申请/专利权人：湖南省植物保护研究所

申请日：2019-05-24

公开（公告）日：2020-10-13

公开（公告）号：CN110358700B

主分类号：C12N1/20(20060101)

分类号：C12N1/20(20060101);A01N63/20(20200101);A01P1/00(20060101);C12R1/01(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.13#授权;2019.11.15#实质审查的生效;2019.10.22#公开

摘要：本发明公开了一种光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用。该光合细菌菌株为荚膜红细菌A18。1本发明的光合细菌荚膜红细菌A18的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到柑桔溃疡病防控的生防菌剂及生防发酵液。2本发明的光合细菌荚膜红细菌A18制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。

主权项：1.一种光合细菌荚膜红细菌Rhodobactercapsulatus菌株A18，其特征在于，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCCNO:M2019292。

全文数据：光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用技术领域本发明涉及生物农药技术领域，具体是用于柑桔溃疡病的防治的光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用。背景技术柑桔作为世界上广泛种植的果树，其适应能力强，广泛种植于世界各个国家。在柑桔生产中，由于病虫危害，给柑桔行业带来了巨大的经济损失。其中，柑桔溃疡病，是柑桔最危险的病害之一，也是我国柑桔产地最为重要而又普遍的病害之一，尤以广东、广西、湖南、湖北和福建等省区危害严重。而且，近十年来，柑桔溃疡病其发生及流行还有加重的趋势。柑桔溃疡病，作为一种细菌性病害，是由地毯草黄单胞杆菌xanthomonasaxonopodispv.citri引起的柑桔性病害。该病害在日本、中国、印度尼西亚、越南、泰国和印度一带自古以来即有发生。此外，南非、澳大利亚与新西兰因从日本输入了柑桔也有该病发生。柑桔溃疡病，作为一种柑桔检疫性病害，其危害柑桔叶片、枝稍和果实，导致柑桔果实产量严重降低，品质变劣，影响果品出口创汇和内销。近几年来，柑桔种植面积大幅度增加，柑桔苗木，果实的调运，加大了柑桔溃疡病危害的发生和传播。柑桔溃疡病已发展成为目前柑桔生产的主要障碍之一。目前对于柑桔溃疡病的病原、发生规律及其化学防治等方面的研究取得了一定的进展。使用化学方法防治虽然防效直观，但对环境的污染、潜在的安全性隐患以及病原物抗性的产生都是不容忽视的问题。尤其是我国加入WTO和对环境保护日益重视的形势下，我们必须重视绿色食品的生产，以适应国内外形势发展的需要。因此，为了柑桔的高产、无毒、无公害可持续发展等目标，有针对性的发展高效、低毒、无残留绿色生物农药来防治柑桔病害，尤其是柑桔溃疡病的发生，最大限度的降低由于病害爆发引起的减产、化学农药过量施用严重影响柑桔品质的现状，开发生物农药成为一个行之有效的解决途径。目前，用于柑桔溃疡病害生物防治的拮抗微生物的报道不多。主要是1969年在日本首次被发现和利用的颉颃细菌，能有效抑制病原菌的增殖，阻止发病，但并不能溶解病原菌，这种抗菌物质属于类植保素。国外曾用这种颉颃细菌和溃疡病菌混合接种于柑桔枝稍上，克大大抑制病原菌的繁殖。除此之外，张清杰首次报道蚕抗菌肽为一种免疫血淋巴对柑桔溃疡病具有杀菌作用。离体实验结果表明，它对于柑桔溃疡病具有很强的杀菌作用，可迅速，有效的破坏细菌的细胞膜，导致物质渗透压改变和渗漏，从而杀灭病菌。近年来，国内外学者在光合细菌的基础性研究、应用研究方面也取得很大的进展。诸多研究结果证明，光合细菌的一些活性物质能钝化病原体的致病力、促进放线菌等有益微生物增殖，以及抑制病原体的生长，从而有效地抑制某些植物病害的发生与蔓延。因而，利用光合细菌防治柑桔溃疡病具有丰富的生防资源和广阔的应用前景。发明内容基于此，有必要针对柑桔溃疡病防治的问题，提供一种光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用。本发明采用的技术方案如下：一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌菌株，光合细菌菌株为荚膜红细菌A18，保藏编号CCTCCNO:M2019292，于2019年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址：中国武汉。一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂，光合细菌生防菌剂由上述的光合细菌菌株经活化、培养制备得到。一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：活化：将光合细菌菌株荚膜红细菌A18的保存种按平板培养法进行培养，培养至褐红色单菌落出现；种子培养：将褐红色单菌落接入至光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；生产培养：菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种至光合细菌生产培养基，进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂。进一步地，步骤种子培养的温度为28℃～32℃，光照条件为6000Lx～8000Lx，pH为7.0。进一步地，生产培养的温度为28℃～32℃，光照条件为6000Lx～8000Lx，pH为7.0。进一步地，光合细菌液体培养基配方和光合细菌生产培养基配方均为：蛋白胨5gL、葡萄糖1gL、YE2.5gL、NH42SO41.8gL、Na2CO31.0gL、K2HPO40.4gL、MgSO40.5gL，pH＝7.0。一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防发酵液，光合细菌生防发酵液为上述的光合细菌生防菌剂分离的上清液或上述制备方法制得的光合细菌生防菌剂分离的上清液。进一步地，分离方法为离心，离心的转速为6000～8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为10～15min。一种上述光合细菌生防菌剂或上述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，光合细菌生防菌剂应用于防控柑桔溃疡病。本发明具有以下有益效果：本发明的光合细菌荚膜红细菌A18的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到柑桔溃疡病防控的生防菌剂及生防发酵液；本发明的光合细菌荚膜红细菌A18制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性。除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照图，对本发明作进一步详细的说明。附图说明构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：图1为光合细菌荚膜红细菌A18对于柑桔溃疡病菌拮抗防效发病情况图；图2为本发明优选实施例的光合细菌生防菌剂的示意图。具体实施方式以下结合附图对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以由下述所限定和覆盖的多种不同方式实施。本发明的优选实施例提供了一种光合细菌菌株为荚膜红细菌A18，保藏编号CCTCCNO:M2019292，于2019年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心。该荚膜红细菌A18分离自土壤，其具体序列如下：CGGGGCGGCAGACTACACATGCAGTCGAGCGAGACCTTCGGGTCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACGCGTGGGAACGTGCCCTTTGCTACGGAATAGCCCCGGGAAACTGGGAGTAATACCGTATGTGCCCTTCGGGGGAAAGATTTATCGGCAAAGGATCGGCCCGCGTTGGATTAGGTAGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGCCGACGATCCATAGCTGGTTTGAGAGGATGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATCTTAGACAATGGGGGAAACCCTGATCTAGCCATGCCGCGTGAGCGATGAAGGCCTTAGGGTTGTAAAGCTCTTTCAGGTGGGAAGATAATGACGGTACCACCAGAAGAAGCCCCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGGGCTAGCGTTGTTCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGTAGGCGGATCAGAAAGTCAGAGGTGAAATCCCAGGGCTCAACCTTGGAACTGCCTTTGAAACTCCTGGTCTTGAGGTCGAGAGAGGTGAGTGGAATTCCGAGTGTAGAGGTGAGATTCGTAGATATTCGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCACTGGCTCGATACTGACGCTGAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTACACGATGAATGCCAGTCGTCGGCAGGCATGCCTGTCGGTGACACACCTAACGGATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTATAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGCAGAACCTTACCAACCCTTGACATCGGGATCGCGGTTACCGGAGACGGTTTCCTTCAGTTCGGCTGGATCACAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTCGGTT。本实施例的光合细菌菌株经生理生化鉴定和分子生物学鉴定为荚膜红细菌，其拉丁文名称为RhodobactercapsulatusA18。主要生物学特征有：在固体平板培养基上培养2d～4d，形成褐红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养4d呈褐红色；在好氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度28℃～32℃，pH＝7.0。一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂，光合细菌生防菌剂由上述光合细菌菌株经活化、培养制备得到。培养可分为种子培养和生产培养两个阶段。采用荚膜红细菌A18菌株为原料，经活化、种子培养、生产培养制备得到光合细菌生防菌剂。一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：活化：将光合细菌菌株的保存种按平板培养法进行培养，培养至褐红色单菌落出现；种子培养：将褐红色单菌落接入至光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；生产培养：菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种至光合细菌生产培养基，进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂，如图2所示。活化时，将荚膜红细菌A18菌株的保存种按平板培养法进行培养，培养至褐红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：蛋白胨5gL、葡萄糖1gL、YE2.5gL、NH42SO41.8gL、Na2CO31.0gL、K2HPO40.4gL、MgSO40.5gL，琼脂粉18gL，pH＝7.0。种子培养阶段，红色单菌落可接入至血清瓶中，以光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液。生产培养阶段，可将种子培养后得到的菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种到生产瓶中，以光合细菌生产培养基进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂。进一步地，种子步骤培养的温度为28℃～32℃，光照条件为6000Lx～8000Lx，pH为7.0。进一步地，生产培养的温度为28℃～32℃，光照条件为6000Lx～8000Lx，pH为7.0。种子培养步骤和生产培养阶段中的pH值可加入0.01M摩尔浓度的磷酸缓冲液进行调节和保持。进一步地，光合细菌液体培养基配方和光合细菌生产培养基配方均为蛋白胨5gL、葡萄糖1gL、YE2.5gL、NH42SO41.8gL、Na2CO31.0gL、K2HPO40.4gL、MgSO40.5gL，pH＝7.0。由于培养过程中要加入磷酸缓冲液，因此，培养基最终的K2HPO4浓度会有所变化，以根据实际情况将PH值调到7时的用量为准。一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防发酵液，光合细菌生防发酵液为上述的光合细菌生防菌剂分离的上清液或上述制备方法的制得的光合细菌生防菌剂分离的上清液。进一步地，分离方法为离心，离心的转速为6000～8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为10～15min。一种上述光合细菌生防菌剂或上述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，光合细菌生防菌剂应用于拮抗柑橘溃疡病菌或防控柑桔溃疡病。1本发明的光合细菌荚膜红细菌A18的生产工艺简单、培养时间短、成本低，且该菌株可通过简单、快捷、低成本的操作方法制备得到柑桔溃疡病防控的生防菌剂及生防发酵液；2本发明的光合细菌荚膜红细菌A18制得的生防菌剂及生防发酵液具有环境友好、对人畜无毒、对作物无药害、施用简单方便等特点，且不易使病虫害产生耐药性；3本发明的光合细菌荚膜红细菌A18制得的生防菌剂及生防发酵液既可以防治柑桔溃疡病害又能促进猕猴桃生长。实施例1：一株光合细菌菌株，其名称为荚膜红细菌A18菌株。主要生物学特征有：双层固体平板培养基上培养2d～4d，形成褐红色的圆形菌落，菌落边缘整齐光滑、菌落直径0.2mm～0.60mm；液体培养基中培养4d呈褐红色；在好氧条件下生长良好；生理化特性为V-P反应与甲基红反应阴性、H2S反应、明胶液化、脲酶试验、吲哚试验均阳性，最适生长温度28℃～32℃，pH＝7.0。实施例2：一种光合细菌生防菌剂，采用实施例1的荚膜红细菌A18为原料，通过经活化、种子培养、生产培养制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：一种光合细菌生防菌剂，采用实施例1的荚膜红细菌A18菌株为原料，通过经活化、种子培养、生产培养制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：1活化：将荚膜红细菌A18菌株的保存种按双层平板培养法进行培养，培养至红色单菌落出现；采用的培养基为光合细菌固体培养基，配方为：蛋白胨5gL、葡萄糖1gL、YE2.5gL、NH42SO41.8gL、Na2CO31.0gL、K2HPO40.4gL、MgSO40.5gL、琼脂粉18gL，pH＝7.0。2种子培养：将步骤1培养出的褐红色单菌落接入至120mL血清瓶中，在温度为28℃～32℃、光照条件为6000Lx～8000Lx、pH＝7.0条件下，用光合细菌液体培养基培养至对数生长期得到菌液。光合细菌液体培养基的配方为蛋白胨5gL、葡萄糖1gL、YE2.5gL、NH42SO41.8gL、Na2CO31.0gL、K2HPO40.4gL、MgSO40.5gL，pH＝7.0。3生产培养：将步骤2种子培养后得到的菌液接种到生产瓶中，用光合细菌生产培养基培养基成分与上述光合细菌液体培养基一致进行生产培养，菌液的接种量为所述光合细菌菌株生产培养基总体积的5％，在温度为28℃～32℃、光照条件为6000Lx～8000Lx、pH＝7.0条件下，培养至对数生长期即制得生防菌剂。实施例3：一种光合细菌生防发酵液，采用实施例1的光合细菌荚膜红细菌A18菌株为原料，经活化、种子培养、生产培养、离心制备得到，其具体制备方法包括以下步骤：取实施例2中获得的生防菌剂，经发酵培养6d，发酵培养在温度为28-32℃、光照条件为6000Lx-8000Lx条件下进行，发酵培养基成分与上述的光合细菌液体培养基成分相同，然后在6000～8000rpm条件下离心10min-15min，离心收集上清液，将上清液用细菌过滤器过滤，得到无类球红细菌菌体的上清液即为生防发酵液，4℃保存备用。实施例4：柑桔溃疡病菌拮抗效果定试验柑桔溃疡病菌拮抗效果定试验：将培养的新鲜溃疡病菌悬浮液稀释到菌体含量为1×109cfuml，荚膜红细菌A18悬浮液也稀释为1×109cfuml。将有新梢的18株柑桔按新梢叶片分为3组，每组设置3个重复。每组叶片数基本相等。设置三个处理：Ⅰ.同时接种柑桔溃疡病菌和荚膜红细菌A18菌；Ⅱ.只接种柑桔溃疡病菌；Ⅲ.只接种0.85％NaCl，作为对照。接种后，保湿5天，第25天调查记录各叶的病斑数，并计算各组叶片的发病率，数据详见与表1。柑桔溃疡病病情分级标准：0级，0个病斑；1，1-5个病斑；2级，6-10个病斑；3级，11-20个病斑；4级，21个以上病斑。发病情况见于图1。表1.荚膜红细菌A18对于柑桔溃疡病菌拮抗防效接种方式接种叶数病叶数1级2级3级4级发病率％Ⅰ-1100131300013Ⅰ-2100990009Ⅰ-3100121200012Ⅱ-110087541316487Ⅱ-210079521114279Ⅱ-310083511514383Ⅲ-1100440004Ⅲ-2100660006Ⅲ-3100770007根据表1和图1结果显示，只接种柑桔溃疡病菌的叶片发病率高达83.6％，而同时接种荚膜红细菌A18的叶片发病率降为了11.9％。只接种0.85％NaCl的发病率仅为4.4％，接种荚膜红细菌A18处理的发病率显著低于只接种柑桔溃疡病处理的发病率，说明荚膜红细菌A18对于柑桔溃疡病具有显著防治效果。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表湖南省植物保护研究所光合细菌菌株、生防菌剂、生防发酵液及制备方法和应用1SIPOSequenceListing1.011000DNA荚膜红细菌A18RhodobactercapsulatusA181cggggcggcagactacacatgcagtcgagcgagaccttcgggtctagcggcggacgggtg60agtaacgcgtgggaacgtgccctttgctacggaatagccccgggaaactgggagtaatac120cgtatgtgcccttcgggggaaagatttatcggcaaaggatcggcccgcgttggattaggt180agttggtggggtaatggcctaccaagccgacgatccatagctggtttgagaggatgatca240gccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatctta300gacaatgggggaaaccctgatctagccatgccgcgtgagcgatgaaggccttagggttgt360aaagctctttcaggtgggaagataatgacggtaccaccagaagaagccccggctaactcc420gtgccagcagccgcggtaatacggagggggctagcgttgttcggaattactgggcgtaaa480gcgcacgtaggcggatcagaaagtcagaggtgaaatcccagggctcaaccttggaactgc540ctttgaaactcctggtcttgaggtcgagagaggtgagtggaattccgagtgtagaggtga600gattcgtagatattcggaggaacaccagtggcgaaggcggctcactggctcgatactgac660gctgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgta720cacgatgaatgccagtcgtcggcaggcatgcctgtcggtgacacacctaacggattaagc780attccgcctggggagtacggtcgcaagattataactcaaaggaattgacgggggcccgca840caagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgcagaaccttaccaacccttgac900atcgggatcgcggttaccggagacggtttccttcagttcggctggatcacagacaggtgc960tgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttcggtt1000

权利要求：1.一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌菌株，其特征在于，所述光合细菌菌株为荚膜红细菌A18，保藏编号CCTCCNO:M2019292，于2019年4月25日保藏于中国典型培养物保藏中心。2.一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂，其特征在于，所述光合细菌生防菌剂由权利要求1所述的光合细菌菌株经活化、培养制备得到。3.一种如权利要求2所述的用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：活化：将光合细菌菌株荚膜红细菌A18的保存种按平板培养法进行培养，培养至褐红色单菌落出现；种子培养：将所述褐红色单菌落接入至光合细菌液体培养基进行种子培养至对数生长期得到菌液；生产培养：所述菌液按光合细菌菌株总体积5％的接种量接种至光合细菌生产培养基，进行生产培养至对数生长期即制得光合细菌生防菌剂。4.根据权利要求3所述的用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述步骤种子培养的温度为28℃～32℃，光照条件为6000Lx～8000Lx，pH为7.0。5.根据权利要求3所述的用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述生产培养的温度为28℃～32℃，光照条件为6000Lx～8000Lx，pH为7.0。6.根据权利要求3～5中任一项所述的用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防菌剂的制备方法，其特征在于，所述光合细菌液体培养基配方和所述光合细菌生产培养基配方均为：蛋白胨5gL、葡萄糖1gL、YE2.5gL、NH42SO41.8gL、Na2CO31.0gL、K2HPO40.4gL、MgSO40.5gL，pH＝7.0。7.一种用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防发酵液，其特征在于，所述光合细菌生防发酵液为权利要求2所述的光合细菌生防菌剂分离的上清液或权利要求4～6中任一项制备方法制得的光合细菌生防菌剂分离的上清液。8.根据权利要求7所述的用于柑桔溃疡病防治的光合细菌生防发酵液，其特征在于，所述分离方法为离心，所述离心的转速为6000～8000rpm，离心温度为4℃，离心时间为10～15min。9.一种权利要求2所述的光合细菌生防菌剂或权利要求4-6中任一所述制备方法制得的光合细菌生防菌剂的应用，其特征在于，所述光合细菌生防菌剂应用于防控柑桔溃疡病。

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