申请/专利权人：北京华大通瀛科技有限公司

申请日：2016-11-07

公开（公告）日：2020-10-16

公开（公告）号：CN108085375B

主分类号：C12Q1/6858(20180101)

分类号：C12Q1/6858(20180101);C12Q1/6883(20180101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.16#授权;2018.06.22#实质审查的生效;2018.05.29#公开

摘要：本发明公开了一种检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，所述方法在相同的反应体系中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；然后根据样本用针对野生型模板的增强型ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和针对突变型模板的增强型ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型以及Ct突变型与Ct野生型之间差值△Ct值，来判断多态性位点的型别从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。本发明的方法操作简单和准确性高。

主权项：1.ARMS引物在制备试剂盒中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型，其中，所述角膜营养不良多态性位点是TGFBI基因R555W1824CT点突变、TGFBI基因R555Q1825GA点突变、TGFBI基因R124H532GA点突变、TGFBI基因R124L532GT点突变或TGFBI基因R124S531CA、R124C531CT点突变中的一个或多个；用于检测TGFBI基因R555W点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACSEQIDNO:4、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATSEQIDNO:5，和共用下游引物为CTAGCAAAGGATGAGGCCAACCSEQIDNO:6；和检测其的探针为CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTTSEQIDNO:7；用于检测TGFBI基因R124H点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDNO:8、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDNO:9，和共用下游引物为CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCSEQIDNO:10；和检测其的探针为GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTSEQIDNO:11；用于检测TGFBI基因R124L点突变的野生型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDNO:12、突变型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCTSEQIDNO:13，和共用上游引物为CACCTGTAGATGTACCGTGCTCSEQIDNO:14；和检测其的探针为AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGASEQIDNO:15；用于检测TGFBI基因R555Q点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACGSEQIDNO:16、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATASEQIDNO:17，和共用下游引物为CAAAGGATGAGGCCAACCCGATSEQIDNO:18；用于检测TGFBI基因R124C点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDNO:20、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDNO:21，和共用上游引物为GTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTASEQIDNO:22；和检测其的探针为CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTSEQIDNO:23；和用于检测TGFBI基因R124S点突变的野生型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDNO:24、突变型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCASEQIDNO:25，和共用上游引物为TTGGGCTTTCCCACATGCCTCCTCSEQIDNO:26；和检测其的探针为TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGTSEQIDNO:27。

全文数据：检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法及其试剂盒技术领域[0001]本发明涉及基因检测领域，特别涉及检测角膜营养不良基因突变的基因型的方法及其试剂盒。背景技术[0002]角膜营养不良是一组原发性、遗传性、双眼具有病理组织特征改变的疾病，其共同特点为在角膜组织中形成形态各异的沉淀物。目前报道与角膜营养不良相关的基因有多种，其中TGFBI基因是首个被发现且最为常见的相关基因，为常染色体显性遗传。在中国人群中，R555和R124为该基因上的突变热点，占所有突变的80%以上。[0003]根据临床症状可将TGFBI基因突变引起的角膜营养不良分为3大类:1格子状角膜营养不良（LCD，包括：LCDI、LCDIIIIIIA、LCDIV和非典型LCD;2颗粒状角膜营养不良GCD，包括:GCDI、GCDII也称Avellino角膜营养不良，ACD、GCDIII也称Reis-Bucker角膜营养不良，RBCD和非典型GCD;3蜂窝状营养不良，也称Thiel-Behnke角膜营养不良TBCD。其中，在中国人群中，R555W和R124H突变分别与GCDI和G⑶IIACD表型具有明显相关性。[0004]有研究报道，角膜营养不良（GCD的患者进行激光视力矫正术或角膜表面的微小伤痕等刺激可导致病情迅速恶化，视力在1〜3年后出现下降，甚至导致失明，尤其是GCDIIACD型患者。目前在韩国，已经禁止对A⑶型患者进行激光类视力矫正术。至于激光视力矫正术是否会使其它两种类型的角膜营养不良患者病情恶化目前尚无准确报道。[0005]部分角膜营养不良患者为杂合型突变，其症状不是很明显，常规检查很难发现角膜营养不良，如果这类患者经过近视激光手术之后将可能出现角膜混浊、视力下降等症状，而且目前没有有效的治疗方法。因此有必要通过基因检测确定被检者DNA中与角膜营养不良症相关的易感基因是否发生突变，从而对角膜营养不良症的临床诊断提供依据。基因检测比传统检查拥有更高的准确性和更远的前瞻性，可有效预防角膜营养不良症患者在进行激光视力矫正术后出现角膜混浊症状急速恶化的后果。[0006]用于检测基因多态性的方法很多，包括如DNA直接测序，限制性片段长度多态性restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP，扩增阻碍突变系统amplificationrefractorymutationsystem，ARMS等，其中DNA直接测序为突变检测的金标准，但因其所需时间长，费用高，对取材要求严格，所以临床应用受到很大限制。限制性片段长度多态性仅适用于突变位点附近存在适当的特定限制性内切酶识别序列的情况，应用局限性较大。[0007]扩增阻碍突变系统是验证性检测DNA序列变化的常用经典方法之一。ARMS-PCR基因分型检测通常包括两个互补的PCR反应，使用相同的DNA模板和一条相同的共有引物和反应条件，区别仅在于与共有引物配对的ARMS引物不同，野生型ARMS引物3'末端与野生型模板匹配，突变型ARMS引物3'末端与突变型模板匹配，使两个反应选择性扩增特定的DNA模板，g卩3'末端不匹配引物的延伸受到阻碍，通常还在3'末端2-4个碱基设置一个错配碱基，以提高错配引物的选择扩增性。但由于人基因组DNA分子模板浓度一般较高，导致ARMS引物经选择性扩增后背景仍然很高，而且对于特定序列，ARMS引物不足以形成较明显的扩增差异，不利于结果判断。发明内容[0008]为了解决角膜营养不良基因多态性的检测，本发明提供检测角膜营养不良基因突变的基因型的方法及其试剂盒。[0009]本发明整合了ARMS-PCR技术和荧光定量PCR技术。本发明的特征在于，在相同反应体系（例如，包括样本DNA、R0X、TaqMan探针、dNTP、聚合酶及缓冲液等）中，分别使用本发明的针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物以及与所述增强型ARMS引物对应的共用上游或下游引物，用两个反应管对同一份待测样本进行检测，通过CT值和ACT值的大小判定样本基因型。[0010]本发明依据传统ARMS-PCR技术的原理，进行了增加增强型ARMS引物3'端和中间区域的错配碱基数，使得针对野生型模板的增强型增强型ARMS引物对突变型样本不扩增或扩增效率很低，并且针对突变型模板的增强型ARMS引物对野生型样本不扩增或扩增效率很低，这样大大降低背景信号，使得结果更易于判断。[0011]在一种实施方式中，本发明提供一种检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，它包括以下步骤：[0012]步骤1:在相同的反应体系中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；[0013]针对所述野生型模板的增强型ARMS引物的3'末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位设置一个或多个错配碱基；[0014]针对所述突变型模板的增强型ARMS引物的3'末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位设置一个或多个错配碱基；[0015]所述野生型模板的增强型ARMS引物和所述突变型模板的增强型ARMS引物共用上游或下游引物，所述共用上游或下游引物分别与所述针对野生型模板的增强型ARMS引物或所述针对突变型模板的增强型ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列;和[0016]步骤2:根据样本用针对野生型模板的增强型ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和针对突变型模板的增强型ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型以及Ct突变型与Ct野生型之间差值ACt值，来判断多态性位点的型别从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。[0017]在一种实施方式中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测时，加入内参，根据内参的扩增信号有无和内参荧光定量PCR检测的Ct内参值，用于确定待测样本的扩增是否正常以及待测样本的基因型的判断。[0018]在一种实施方式中，若内参引物无扩增信号，需要重新提取样本或重新取样后进行检测;若内参有扩增信号且3034,则该样本检测结果异常，对该位点进行测序分析。[0026]在一种实施方式中，内参为β-actin;实时荧光定量PCR中用于扩增内参的上游引物AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1，下游引物为CCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDNO:2;和检测其的探针为TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDNO:3。[0027]在一种实施方式中，针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同；优选地，除了突变位点处的碱基以外，所述针对野生型模板的增强型ARMS引物和所述针对突变型模板的增强型ARMS引物完全相同。[0028]在一种实施方式中，角膜营养不良多态性位点是TGFBI基因R555W18240T点突变、TGFBI基因R555Q1825GA点突变、TGFBI基因R124H532GA点突变、TGFBI基因R124L532GT点突变或TGFBI基因R124S531CA、R124C531CT点突变中的一个或多个。[0029]在一种实施方式中，检测TGFBI基因R555W点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACSEQIDN0:4、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATSEQIDN0:5，和共用下游引物为CTAGCAAAGGATGAGGCCAACCSEQIDN0:6;和检测其的探针为CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTTSEQIDN0:7;[0030]检测TGFBI基因R124H点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDN0:8、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDN0:9，和共用下游引物为CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCSEQIDN0:10;和检测其的探针为GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTSEQIDNO:11；[0031]检测TGFBI基因R124L点突变的野生型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDN0:12、突变型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCTSEQIDN0:13，和共用上游引物为CACCTGTAGATGTACCGTGCTCSEQIDN0:14;和检测其的探针为AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGASEQIDNO:15；[0032]检测TGFBI基因R555Q点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACGSEQIDN0:16、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATASEQIDN0:17，和共用下游引物为CAAAGGATGAGGCCAACCCGATSEQIDN0:18;[0033]检测TGFBI基因R124C点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDN0:20、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDN0:21，和共用上游引物为GTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTASEQIDN0:22;和检测其的探针为CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTSEQIDN0:23jP[0034]检测TGFBI基因R124S点突变的野生型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDN0:24、突变型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCASEQIDN0:25，和共用上游引物为TTGGGCTTTCCCACATGCCTCCTCSEQIDN0:26;和检测其的探针为TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGTSEQIDN0:27。[0035]在一种实施方式中，本发明提供在上述方法中使用的试剂盒。[0036]在一种实施方式中，试剂盒进一步包括:ROX校正液、dNTP、聚合酶及缓冲液。[0037]与现有基因多态性检测方法相比，本发明的基于增强型ARMS荧光定量PCR检测基因多态性的试剂盒及方法不仅特异性强，敏感性高，成本低，结果高度可靠，背景低，结果易于判断，而且在操作和使用上还具有独特优势，荧光定量PCR检测快捷方便，全程闭管检测，降低污染，减少了不必要的费用和工作量。特别是荧光定量PCR可以用CT值来表征扩增效率，因此这个方法可以检测角膜营养不良样本纯合野生型、纯合突变型和杂合子基因型情况，使得结果判断可以准确可靠。附图说明[0038]为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。[0039]图1为实施例1中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；[0040]图2为R555W野生型样本分别在野生型反应液A和突变型反应液⑻中的荧光扩增曲线图；[0041]图3为实施例1使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R555W野生型测序的原始峰图；[0042]图4为实施例2中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；[0043]图5R124H杂合样本分别在野生型反应液㈧和突变型反应液⑻中的荧光扩增曲线；[0044]图6为实施例2使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124H杂合突变型测序的原始峰图；[0045]图7为实施例3中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；[0046]图8为R124L野生型样本分别在野生型反应液㈧和突变型反应液⑻的荧光扩增曲线；[0047]图9为实施例3使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124L野生型测序的原始峰图；[0048]图10为实施例4中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；[0049]图11为R555Q野生型样本分别在野生型反应液㈧和突变型反应液⑻的荧光扩增曲线；[0050]图12为实施例4使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R555Q野生型测序的原始峰图；[0051]图13为实施例5中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；[0052]图14为R124C野生型样本分别在野生型反应液㈧和突变型反应液⑻的荧光扩增曲线；[0053]图15为实施例5使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124C野生型测序的原始峰图；[0054]图16为实施例6中内参β-actin基因的荧光扩增曲线图；[0055]图17为R124S野生型样本分别在野生型反应液㈧和突变型反应液⑻的荧光扩增曲线;和[0056]图18为实施例6使用Sanger测序法对角膜营养不良样本的TGFBI基因R124S野生型测序的原始峰图。具体实施方式[0057]为了使本领域技术领域人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合下面结合实施例对本发明作进一步说明，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。[0058]下述实施例中，如无特殊说明，均为本领域常规方法。以下实施例中，PCR缓冲液、dNTP均随DNA聚合酶，ROX校正液购于宝生物工程大连有限公司，所用引物及探针均由上海生物工程技术服务有限公司合成，血液基因组DNA提取试剂盒购自北京天根生物科技有限公司。在下列实施例中均使用血液基因组DNA提取试剂盒制备样本DNA。[0059]实施例1角膜营养不良相关的TGFBI基因R555W点突变基因型的检测[0060]本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。[0061]本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。[0062]1β-actin引物设计[0063]实验设计了β-actin基因上下游引物，相关参数为：Tm值55.0°C—60.0°C，GC值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕？。引物序列如下：[0064]上游引物：β-actin-FAGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1[0065]下游引物：β-actin-RCCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDN0:2[0066]2β-actin探针设计[0067]设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：[0068]β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDN0:3[0069]3增强型ARMS引物设计[0070]实验设计了野生型增强型ARMS引物（SEQIDN0:4、突变型增强型ARMS引物（SEQIDN0:5，共用下游引物为R555W-RSEQIDN0:3，相关参数为：Tm值55.0°C—60.0°C，GC值40.0%—60.0%，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：[0071]增强型上游增强型ARMS引物：[0072]R555W-WFAGCCCTGCCACCAAGAGGACSEQIDNO:4[0073]R555W-MFAGCCCTGCCACCAAGAGTATSEQIDNO:5[0074]共用下游引物R555W-R:CTAGCAAAGGATGAGGCCAACCSEQIDN0:6[0075]4探针设计[0076]在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：[0077]R555W-P探针：CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTTSEQIDN0:7[0078]5ARMS荧光定量PCR扩增反应[0079][0080]PCR反应程序为：50°C2分钟、95°C5分钟；40个循环:95°C15秒，60°C45秒（收集荧光）。所用仪器为ABIsteponeplus、SLAN〇[0081]6实验结果[0082]平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25,说明样品合格，试验结果如图1所示。[0083]图2中角膜营养不良待检样本R555W野生型）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25;在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.15,ACt值=Ct突变型-Ct野生型=10.15，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。[0084]图3中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本R555W野生型）测序，原始峰图的结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R555W野生型。[0085]实施例2角膜营养不良相关的TGFBI基因R124H点突变的基因型的检测[0086]本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。[0087]本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。[0088]Iβ-actin引物设计[0089]实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0°C—60.0°C，GC值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕？。引物序列如下：[0090]上游引物：β-actin-FAGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1[0091]下游引物：β-actin-RCCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDN0:2[0092]2f3_actin探针设计[0093]设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：[0094]β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDN0:3[0095]3增强型ARMS引物设计[0096]实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124H-F，相关参数为：Tm值55.0°：—60.0°：，6：值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕口。增强型ARMS引物序列如下：[0097]下游增强型ARMS引物：[0098]R124H-WRAGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDNO:8[0099]R124H-MRAGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDNO:9[0100]共用上游引物R124H-F:CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCSEQIDN0:10[0101]4探针设计[0102]在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：[0103]R124H-P探针：GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTSEQIDN0:11[0104]5ARMS荧光定量PCR扩增反应[0105][0106][0107]PCR反应程序为：50°C2分钟、95°C5分钟；40个循环：95°C15秒，60°C45秒（收集荧光）。所用仪器为ABIsteponeplus、SLAN〇[0108]6实验结果[0109]平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25.5，说明样品合格，试验结果如图4所示。[0110]图5中角膜营养不良待检样本R124H野生型）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.8;在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为25.9,ACt值=Ct突变型-Ct野生型=0.1，根据判定标准，该样本为杂合样本。[0111]图6中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本R124H杂合型）测序，原始峰图结果显示为碱基AG，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124H杂合型。[0112]实施例3角膜营养不良相关的TGFBI基因R124L点突变基因型的检测[0113]本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。[0114]本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。[0115]1β-actin引物设计[0116]实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0°：—60.0°：，6：值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕？。引物序列如下：[0117]上游引物：β-actin-FAGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1[0118]下游引物:β-actin-RCCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDN0:2[0119]2β-actin探针设计[0120]设计探针，相关参数为:Tm值68.TC—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：[0121]β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDN0:3[0122]3增强型ARMS引物设计[0123]实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124L-F，相关参数为：Tm值55.0°：—60.0°：，6：值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕口。增强型ARMS引物序列如下：[0124]下游增强型ARMS引物：[0125]R124L-WRTCAGCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDNO:12[0126]R124L-MRTCAGCTCAGCTTCTCCATGCTSEQIDNO:13[0127]共用上游引物R124L-F:CACCTGTAGATGTACCGTGCTCSEQIDN0:14[0128]4探针设计[0129]在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：[0130]R124L-P探针：AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGASEQIDN0:15[0131]5ARMS荧光定量PCR扩增反应[0132][0133]PCR反应程序为：50°C2分钟、95°C5分钟；40个循环:95°C15秒，60°C45秒（收集荧光）。所用仪器为ABIsteponeplus、SLAN〇[0134]6实验结果[0135]平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25.5,说明样品合格，试验结果如图7所示。[0136]图8中角膜营养不良待检样本（R124L野生型在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.1;在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.9，ACt值=Ct突变型-Ct野生型=10.8，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。[0137]图9中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本R124L野生型）测序，原始峰图结果显示为碱基G，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124L野生型。[0138]实施例4角膜营养不良相关的TGFBI基因R555Q点突变的基因型的检测[0139]本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。[0140]本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。[0141]1β-actin引物设计[0142]实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0°C—60.0°C，GC值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕？。引物序列如下：[0143]上游引物：β-actin-FAGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1[0144]下游引物:β-actin-RCCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDN0:2[0145]2f3_actin探针设计[0146]设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：[0147]β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDN0:3[0148]3增强型ARMS引物设计[0149]实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用下游引物为R555W-R，相关参数为：Tm值55·0°C—60.0°C，GC值40.0%—60·0%，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：[0150]增强型上游增强型ARMS引物：[0151]R555Q-WFAGCCCTGCCACCAAGAGGACGSEQIDNO:16[0152]R555Q-MFAGCCCTGCCACCAAGAGTATASEQIDNO:17[0153]共用下游引物R555W-R:CAAAGGATGAGGCCAACCCGATSEQIDN0:18[0154]4探针设计[0155]在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C-70.TC，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：[0156]R555Q-P探针：TAAAGTAGTGATCCCTCAGGGCCCCAGCASEQIDN0:19[0157]5ARMS荧光定量PCR扩增反应[0158][0159]PCR反应程序为：50°C2分钟、95°C5分钟；40个循环:95°C15秒，60°C45秒（收集荧光）。所用仪器为ABIsteponeplus、SLAN〇[0160]6实验结果[0161]平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在24.4,说明样品合格，试验结果如图10所示。[0162]图11中角膜营养不良待检样本（R555Q野生型）在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为24.3;在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.9，ACt值=Ct突变型-Ct野生型=11.6，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。[0163]图12中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本R555Q野生型）测序，原始峰图显示为碱基G，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R555Q野生型。[0164]实施例5角膜营养不良相关的TGFBI基因R124C点突变的基因型的检测[0165]本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。[0166]本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。[0167]1β-actin引物设计[0168]实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0°C—60.0°C，GC值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕？。引物序列如下：[0169]上游引物：β-actin-FAGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1[0170]下游引物:β-actin-RCCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDN0:2[0171]2β-actin探针设计[0172]设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：[0173]β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDN0:3[0174]3增强型ARMS引物设计[0175]实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124C-F，相关参数为：Tm值55.0°：—60.0°：，6：值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕口。增强型ARMS引物序列如下：[0176]下游增强型ARMS引物：[0177]R124C-WRAGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDNO:20[0178]R124C-MRAGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDNO:21[0179]共用上游引物R124C-F:GTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTASEQIDN0:22[0180]4探针设计[0181]在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：[0182]R124C-P探针：CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTSEQIDN0:23[0183]5ARMS荧光定量PCR扩增反应[0184][0185]PCR反应程序为：50°C2分钟、95°C5分钟；40个循环:95°C15秒，60°C45秒（收集荧光）。所用仪器为ABIsteponeplus、SLAN〇[0186]6实验结果[0187]平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在26.2，说明样品合格，试验结果如图13所示。[0188]图14中角膜营养不良待检样本（R124C野生型在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.8;在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，其Ct值为35.7，ACt值=Ct突变型-Ct野生型=9.9，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。[0189]图15中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本R124C野生型）测序，原始峰图的结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124C野生型。[0190]实施例6角膜营养不良相关的TGFBI基因R124S点突变的基因型的检测[0191]本发明设计内参β-actin的引物，在实时荧光定量PCR中评价提取样本的扩增是否正常，使得结果更易于判断。[0192]本发明采用增强型ARMS引物，在实时荧光定量PCR中降低野生型增强型ARMS引物对突变型样本的扩增效率和突变型增强型ARMS引物对野生型样本的扩增效率，使得结果更易于判断。[0193]1β-actin引物设计[0194]实验设计了β-actin基因上下引物，相关参数为：Tm值55.0°C—60.0°C，GC值40.0%—60.0%，引物大小20±3匕？。引物序列如下：[0195]上游引物：β-actin-FAGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1[0196]下游引物:β-actin-RCCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDN0:2[0197]2β-actin探针设计[0198]设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端HEX标记，其序列如下：[0199]β-actin-P探针：TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDN0:3[0200]3增强型ARMS引物设计[0201]实验设计了野生型增强型ARMS引物、突变型增强型ARMS引物，共用上游引物为R124S-F，相关参数为:Tm值55.0°C—60.0°C，GC值40.0%—60.0%，引物大小20±3bp。增强型ARMS引物序列如下：[0202]下游增强型ARMS引物：[0203]R124S-WRGCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDNO:24[0204]R124S-MRGCTCAGCTTCTCCATGCASEQIDNO:25[0205]共用上游引物R124S-F:TTGGGCTTTCCCACATGCCTCCTCSEQIDN0:26[0206]4探针设计[0207]在增强型ARMS引物扩增片段内设计探针，相关参数为:Tm值68.0°C—70.0°C，GC值40.0%—70.0%，对探针进行5’端FAM标记，其序列如下：[0208]R124S-P探针：TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGTSEQIDN0:27[0209]5ARMS荧光定量PCR扩增反应[0210][0211]PCR反应程序为：50°C2分钟、95°C5分钟；40个循环：95°C3秒，60°C45秒（收集荧光）。所用仪器为ABIsteponeplus、SLAN〇[0212]6实验结果：[0213]平行扩增的荧光定量PCR反应中，阴性对照无扩增，说明反应体系正常，无污染。内参反应液中的Ct值在25.8,说明样品合格，试验结果如图16所示。[0214]图17中角膜营养不良待检样本（R124C野生型在野生型反应液中的荧光扩增曲线为A，其Ct值为25.6;在突变型反应液中的荧光扩增曲线为B，没有CT值，我们认为没有扩增，CT值默认为40，ACt值=Ct突变型-Ct野生型=14.4，根据判定标准，该样本为纯合野生型样本。[0215]图18中使用Sanger测序法对角膜营养不良样本R124S野生型）测序，原始峰图的结果显示为碱基C，说明荧光检测结果与测序结果完全一致，均为R124S野生型。[0216]应该理解到披露的本发明不仅仅限于描述的特定的方法、方案和物质，因为这些均可变化。还应理解这里所用的术语仅仅是为了描述特定的实施方式方案的目的，而不是意欲限制本发明的范围，本发明的范围仅受限于所附的权利要求。[0217]本领域的技术人员还将认识到，或者能够确认使用不超过常规实验，在本文中所述的本发明的具体的实施方案的许多等价物。这些等价物也包含在所附的权利要求中。

权利要求：1.检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，其包括以下步骤：步骤1:在相同的反应体系中，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测；针对所述野生型模板的增强型ARMS引物的3'末端终止在待测位点处并且与野生型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位设置一个或多个错配碱基；针对所述突变型模板的增强型ARMS引物的3'末端终止在待测位点处并且与突变型序列匹配，其中，在所述引物的3'末端第2-4位设置一个或多个错配碱基；所述野生型模板的增强型ARMS引物和所述突变型模板的增强型ARMS引物共用上游或下游引物，所述共用上游或下游引物分别与所述针对野生型模板的增强型ARMS引物或所述针对突变型模板的增强型ARMS引物一起扩增一段包含待测基因突变位点的序列;和步骤2:根据样本用针对野生型模板的增强型ARMS引物进行荧光定量PCR检测的Ct野生型和针对突变型模板的增强型ARMS引物进行ARMS荧光定量PCR检测的Ct突变型以及Ct突变型与Ct野生型之间差值ACt值，来判断多态性位点的型别从而确定角膜营养不良基因突变的基因型。2.根据权利要求1的所述检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，使用针对角膜营养不良多态性位点的基因野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物分别对同一份待测样本进行实时荧光定量PCR检测时，加入内参，根据内参的扩增信号有无和内参荧光定量PCR检测的Ct内参值，用于确定待测样本的扩增是否正常以及待测样本的基因型的判断。3.根据权利要求2的所述检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法：3.1.若内参引物无扩增信号，需要重新提取样本或重新取样后进行检测；3.2.若内参有扩增信号且3034,则该样本检测结果异常，对该位点进行测序分析。4.根据权利要求2的所述检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，所述内参为β-actin;实时荧光定量PCR中用于扩增内参的上游引物AGTGGCTTCCCCAGTGTGACATGSEQIDN0:1，下游引物为CCGTGGTGGTGAAGCTGTASEQIDN0:2;和检测其的探针为TCGTGATGGACTCCGGTGACGGGGTCSEQIDN0:3〇5.根据权利要求1的所述检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，针对野生型模板的增强型ARMS引物和针对突变型模板的增强型ARMS引物中，引入错配碱基的位置和类型相同；优选地，除了突变位点处的碱基以外，所述针对野生型模板的增强型ARMS引物和所述针对突变型模板的增强型ARMS引物完全相同。6.根据权利要求1的所述检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法，所述角膜营养不良多态性位点是TGFBI基因R555W18240T点突变、TGFBI基因R555Q1825GA点突变、TGFBI基因R124H532GA点突变、TGFBI基因R124L532GT点突变或TGFBI基因R124S531CA、R124C531CT点突变中的一个或多个。7.根据权利要求6的所述检测角膜营养不良基因多态性位点的基因型的方法：检测TGFBI基因R555W点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACSEQIDN0:4、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATSEQIDN0:5，和共用下游引物为CTAGCAAAGGATGAGGCCAACCSEQIDN0:6;和检测其的探针为CAAACAGTTGGCACATCAAGGATTGACTTSEQIDNO:7；检测TGFBI基因R124H点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDN0:8、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDN0:9，和共用下游引物为CCCAGAGGCCATCCCTCCTTCSEQIDNO:10;和检测其的探针为GGAGTCGTTGGATCCACCACCACTCAGCTSEQIDNO:11；检测TGFBI基因R124L点突变的野生型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDN0:12、突变型增强型ARMS引物是TCAGCTCAGCTTCTCCATGCTSEQIDN0:13，和共用上游引物为CACCTGTAGATGTACCGTGCTCSEQIDN0:14;和检测其的探针为AGGGTGTGGTTGGGCTGGACCCCCAGASEQIDNO:15；检测TGFBI基因R555Q点突变的野生型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGGACGSEQIDN0:16、突变型增强型ARMS引物是AGCCCTGCCACCAAGAGTATASEQIDN0:17，和共用下游引物为CAAAGGATGAGGCCAACCCGATSEQIDN0:18;检测TGFBI基因R124C点突变的野生型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCGSEQIDN0:20、突变型增强型ARMS引物是AGGCCTCACTTCTCCATGCASEQIDN0:21，和共用上游引物为GTCTTCTGCTCCTGCAGCCCTASEQIDN0:22;和检测其的探针为CTCTCAAACCTTTACGAGACCCTGGGAGTCGTSEQIDN0:23jP检测TGFBI基因R124S点突变的野生型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCGSEQIDN0:24、突变型增强型ARMS引物是GCTCAGCTTCTCCATGCASEQIDN0:25，和共用上游引物^TTGGGCTTTCCCACATGCCTCCTCSEQIDN0:26;和检测其的探针为TACCGTGCTCTCTGTCAGAGAAGGGAGGGTGTSEQIDN0:27。8.在权利要求1-7中任一种方法中使用的试剂盒。9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括:ROX校正液、dNTP、聚合酶及缓冲液。

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