋蒸除去溶剂。通过柱层析DCM：MeOH＝80:1分离纯化得到最终产物1对应式I中n＝8的结构，168.3mg,收率91.5％。产物1的1HNMR核磁数据如下：1HNMR400MHz,CDCl3:δ8.10-8.12d,2H,J＝8.0,7.59-7.62m,1H,7.48-7.52t,2H,J＝8.0,7.38-7.41m,2H,7.30-7.33m,3H,6.21-6.26br,1H,5.64-5.65d,1H,J＝4.0,5.47s,1H,5.13-5.19m,8H,5.10-5.12m,1H,4.98-5.01d,1H,J＝12.0,4.82s,1H,4.23-4.34m,3H,4.16-4.18d,1H,J＝8.0,3.88-3.92m,1H,3.83-3.85d,1H,J＝8.0,3.68-3.70m,2H,3.63-3.65m,6H,3.53-3.56m,2H,3.44s,3H,3.38s,3H,3.30s,3H,2.62-2.80m,5H,2.43s,3H,2.12-2.29m,2H,1.98s,3H,1.75-1.82m,1H,1.71s,3H,1.53-1.60m,24H,1.36s,9H,1.26s,1H,1.20-1.21m,6H。实施例2oLA18-CTX偶联前药2的合成，如图2所示：在装有球形冷凝管的100ml圆底烧瓶中依次加入CTX200mg，0.2393mmol、mPLA1200·SA560mg，0.3590mmol以及DMAP43.9mg，0.3590mmol，溶解于7ml无水二氯甲烷，再快速滴加EDC55.7mg，0.3590mmol。43℃搅拌过夜，利用薄层色谱观察反应情况展开剂：DCM：MeOH＝20:1。当反应基本结束时，冷却反应液，然后分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机层用无水硫酸钠干燥，干燥完全后过滤。滤液旋蒸除去溶剂。通过柱层析DCM：MeOH＝80:1分离纯化得到最终产物2对应式I中n＝18的结构，475.7mg,收率83.6％。产物2的1HNMR核磁数据如下：1HNMR400MHz,CDCl3:δ8.10-8.12d,2H,J＝8.0,7.59-7.62m,1H,7.48-7.52t,2H,J＝8.0,7.38-7.41m,2H,7.29-7.33m,3H,6.22-6.26br,1H,5.64-5.65d,1H,J＝4.0,5.45s,1H,5.14-5.19m,18H,5.10-5.12m,1H,4.98-5.01d,1H,J＝12.0,4.82s,1H,4.23-4.34m,3H,4.16-4.18d,1H,J＝8.0,3.88-3.92m,1H,3.84-3.85d,1H,J＝4.0,3.67-3.70m,2H,3.63-3.65m,6H,3.53-3.56m,2H,3.44s,3H,3.38s,3H,3.30s,3H,2.62-2.77m,5H,2.43s,3H,2.17-2.29m,2H,1.98s,3H,1.75-1.82m,1H,1.71s,3H,1.56-1.59m,54H,1.35s,9H,1.26s,1H,1.20-1.21m,6H。实施例3oLA36-CTX偶联前药3的合成，如图3所示：在装有球形冷凝管的100ml圆底烧瓶中依次加入CTX80mg，0.09570mmol、mPLA2600·SA403.9mg，0.1436mmol以及DMAP17.5mg，0.1436mmol，溶解于6ml无水二氯甲烷，再快速滴加EDC22.3mg，0.1436mmol。43℃搅拌过夜，利用薄层色谱观察反应情况展开剂：DCM：MeOH＝20:1。当反应基本结束时，冷却反应液，然后分别用5％柠檬酸，饱和碳酸氢钠，饱和食盐水清洗。有机层用无水硫酸钠干燥，干燥完全后过滤。滤液旋蒸除去溶剂。通过柱层析DCM：MeOH＝80:1分离纯化得到最终产物2对应式I中n＝36的结构，246.4mg,收率70.9％。产物3的1HNMR核磁数据如下：1HNMR400MHz,CDCl3:δ8.10-8.12d,2H,J＝8.0,7.59-7.62m,1H,7.48-7.52t,2H,J＝8.0,7.38-7.41m,2H,7.29-7.33m,3H,6.22-6.26br,1H,5.64-5.65d,1H,J＝4.0,5.46s,1H,5.14-5.19m,36H,5.10-5.12m,1H,4.98-5.00d,1H,J＝8.0,4.82s,1H,4.23-4.34m,3H,4.16-4.18d,1H,J＝8.0,3.88-3.92m,1H,3.83-3.85d,1H,J＝8.0,3.67-3.70m,2H,3.63-3.65m,6H,3.53-3.56m,2H,3.44s,3H,3.38s,3H,3.30s,3H,2.62-2.79m,5H,2.43s,3H,2.17-2.27m,2H,1.98s,3H,1.75-1.82m,1H,1.71s,3H,1.57-1.59m,108H,1.35s,9H,1.26s,1H,1.20-1.21m,6H。实施例4前药1纳米粒的制备将oLA8-CTX1.8mg，含CTX1mg和PEG5k-PLA8k20mg分别溶解于1ml丙酮中，混合均匀后匀速滴加进10ml纯化水中，再用1ml丙酮洗涤混合容器后滴入上述纯化水中。滴加完毕后，减压旋蒸除去丙酮，得到均匀分布的oLA8-CTX-NPs纳米粒。其纳米粒粒径分布及透射电镜如图4、图7所示。实施例5前药2纳米粒的制备将oLA18-CTX3.6mg，含CTX1mg和PEG5k-PLA8k20mg分别溶解于1ml丙酮中，混合均匀后匀速滴加进10ml纯化水中，再用1ml丙酮洗涤混合容器后滴入上述纯化水中。滴加完毕后，减压旋蒸除去丙酮，得到均匀分布的oLA18-CTX-NPs纳米粒。其纳米粒粒径分布及透射电镜如图5、图8所示。实施例6前药3纳米粒的制备将oLA36-CTX5.4mg，含CTX1mg和PEG5k-PLA8k20mg分别溶解于1ml丙酮中，混合均匀后匀速滴加进10ml纯化水中，再用1ml丙酮洗涤混合容器后滴入上述纯化水中。滴加完毕后，减压旋蒸除去丙酮，得到均匀分布的oLA36-CTX-NPs纳米粒。其纳米粒粒径分布及透射电镜如图6、图9所示。实施例7前药1-3纳米粒的体外释放将实施例中4-6制备的纳米药物3mL分别置于分子量为7000kDa的透析袋中，置于外界20mLpH为7.4的磷酸缓冲液中，在温度为37℃，转速为150rmin的环境中，分别在24h、48h、72h、96h、120h取出外界磷酸缓冲液，将释放液用0.1MNaOH溶液水解完全后上高效液相检测，从而得到3个纳米药物的相应的体外释放情况。同理，游离型CTX亦通过NaOH水解测定浓度，从而获得其释放曲线。由图10可知，寡聚乳酸分子量越高，释放地越缓慢。实施例8前药1-3纳米粒的体外细胞毒性实验本发明通过MTT法考察实施例4-6制备得到的前药纳米粒对肿瘤细胞的杀伤作用。本发明对A549和Hela细胞进行了体外细胞毒性实验，实验结果如下表所示。表1结果表明，实施例4-6制备得到的前药纳米粒中卡巴他赛释放缓慢，在作用72h后对细胞的杀伤作用低于游离型卡巴他赛。表1.药物作用72小时后细胞成活率的测定IC50±SDinnM实施例9前药1-3纳米粒的体内毒性实验本发明将ICR小白鼠每只约25g作为实验对象，评价freeCabazitaxel，oLA8-CTX、oLA18-CTX、oLA36-CTX的体内毒性。总共分为5组，每组10只小鼠。实验组通过尾静脉注射300μL含20mgkgCTX的freecabazitaxel，oLA8-CTX-NPs、oLA18-CTX-NPs和oLA36-CTX-NPs，对照组注射相同体积的PBS。每隔2天注射1次，总共注射3次。给药后15天内测量并记录小鼠的体重和白细胞数量的变化情况。小鼠体重及白细胞数量变化情况如图11、12所示。由图可得，实施例4-6制备得到的前药纳米粒的毒性远低于游离型卡巴他赛。前药纳米粒基本不影响小鼠体重，而游离型卡巴他赛不仅使小鼠体重以及白细胞数量显著减小，还引起了小鼠死亡。实施例10前药1-3纳米粒的抑肿瘤效果实验本发明采用A549人肺癌异种移植裸鼠模型对实施例4-6制备得到的前药纳米粒进行抑瘤效果评价。当裸鼠皮下肿瘤体积达到250mm3时，开始给药。以尾静脉注射的方式进行给药，共5组，分别为生理盐水、CTX、oLA8-CTX-NPs、oLA18-CTX-NPs以及oLA36-CTX-NPs。给药剂量均为15mgkg，对照组PBS组注射相同的体积，每隔两天注射一次，总共注射三次。给药结束后，继续观察并测量肿瘤的长宽以及裸鼠体重，根据肿瘤体积以及裸鼠体重变化，判断药物的抑肿瘤效果。A549抑瘤效果图如图13所示。由图可知，相比于生理盐水对照组，实施例4-6制备得到的前药纳米粒均具有很好的抑瘤效果。实施例5制备得到的前药纳米粒相比于游离型卡巴他赛，具有更显著的抑瘤效果。故三种纳米粒中，实施例5制备得到的前药纳米粒的效果最优。

权利要求：1.一种卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药，其特征在于，结构如下式所示：m＝1-10,n＝2-100。2.根据权利要求1所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药，其特征在于，n为8、18、36。3.一种权利要求1所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药的制备方法，其特征在于，包括：缩合剂和催化剂作用下，卡巴他赛与寡聚乳酸发生酯化反应，得到所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药；所述寡聚乳酸结构式如下：4.根据权利要求3所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药的制备方法，其特征在于，缩合剂为1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺，催化剂为4-二甲氨基吡啶。5.一种卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂，其特征在于，包括权利要求1或2所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药和聚乙二醇-聚乳酸。6.根据权利要求5所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂，其特征在于，以卡巴他赛的质量计算，所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药与聚乙二醇-聚乳酸的质量比为1:10～30。7.根据权利要求5所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂，其特征在于，所述聚乙二醇-聚乳酸为PEG5k-PLA8k。8.根据权利要求5所述的卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂，其特征在于，所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂为平均粒径均在20-30nm的纳米颗粒。9.一种权利要求5～8任一项所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药制剂的制备方法，其特征在于，包括：将卡巴他赛-寡聚乳酸前药与聚乙二醇-聚乳酸溶于有机溶剂并混合均匀，匀速滴入水相后除去有机溶剂，得到均匀分散的纳米粒。10.一种权利要求1或2所述卡巴他赛-寡聚乳酸偶联前药在制备抗肿瘤药物中的应用。

百度查询： 浙江大学 卡巴他赛-寡/聚乳酸偶联前药、制剂及其制备方法与应用

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