申请/专利权人：迈博斯生物医药(苏州)有限公司

申请日：2017-02-10

公开（公告）日：2020-10-16

公开（公告）号：CN108779180B

主分类号：C07K16/28(20060101)

分类号：C07K16/28(20060101);C12N15/13(20060101);A61K39/395(20060101);A61P35/00(20060101)

优先权：["20160323 CN PCT/CN2016/077082"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.16#授权;2019.04.09#实质审查的生效;2018.11.09#公开

摘要：提供了一种分离的PD‑L1抗体，在相同的实验条件下，所述抗体在酸性pH下与PD‑L1的结合显著低于其在中性pH下与PD‑L1的结合，以及提供了一种分离的PD‑L1抗体，所述抗体与PD‑L1的结合不具有pH依赖性。还提供了所述抗体的药物组合物，所述抗体的编码多核苷酸、表达载体和分离的宿主细胞，以及包含所述PD‑L1抗体的试剂盒。本申请还提供了使用所述PD‑L1抗体治疗PD‑L1相关病况的方法。

主权项：1.一种分离的PD-L1抗体，所述抗体包含重链HCDR1、HCDR2和HCDR3以及轻链LCDR1、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDR1序列是TYWX1HSEQIDNO：1；所述HCDR2序列是MIQPNSGGTKYNX2X3FKX4SEQIDNO：2；所述HCDR3序列是GAGTVDYFDYSEQIDNO：3；所述LCDR1序列是RASESVDIYGNSFMHSEQIDNO：4；所述LCDR2序列是RASNLESSEQIDNO：5；所述LCDR3序列是X5QSX6X7DPYTSEQIDNO：6；其中X1是I；X2是D；X3是Q；X4是N；X5是Q；X6是N；X7是D；或其中X1是M；X2是E；X3是K；X4是K；X5是Q；X6是T；X7是E。

全文数据：新型抗-PD-L1抗体发明领域[0001]本公开内容总体上涉及与人ro-Ll特异性结合的新型抗-PD-Ll抗体。背景技术[0002]⑶28家族成员PD-I是一种在T细胞表面上表达的抑制性受体，其功能是在生理上限制T细胞活化和增殖。其配体PD-LlB7-H1CD274在抗原提呈细胞和肿瘤细胞上表达。I3D-Ll与其受体的结合抑制T细胞活化并抵消T细胞刺激性信号，如B7与CD28的结合。[0003]正常上皮组织不表达PD-Ll，然而其在多种人类癌症中异常表达。由此，PD-Ll可以通过使宿主抗肿瘤应答失效来促使癌症的发展。其在肿瘤细胞上的表达与肾细胞癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌、卵巢癌、尿路上皮癌、胃癌、食道癌和肝细胞癌的预后较差有关。[0004]已经产生了多种靶向ro-i的抗体，并且其在随机对照试验中在肿瘤生长和延长总体存活方面显示出有效性。已发现了几种靶向ro-Li的抗体，并且其显示出抑制肿瘤生长的活性。由于这些抗体被表达ro-Li的细胞内化并在内涵体和溶酶体小室中迅速降解，因此这些抗体被表达PD-Ll的细胞迅速消除，这些抗体抑制肿瘤生长的能力因而受到所递送抗体量的限制。对肿瘤生长的持续抑制需要连续输注大量抗体，以在肿瘤部位保持足以阻断ro-Ll活性的高抗体浓度。因此，提供这些药剂的成本预计将非常高，因为需要向患者注射大量抗体。更重要的是，实现完全应答的能力也将受到限制。因而，需要产生具有比现有抗-PD-Ll抗体更高药效的抗体。发明内容[0005]本公开内容提供了一种新的单克隆抗-PD-Ll抗体特别是嵌合的和人源化抗体），编码其的多核苷酸，使用其的方法及其在人ro-Ll蛋白上的结合表位。[0006]在某些实施方式中，本申请提供了一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体包含重链HCDRl、HCDR2和HCDR3以及轻链LCDRl、LCDR2和LCDR3序列，其中[0007]所述HCDRl序列是TYWXiHSEQIDN0:1或与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0008]所述HCDR2序列是MIQPNSGGTKYNX2X3FKX4SEQIDN0:2或与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0009]所述HCDR3序列是GAGTVDYFDYSEQIDN0:3或与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0010]所述LCDRl序列是RASESVDIYGNSFMHSEQIDN0:4或与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0011]所述LCDR2序列是RASNLESSEQIDNO:5或与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0012]所述LCDR3序列是X5QSX6X7DPYTSEQIDN0:6或与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列[0013]其中乂:是工或M;X2是D或E;X3是Q或K;X4是N或K;X5是Q或H;X6是N或T;X7是D或E。[0014]在某些实施方式中，乂:是〗或Μ;Χ2是D或Ε;Χ3是Q或K;X4是N或K;X5是Q;X6是N或T;X7是D或Ε。在某些实施方式中，Xi是I;Χ2是D;X3是Q;X4是Ν;Χδ是Q;X6是Ν;Χγ是D。在某些实施方式中，Xi是Μ;Χ2是Ε;Χ3是Κ;Χ4是Κ;Χ5是Q;X6是Τ;Χ7是Ε。在某些实施方式中，Xi是I;Χ2是D;X3是Q;X4是N;X5是H;X6是N;X7是D。在某些实施方式中，Xi是M;X2是E;X3是K;X4是K;X5是H;X6是T;X7是E。[0015]在某些实施方式中，本申请所述的ro-Ll抗体包含1、2、3、4、5或6个⑶R，所述⑶R选自SEQIDN0:7-12或与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列。在某些实施方式中，本申请所述的I3D-Ll抗体包含3个重链⑶R，所述重链⑶R选自SEQIDNO:7-9。在某些实施方式中，本申请所述的I3D-Ll抗体包含3个轻链⑶R，所述轻链⑶R选自SEQIDNO:10-12。在某些实施方式中，本申请所述的TO-Ll抗体包含6个⑶R，所述⑶R选自SEQIDNO:7-12。[0016]在某些实施方式中，本申请所述的PD-Ll抗体包含重链框架序列HFRl、HFR2、HFR3和HFR4以及轻链框架序列LFRl、LFR2、LFR3和LFR4，其中重链可变区的序列如下式所示：HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4,并且轻链可变区的序列如下式所示：LFRl-LCDRl-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。[0017]在某些实施方式中，其中所述HFRl序列是XaiVQLXa2QXa3GAEXa4Xa5KPGASVKXa6SCKASGYXa7FTSEQIDNO:13;[0018]所述HFR2序列是WVXa8QXa9PGQGLEWIGSEQIDNO:14;[0019]所述HFR3序列是XaioXaiiTLTVDXai2SXai3Xai4TAXai5MXai6LSXai7LXai8SXai9DXa2〇AVYYCARSEQIDN0：15；[0020]所述HFR4序列是WGQGXa2ITLXa22Xa23SSSEQIDNO:16;[0021]所述LFRl序列是DIVLTXa24SPXa25SLXa26VSXa27GQRATIXa28CSEQIDN0:17;[0022]所述LFR2序列是WYQQKPGQXa29PKLUYSEQIDNO:18;[0023]所述LFR3序列是GIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEAXa3。DXa3lATYYCSEQIDN0:19;[0024]所述LFR4序列是FGGGTKLEXa32KSEQIDNO:20;[0025]其中父1是〇或L;Xa2是Q或V;Xa3是S或P;Xa4是L或V;乂5是¥或K;Xa6是L或V;Xa7是T、S或I;Xa8是W、K或R;Xa9是R或A;Xa1Q是R或K;Xa11是V或A;父312是1或T;父313是5或I;Xaw是S或T;父15是¥或S;父16是〇或E;Xan是S、G或R;父318是1'或R;Xa19是E或D;Xa2Q是S或T;父321是1'或S;Xa22是S或T;Xa23是V或I;Xa24是Q或H;Xa25是A或V;Xa26是A或T;Xa27是L、A或V;Xa28是S或T;Xa29是S、P或A;Xa3Q是D、N或Q;乂31是¥或T;Xa32是L、T或I;Xa33是F或Y;Xa34是T或Q;乂335是¥或L;Xa36是D或S;Xa37是M或L;Xa38是T或S;Xa39是F或S;Xa4〇是D或Q;Xa4i是V或A;Xa42是V或I;Xa43是D或A;Xa44是T或S;Xa45是Y或S;Xa46是G或R;Xa47是F或L;Xa48是S或N;Xa49是T或P;Xa50是Q或E;Xa5i是V或T;Xa52是F或Y;Xa53是A或G。[0026]在某些实施方式中，Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xa5是K;Xa6是L;Xa7是I;Xa8是K;Xa9是R;Xaio是R或K;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是T或S;Xa22是T或S;Xa23是I或V;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是A或P;Xa3〇是Q;Xa3i是T;Xa32是T或I;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Xa^i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xas2是Y;Xas3是G。[0027]在某些实施方式中，Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是L;Xa7是I;Xa8是K;Xa9是R;Xaio是R;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是I;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是A;Xa3◦是Q;Xa3i是T;Xa32是T;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso；Xasi^T；Xa52^Y；Xa53^G〇[0028]在某些实施方式中，Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是L;Xa7是I;Xa8是K;Xa9是R;Xaio是K;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是S;Xa22是T;Xa23是V;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是P;Xa3◦是Q;Xa3i是T;Xa32是I;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso；Xasi^T；Xa52^Y；Xa53^G〇[0029]在某些实施方式中，Xai是L或Q;Xa2是V;Xa3是S是K;Xa6是L;Xa7是I;Xas是K;Xa9是R;Xaio是R;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是I;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是S;Xa3〇是N;Xa3i是T;Xa32是T;Xa33是Y;Xa34是0;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso；Xasi^T；Xa52^Y；Xa53^G〇[0030]在某些实施方式中，Xai是L;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是V;Xa7是I;Xa8是R;Xa9是A;Xaio是R;Xaii是V;Xai2是T;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是R;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是I;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是S;Xa3〇是N;Xa3i是T;Xa32是T;Xa33是Y;Xa34是0;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso；Xasi^T；Xa52^Y；Xa53^G〇[0031]在某些实施方式中，Xai是L;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是V;Xa7是I;Xa8是R;Xa9是A;Xaio是R;Xaii是V;Xai2是T;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是R;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是I;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是A;Xa3◦是Q或N;Xa3i是T;Xa32是T;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xas2是Y;Xas3是G。[0032]在某些实施方式中，Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是V;Xa7是I;Xa8是R;Xa9是A;Xaio是K;Xaii是A;Xai2是T;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是R;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是S;Xa22是T;Xa23是V;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是P;Xa3◦是N;Xa3i是T;Xa32是I;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xa52是Y;Xa53是G0[0033]在某些实施方式中，Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xa5是K;Xa6是V;Xa7是I;Xa8是R;Xag是A;Xaio是K;Xaii是A;Xai2是T;Xai3是I;Xai4是S;Xai5是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是R;Xaig是D;Xa2〇是T;Xa2i是S;Xa22是T;Xa23是V;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是P;Xa3〇是N或Q;Xa3i是T;Xa32是I;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xa52是Y;Xa53是G。[0034]在某些实施方式中，Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xa5是K;Xa6是L;Xa7是I;Xa8是K;Xag是R;Xaio是K;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xaig是D;Xa2〇是T;Xa2i是S;Xa22是T;Xa23是V;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是P;Xa3〇是N;Xa3i是T;Xa32是I;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xa52是Y;Xa53是G0[0035]在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:61中所示的重链可变区和如SEQIDNO:62中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:71中所示的重链可变区和如SEQIDN0:72中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述I3D-Ll抗体包含如SEQIDNO:71中所示的重链可变区和如SEQIDNO:70中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:69中所示的重链可变区和如SEQIDNO:72中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述I3D-Ll抗体包含如SEQIDNO:69中所示的重链可变区和如SEQIDNO:70中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:73中所示的重链可变区和如SEQIDN0:74中所示的轻链可变区。[0036]在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:63中所示的重链可变区和如SEQIDNO:64中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:75中所示的重链可变区和如SEQIDN0:76中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述I3D-Ll抗体包含如SEQIDNO:77中所示的重链可变区和如SEQIDNO:78中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:75中所示的重链可变区和如SEQIDNO:78中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述I3D-Ll抗体包含如SEQIDNO:77中所示的重链可变区和如SEQIDNO:76中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:79中所示的重链可变区和如SEQIDN0:80中所示的轻链可变区。[0037]本公开内容还提供了包含1、2、3、4、5或6个⑶R的PD-Ll抗体，所述⑶R选自SEQIDNO:7-12。在某些实施方式中，所述抗体包含3个重链⑶R，所述重链⑶R选自SEQIDNO:7-9。在某些实施方式中，所述抗体包含3个轻链⑶R，所述轻链⑶R选自SEQIDNO:10-12。在某些实施方式中，所述抗体包含如SEQIDNO:21中所示的重链可变区，或其人源化版本。在某些实施方式中，所述抗体包含如SEQIDNO:22中所示的轻链可变区，或其人源化版本。在某些实施方式中，所述抗体包含如SEQIDNO:21中所示的重链可变区和如SEQIDNO:22中所示的轻链可变区，或其人源化版本。[0038]一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体通过实验测得在酸性pH下与PD-Ll结合，以及通过实验测得在中性PH下与PD-Ll结合，其中所述在酸性pH下与PD-Ll结合显著低于所述在中性pH下与PD-Ll结合。在某些实施方式中，在相同实验条件下，所述H-L1抗体在酸性pH下与PD-Ll结合不超过所述抗体在中性pH下与I3D-Ll结合的80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%或5%。在某些实施方式中，所述中性pH是7.4,并且所述酸性pH是6.0、5.5、5.0、4.5或4.0。在某些实施方式中，在相同实验条件下，本申请所述的PD-Ll抗体在酸性pH6.0、pH5.5或pH5.0下与I3D-Ll的结合显著低于其在pH7.4下与I3D-Ll的结合。[0039]在某些实施方式中，体外测定结合或阻断活性是经由ELISA、FACS、表面等离子体共振、GSTpulldown、表位标签、免疫沉淀、Far-Western、荧光共振能量转移、时间分辨荧光免疫测定TR-FIA、放射免疫测定RIA、酶免疫测定、乳胶凝集、Western印迹、免疫组织化学及其任意组合来测定。[0040]在某些实施方式中，本公开内容还提供了一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体与PD-Ll抗体结合至相同表位或与ro-Ll抗体竞争性结合。在某些实施方式中，所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个例如，至少2个、3个、4个或5个）：E58、K62、N63、I64、S8^PY81。在某些实施方式中，所述表位还包含下述H-L1的氨基酸残基的至少一个例如，至少2个或3个）：1?113、1115、¥123、1124和1?125。在某些实施方式中，所述表位包含下述1^-1^1的氨基酸残基的组合的一种：1#58、1?113、]\1115、¥123和1124;2#58、380、1?113和1?125。在某些实施方式中，所述表位还包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个（例如，至少2个或3个）：162、呢3、164、¥81和0122。在某些实施方式中，所述表位包含下述?0-1^1的氨基酸残基的组合的一种：1E58、N63、I64、S80、Y81、R113*R125;2E58、S80、R113、M115、D122、Y123、K124和R125;3E58、K62、N63、S80、Y81、R113*R125;4E58、N63、I64、S80、Y81、R113、K124*R125〇[0041]本申请提供了一种治疗需要其的个体中与PD-Ll相关的病况的方法，所述方法包括向所述个体施用一种分离的I3D-Ll抗体从而治疗所述病况，在相同的实验条件下，所述分离的ro-Ll抗体在酸性pH下与ro-Ll的结合显著低于其在中性pH下与ro-Ll的结合。[0042]在某些实施方式中，所述抗体以不超过参照剂量80%、70%、60%、50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%或10%的剂量施用，其中将参照抗体达到相当的体内疗效时的剂量确定为参照剂量，其中所述参照抗体在酸性pH和中性pH下均显示出与PD-Ll相似的结合，并且其中所述参照抗体和所述抗体在中性pH下具有与ro-Ll相似的结合。[0043]在某些实施方式中，所述抗体以低于参照给药频率的给药频率施用，其中将参照抗体达到相当的体内疗效时的给药频率确定为参照给药频率，其中所述参照抗体在酸性PH和中性pH下均显示出与PD-Ll相似的结合，并且其中所述参照抗体和所述抗体在中性pH下具有与TO-Ll相似的结合。[0044]在某些实施方式中，所述抗体在靶器官中具有比参照体内半衰期更长的体内半衰期，其中所述参照体内半衰期通过参照抗体确定，其中所述参照抗体在酸性PH和中性pH下均显示出与PD-Ll相似的结合，并且其中所述参照抗体和所述抗体在中性pH下具有与H-L1相似的结合。在某些实施方式中，所述靶器官包括血清、肾、肺、胰腺、肝、胆囊、膀胱、皮肤、食管、卵巢、乳房、结肠、直肠、胃、脾或脑中的一个或多个。[0045]本公开内容还提供了一种分离的ro-Ll抗体，所述抗体包含重链H⑶Rl’、HCDR2’和HCDR3’以及轻链LCDR1’、LCDR2’和LCDR3’序列，其中[0046]所述HCDR1’序列选自下组:DYYMNSEQIDN0:23、SEQIDN0:29、35、41以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0047]所述HCDR2’序列选自下组：DINPNNGGTSYNX’iKFX’2GSEQIDN0:24、SEQIDNO:30、36、42以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0048]所述HCDR3’序列选自下组：VKW⑶GPFAYSEQIDNO:25、SEQIDNO:31、37、43以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0049]所述LCDR1’序列选自下组：X’3ASQNVGAAVASEQIDN0:26、SEQIDN0:32、38、44以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0050]所述LCDR2’序列选自下组：SASNX’4X’5TSEQIDN0:27、SEQIDN0:33、39、45以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0051]所述LCDR3’序列选自下组：QQYSNYPTSEQIDN0:28、SEQIDN0:34、40、46以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；[0052]其中X’：是!1或Q;X’2是K或Q;X’3是K或Q;X’4是R或L;X’5是丫或E。[0053]在某些实施方式中，X’：是⑴乂’2是Q;X’3是Q;X’4是R;X’5是Y。[0054]在某些实施方式中，本申请所述的I3D-Ll抗体包含重链框架HFR1’、HFR2’、HFR3’和HFR4’以及轻链框架LFR1’、LFR2’、LFR3’和LFR4’，其中重链可变区的序列如下式所示：HFR1’-HCDR1’-HFR2’-HCDR1’-HFR3’-HCDR1’-HFR4’，并且轻链可变区的序列如下式所示：LFR1’-LCDR1’-LFR2’-LCDR1’-LFR3’-LCDR1’-LFR4’。[0055]在某些实施方式中，所述HFR1’序列是X’aiVQLX’a2QSGX’a3EX’a4X’asKPGASVKX’aeSCKASGYVFTSEQIDNO：47；[0056]所述HFR2’序列是WVX’a7QX’asX’a9GX’aioX’aiiLEWIGSEQIDN0:48;[0057]所述HFR3’序列是X’ai2X’ai3TVTVDX’ai4SX’ai5X’ai6TAYMELX’ai7X’aisLX’ai9SX’a2〇DX’a2iAVYYCSEQIDN0:49;[0058]所述HFR4’序列是WGQGTLVTVSX’a22SEQIDN0:50;[0059]所述LFR1’序列是DIX’a23MTQSX’a24X’a25X’a26X’a27SX’a28SVGDRVX’a29lTCSEQIDNO：51；[0060]所述LFR2’序列是WYQQKPGX’a3〇X’a3iPKLUYSEQIDN0:52;[0061]所述LFR3’序列是GVPX’a32RFX’a33GSGSGTDFTLTISX’a34X’a35QX’a36EDX’a37AX’assYFCSEQIDNO：53；[0062]所述LFR4’序列是FGSGTKLGIKSEQIDN0:54;[0063]其中X’a@Q或E;X’a2是Q或V;X’a3是A或P;X’a4是L或V;X’a^V或K;X’a6是I或V;X’a7是K或R;X’as是S或A;X’ag是H或P;X’aio是Q或K;X’an是S或G;X’ai2是K或R;X’ai3是A或V;X’aw是K或T;X’15是3、1'或I;X’16是3或R;X’an是L或S;X’18是3或R;X’19是尺或T;X’a20是E或D;X’21是3或T;X’a22是A或S;X’a23是Q或V;X’a24是Q或P;X’a25是K或S;X’a26是F或S;X’a27是M或L;X’a28是T或A;X’a29是S或T;X’a3〇是Q或K;X’a3i是S或A;X’a32是S或D;X’a33是S或T;X’a34是S或N;Xa35是M或L;Xa36是S或P;Xa37是L或I;Xa38是D或Τ。[0064]在某些实施方式中，X’1是〇;乂’a2是V;X’a3是A;X’a4是V;X’5是¥;乂’a6是I;X’a7是K;Xas是A;Xag是P;Xaio是Q;Xaii是G;Xai2是R;Xai3是A;Xai4是K;Xai5是T;Xai6是R;Xan是S;Xais是R;Xaig是R;Xa2〇是D;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是Q;Xa24是Q;Xa25是S;Xa26是a27是L;X828是A;X829是T;X830是K;X831是A;X832是a33是a34是a35是M;Xa36是P;Xa37是I;Xa38是T。[0065]在某些实施方式中，X’1是〇;乂’a2是V;X’a3是A;X’a4是V;X’5是1;乂’a6是V;X’a7是R;Xas是A;Xag是P;Xaio是Q;Xaii是G;Xai2是R;Xai3是V;Xai4是T;Xai5是I;Xai6是R;Xan是S;Xais是R;Xaig是R;Xa2〇是D;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是Q;Xa24是Q;Xa25是S;Xa26是a27是L;X828是A;X829是T;X830是K;X831是A;X832是a33是a34是S;Xa35是M;Xa36是P;Xa37是I;Xa38是T。[0066]在某些实施方式中，X’1是〇;乂’a2是V;X’a3是A;X’a4是V;X’5是¥;乂’a6是I;X’a7是K;Xas是A;Xag是P;Xaio是Q;Xaii是G;Xai2是R;Xai3是A;Xai4是K;Xai5是T;Xai6是R;Xan是S;Xais是R;Xaig是R;Xa2〇是D;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是Q;Xa24是P;Xa25是S;Xa26是a27是L;X828是A;X829是T;X830是K;X831是A;X832是a33是a34是S;Xa35是L;Xa36是P;Xa37是I;Xa38是T0[0067]在某些实施方式中，X’1是〇;乂’a2是V;X’a3是A;X’a4是V;X’5是1;乂’a6是V;X’a7是R;Xas是A;Xag是P;Xaio是Q;Xaii是G;Xai2是R;Xai3是V;Xai4是T;Xai5是I;Xai6是R;Xan是S;Xais是R;Xaig是R;Xa2〇是D;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是Q;Xa24是P;Xa25是S;Xa26是a27是L;X828是A;X829是T;X830是K;X831是A;X832是A;X833是a34是S;X835是L;Xa36是P;Xa37是I;Xa38是T0[0068]在某些实施方式中，本申请所述的PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:65中所示的重链可变区和如SEQIDN0:66中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，本申请所述的I3D-Ll抗体包含如SEQIDN0:67中所示的重链可变区和如SEQIDN0:68中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，本申请所述的I3D-Ll抗体包含如SEQIDN0:65中所示的重链可变区和如SEQIDN0:68中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，本申请所述的PD-Ll抗体包含如SEQIDN0:67中所示的重链可变区和如SEQIDN0:66中所示的轻链可变区。在某些实施方式中，本申请所述的I3D-Ll抗体包含如SEQIDN0:85中所示的重链可变区和如SEQIDN0:86中所示的轻链可变区。[0069]本公开内容还提供了包含至少1、2、3、4、5或6个⑶R的另一种分离的PD-Ll抗体，所述⑶R选自SEQIDNO:29-46。在某些实施方式中，所述分离的PD-Ll抗体包含：1所述重链HCDR1’是SEQIDN0:29、HCDR2’是SEQIDN0:30和HCDR3’是SEQIDN0:31;2所述重链HCDR1’是SEQIDN0:35、HCDR2’是SEQIDN0:36和HCDR3’是SEQIDN0:37;或者3所述重链HCDR1’是SEQIDN0:41、HCDR2’是SEQIDN0:42和HCDR3’是SEQIDN0:43。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含1所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:32、LCDR2’是SEQIDN0:33和LCDR3’是SEQIDN0:34;2所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:38、LCDR2’是SEQIDN0:39和LCDR3’是SEQIDN0:40;或者3所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:44、LCDR2’是SEQIDN0:45和LCDR3’是SEQIDN0:46。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含1所述重链HCDR1’是SEQIDN0:29、HCDR2’是SEQIDN0:30和HCDR3’是SEQIDN0:31，所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:32、LCDR2’是SEQIDN0:33和LCDR3’是SEQIDN0:34;2所述重链HCDR1’是SEQIDN0:35、HCDR2’是SEQIDN0:36和HCDR3’是SEQIDN0:37,所述轻链LCDR1’是SEQIDNO:38、LCDR2’是SEQIDN0:39和LCDR3’是SEQIDN0:40;或者3所述重链HCDR1’是SEQIDN0:41、HCDR2’是SEQIDN0:42和HCDR3’是SEQIDN0:43,所述轻链LCDR1’是SEQIDNO:44、LCDR2’是SEQIDN0:45和LCDR3’是SEQIDN0:46。[0070]在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含选自下组的重链可变区：SEQIDN0:55、57和59。在某些实施方式中，所述I3D-Ll抗体包含选自下组的轻链可变区：SEQIDNO:56、58和60〇[0071]在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含SEQIDNO:55所示的重链可变区或其人源化形式，以及SEQIDN0:56所示的轻链可变区或其人源化形式。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含SEQIDN0:57所示的重链可变区或其人源化形式，以及SEQIDN0:58所示的轻链可变区或其人源化形式。在某些实施方式中，所述PD-Ll抗体包含SEQIDNO:59所示的重链可变区或其人源化形式，以及SEQIDN0:60所示的轻链可变区或其人源化形式。[0072]本公开内容还提供了另一种分离的F1D-Ll抗体，所述抗体与本申请所述的PD-Ll抗体结合至相同表位或与本申请所述的ro-Li抗体竞争性结合。在某些实施方式中，所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个:E58和S80。在某些实施方式中，其中所述表位还包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的至少一个例如，至少2个、3个或4个）：Y56、R113、D122、Y123和R125。在某些实施方式中，所述表位包含下述H-L1的氨基酸残基的组合的一种：IE58、尺113、0122、¥123和1?125;2¥56^58和1?113;3#58、1?113和1?125。在某些实施方式中，其中所述表位还包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的至少一个或至少2个）：S80和D122。在某些实施方式中，所述表位包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、S80、R113、D122、Y123*R125;2E58、S80、R113*R125。[0073]本公开内容还提供了一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体具有高于76例如，高于80、高于85或高于90摄氏度的热转变中点Tm，所述热转变中点通过差示扫描量热法测定。在某些实施方式中，本申请的所述抗体是双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、标记的抗体、二价抗体或抗独特型抗体。在某些实施方式中，所述抗体是选自下组的抗原结合片段:胳盤源化单结构域抗体、双功能抗体diabody、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、（dsFv2、dsFv_dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、Fab’）2、ds双功能抗体、纳米抗体、结构域抗体、分离的CDR和二价结构域抗体。[0074]在某些实施方式中，本申请所述的TO-Ll抗体如4B6、26F5、2IFlI、23A11、23F11和22C9与人和非人灵长类动物的PD-Ll结合，但不与小鼠PD-Ll结合。在某些实施方式中，本申请所述的I3D-Ll抗体如18G4与人和小鼠ro-Li结合。[0075]本公开内容还涉及一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请所述的抗体。[0076]本公开内容还涉及一种编码本申请所述的抗体的多核苷酸。本申请提供了一种载体，所述载体包含所述多核苷酸。本申请还提供了一种分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含所述载体。在某些实施方式中，所述宿主细胞产生由所述多核苷酸编码的所述抗体。[0077]本公开内容还涉及一种试剂盒，所述试剂盒包含本申请所述的抗体。[0078]本公开内容还涉及一种生产本申请所述的抗体的方法，所述方法包括在表达所述多核苷酸的条件下培养所述宿主细胞。[0079]本公开内容还涉及一种治疗需要其的个体中与PD-Ll相关的病况的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的本申请所述的抗体。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是在放疗、化疗、靶向疗法、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息治疗、外科手术或其组合中使用的药剂。在某些实施方式中，所述第二治疗剂是VEGFR2抗体。[0080]本公开内容还提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含本申请所述的PD-Ll抗体和第二治疗剂。[0081]在本公开内容中还提供了一种治疗需要其的个体中与PD-Ll相关的病况的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的所述药物组合物。[0082]本公开内容还提供了一种分离的非人肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包含编码人PD-Ll蛋白的多核苷酸。在某些实施方式中，所述非人肿瘤细胞是啮齿动物例如，小鼠、大鼠或仓鼠等肿瘤细胞。[0083]本申请还提供了一种生产非人肿瘤细胞的方法，所述肿瘤细胞包含编码人PD-Ll蛋白的多核苷酸，所述方法包括引入编码所述人PD-Ll的多核苷酸。在某些实施方式中，所述方法还包括使内源性非人ro-Li基因失活。在某些实施方式中，所述失活包括破坏蛋白编码区的基因、突变、添加、基因沉默或基因缺失，从而使靶基因的表达消除或最小化，或者产生功能上失活截短的蛋白。在某些实施方式中，将所述人ro-Li基因区段可操作地插入所述内源性非人PD-Ll基因座。在某些实施方式中，在所述内源性非人ro-Ll基因座以外的位点插入所述人ro-Li基因区段。在某些实施方式中，所述人ro-Ll基因区段是游离DNA区段的形式。[0084]—种筛选或评估针对人PD-Ll的抗体的体内药效的方法，所述方法包括将包含编码人ro-Li蛋白的多核苷酸的非人肿瘤细胞接种进非人动物，将所述抗体与所述非人动物中的所述非人肿瘤细胞接触，并且确定所述非人肿瘤细胞的肿瘤负荷。所述肿瘤细胞可以是实体肿瘤细胞或非实体肿瘤细胞。在某些实施方式中，将所述非人细胞接种到同系非人动物中以产生同系肿瘤模型。在某些实施方式中，所述非人动物是啮齿动物例如，小鼠、大鼠或仓鼠等）。[0085]在一个方面，本公开内容提供了一种分离的F1D-Ll抗体，其中所述抗体与表位结合或竞争性地与所述表位结合，所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58和S80;2E58和Rl13;3E58和D122;4E58和R125。在某些实施方式中，所述表位还包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个:Y56和Y123。在某些实施方式中，所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、R113、M115、Y123*K124;2E58、S80、R113*R125;3E58、R113、D122、Y123和R125;4Y56、E58和R113;5E58、R113和R125。在某些实施方式中，所述表位还包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个:K62、N63、164和Y81。在某些实施方式中，所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、N63、I64、S80、Y81、R113*R125;2E58、S80、R113、M115、D122、Y123、K124*R125;3E58、K62、N63、S80、Y81、R113*R125;4E58、N63、I64、S80、Y81、R113、K124*R125;5E58、S80、R113、D122、Y123*R125。[0086]在一个方面中，本申请还提供了一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体与由PD-Ll的氨基酸残基S80组成的表位结合或竞争性地与所述表位结合。[0087]在一个方面中，本公开内容提供了一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体具有至少7天例如，至少8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35或40天）的持续的I3D-Ll受体占据期。[0088]一种分离的ro-Ll抗体，所述抗体以约0.03ygml的EC5Q值与活化的人T细胞结合，所述EC5Q值通过ELISA测定（例如，0·00lygml-lygml例如，0·001ygml-0·5ygml、0·001μgml-〇·2ygml、0·OOlygml-O·lygml、0·01ygml-〇·2ygml、0·01ygml-〇·lygml、0·01μgml-0·05ygml、0·0lygml-〇·03ygml或0·00lygml-〇·0lygml的EC5Q值，所述EC5Q值通过ELISA测定，或者0.01ygml-lygml例如，0.01ygml-0.5ygml、0.01ygml-0.2ygml、0·02ygml_lygml、0·02ygml_0·5ygml、0·02ygml_0·2ygml或0·02ygml_0·lygml的EC50值，所述EC5q值通过FACS测定）。附图说明[0089]图IA是表示在杂交瘤上清中的小鼠抗-PD-Ll抗体阻断包被在板上的hPD-Ll-Fc与hPD-1-his结合的能力的柱状图，图IB是表示在杂交瘤上清中的小鼠抗-PD-Ll抗体阻断包被在板上的hPD-Ll-Fc与hPD-1-his结合的能力的柱状图，并且图IC也是表示在杂交瘤上清中的小鼠抗-PD-L1抗体阻断包被在板上的hPD-LI-Fc与hPD-1-his结合的能力的柱状图，其通过ELISA测得。[0090]图2A是显示杂交瘤上清中的小鼠抗-PD-Ll抗体23A11与hPD-Ll-hiS的pH依赖性结合的图示说明，其在PH7.4下具有较高的结合三角形），在pH6.0下具有较低的结合菱形），其通过ELISA测定。图2B是显示杂交瘤上清中的小鼠抗体克隆23F11与hPD-Ll的pH依赖性结合，其在PH7.4下具有较高的结合（三角形），在pH6.0下具有较低的结合（菱形），其通过ELISA测定。[0091]图3显示不同克隆系列稀释的纯化的小鼠单克隆PD-Ll抗体（21F11十字形）、23F11菱形）、26F5空心圆形）、22C9空心三角形）、4B6实心方形）、23A11实心三角形）与hPD-Ll的结合，其通过ELISA分析测定。[0092]图4A显示系列稀释的纯化的小鼠单克隆PD-Ll抗体（23A11浅灰色实心方形）、23F11实心三角形）、4B6实心圆形）、22C9实心菱形）、26F5黑色实心方形）、21F11倒三角形）和BM-GT空心圆形））阻断hPD-Ll-Fc与hPD-l-N297A-生物素结合的活性，其通过ELISA测定；图4B显示10ygml的I3D-Ll抗体阻断hPD-l-FcN297A与HCC827上表达的hPD-Ll结合的活性，其通过FACS分析测定。[0093]图5A显示小鼠纯化的PD-Ll抗体与HCC827上表达的hPD-Ll的剂量依赖性的结合；图5B显示了小鼠纯化的I3D-Ll抗体阻断hPD-l-N297A与HCC827上表达的hPD-Ll结合的剂量依赖性活性。21F11圆形）、23A11三角形）、23F11倒三角形）、22C9菱形和4B6大圆形）。[0094]图6A4B6-C、图6B23A11、图6C23F11、图6D22C9和图6E21F11显示小鼠和或嵌合PD-LI抗体与人和食蟹猴ro-Ll-his相似地结合。而与人和食蟹猴ro-Ll特异性结合的这些抗体不与小鼠ro-Ll-his结合，其通过ELISA测定，但18G4除外，该抗体与人和小鼠PD-Ll均结合（图6F。图6G显示了所有抗体均能与hPD-Ll结合，但不与hPD-L2结合，其通过ELISA测定。[0095]图7显示了嵌合和或人源化PD-Ll抗体与HCC827上表达的hPD-Ll结合，其通过FACS测定。[0096]图8显示了嵌合和或人源化PD-Ll抗体阻断PD-I与HCC827上表达的hPD-Ll的活性，其通过FACS测定。[0097]图9A18G4、图9B4B6和图9C23A11是显示在竞争性抗体4B6、23A11、23F11、22C9和21F11存在的条件下PD-Ll抗体与hPD-Ll-Fc的表位结合结果的柱状图，其分别通过竞争ELISA测得。[0098]图l〇A23Fn-C、图10B23A11-C、图10C22C9-C、图10D21F11-C、图10E4B6-C和图IOF26F5-C是显示嵌合I3D-Ll抗体在pH7.4和pH5.5下与hPD-Ll-hispH-依赖性结合的图表，其分别通过ELISA测得。[0099]图IlA显示了在MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中随着时间的推移测得的平均肿瘤体积，其表明纯化的小鼠抗-PD-Ll抗体4B6实心菱形）、23A11空心倒三角形）、23F11实心条纹菱形和26F5空心菱形）和载剂实心圆形在体内抑制肿瘤生长方面的抗肿瘤活性；图IlB显示了在第29天针对相同抗体的平均肿瘤体积；图IlC显示了针对相同抗体随着时间的推移测得的平均体重。3次周向小鼠腹腔注射^$组11=810mgkg即mpk抗体，持续3周，结果以平均值土S.E.M表示。[0100]图12A显示了在抑制肿瘤生长方面的活性，在MC38hPD-Ll敲入肿瘤模型中注射纯化的小鼠嵌合I3D-Ll抗体4B6-C浅灰色实心三角形）、23F11黑色实心倒三角形）以及参照抗体BM-GT空心圆形）和BM-ME空心方形）或对照I3BS实心圆形），随着时间的推移测得的平均肿瘤体积；图12B显示了持续3周，3次周腹腔注射Impkmgkg所述抗体组每组η=8的各小鼠在第20天的平均肿瘤体积；图12C显示了静脉注射Impk浅灰色实心倒三角形）或3mpk实心菱形）小鼠抗体18G4的各组小鼠（每组η=8后随着时间的推移测得的平均肿瘤体积；图12D显示了静脉内注射Impk浅灰色实心倒三角形）或3mpk实心菱形）小鼠抗体18G4的各组小鼠（每组n=8在第25天的平均肿瘤体积；图12E显示静脉注射Impk空心圆形或3mpk空心方形小鼠抗体22C9后的各组小鼠（每组n=8随着时间的推移测得的平均肿瘤体积；图12F显示了静脉注射Impk空心圆形）或3mpk空心方形）小鼠抗体22C9后的各组小鼠（每组n=8在第25天的平均肿瘤体积;结果以平均值±S.E.M表示。[0101]图13A显示了在MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中随着时间的推移测得的平均肿瘤体积，其显示了纯化的pH依赖性嵌合ro-Ll抗体23A11-C空心圆形，23F11-C空心三角形在体内抑制肿瘤生长方面的抗肿瘤活性;图13B显示了在第29天的平均肿瘤体积;3次周向小鼠（每组η=8腹腔注射Impk抗体，持续3周，结果以平均值土S.E.M表示，P为〈0.05。载剂以实心圆形表示，并且参照抗体GT以实心倒三角形表示。[0102]图14Α显示了4Β6的重链种系和人源化可变区的氨基酸序列（4Β6-种系、4B6-Hzd-HC-V3和4B6-HC-V4，图14B显示了4B6的轻链种系和人源化可变区的氨基酸序列（4B6LC种系、4B6-Hzd-LC-V3和4B6-LC-V4。[0103]图15A显示了23A11抗体的重链种系和人源化可变区的氨基酸序列（23A11-HC-种系、23A11-HC-V3和23A11-HC-V5，图15B显示了23A11抗体的轻链种系和人源化可变区的氨基酸序列（23A11-LC-种系、23A11-LC-V3和23A11-LC-V5。[0104]图16A显示了23F11抗体的种系和人源化重链可变区的氨基酸序列（23F11种系HC、23F11-HC-V4和23F11-HC-V6，并且图16B显示了23F11抗体的种系和人源化轻链可变区的氨基酸序列（23F11种系LC、23F11-LC-V4和23F11-LC-V6。[0105]图17A是显示23F11抗体〇1礼4、!1乩6、册1^4、!161^6和嵌合）与诎〇-1^1-11丨8结合的柱状图，图17B显示了人源化23A11抗体H3L3、H3L5、H5L3和H5L5与hPD-Ll-his的结合，其通过ELISA测定。[0106]图18A至图18D是显示通过ELISA测得的人源化PD-Ll抗体阻断hPD-Ll-Fc与hPD-1-N297A结合的活性的柱状图。图18A至图18D分别显示了人源化4B6H3L3、H3L4、H4L3和H4L4，图18A、23F11H4L4、H4L6、H6L4、H6L6和嵌合⑹，图18B、人源化23A11H3L3、H3L5、H5L3和H5L5,图18C、人源化23A11H3L3和H3L5和人源化23F11H4L4以及参照抗体BM-GI^PBM-ME，参见图18D的结果。[0107]图19显示了通过FACS测得的人源化PD-Ll抗体（81-61\81-]\^、486-!131^4、486-H4L3、23F11-H4L4、23F11-H4L6、23F11-H6L4、23F11-H6L6、23A11-H3L3、23A11-H3L5、23A11-H5L3和23A11-H5L5与HCC827上表达的hPD-Ll的结合。[0108]图20A是显示通过FACS测得的人源化4B6H3L4和H4L3和参照抗体（BM-GI^PBM-ME阻断hPD-l-N297A与HCC827上表达的hPD-Ll结合的活性的柱状图。图20B显示了通过FACS测得的人源化23A11H3L5分别在CHO和293细胞中产生）、人源化23F11H4L4分别在CHO和293细胞中产生）和参照抗体BM-GT和BM-ME阻断hPD-l-N297A与HCC827上表达的hPD-Ll结合的活性。[0109]图21A是说明在混合淋巴细胞反应MLR中由人源化4B6-H3L3抗体、hIgGl、BM-GT和BM-ME刺激活化的供体5CD4T细胞中产生的IL-2的柱状图。图21B显示了在相同实验中由人源化4B6-H3L3抗体、hlgGl、BM-GT和BM-ME刺激活化的供体5CD4T细胞中产生的IFN-γ。图2IC显示了在相同实验中由人源化抗体23Α11-H3L3、23Α11-H3L5、23F11-H4L4和23F11-H6L4以及hIgGl、BM-GT和BM-ME刺激活化的供体6CD4T细胞中产生的IL-2。图21D显示了在相同实验中由人源化抗体23A11-H3L3、23A11-H3L5、23F11-H4L4和23F11-H6L4以及hlgGl、BM-GT和BM-ME刺激活化的供体6CD4T细胞中产生的IFN-γ。[0110]图22Α和22C分别显示了通过ELISA测得的在CHO细胞和293细胞中产生的人源化23Α11-H3L5在ρΗ7.4三角形和ρΗ5.5菱形）下与hPD-Ll-his的pH依赖性结合；图22Β和22D显示了通过ELISA测得的在相同细胞中产生的人源化23F11-H4L4在pH7.4三角形和pH5.5菱形）下与hPD-L卜his的结合；图22E显示了通过ELISA测得的分别在pH7.4三角形）和PH5.5菱形下对参照抗体BM-GT与hPD-Ll-his的结合进行的相同实验。[0111]图23A显示通过ELISA测得的在中性pHS卩7·4和酸性pHS卩6.0、5.5、5.0、4.5、4.0下23A11-H3L5与hPD-Ll-his的pH依赖性结合；图23B显示了将23A11-H3L5的相同结果以归一化至pH7.4信号的百分比；图23C表示通过ELISA测得的在中性pHS卩7.4和酸性pH即6·0、5·5、5·0、4·5、4·0下23F11-H4L4与hPD-Ll-his的pH依赖性结合；图23D显示了将23F11-H4L4的相同结果以归一化至pH7.4信号的百分比；图23E表示通过ELISA测得的在中性pH即7·4和酸性pH即6·0、5·5、5·0、4·5、4·0下22C9-C与hPD-Ll-his的pH依赖性结合；图23F显示了将22C9-C的相同结果以归一化至pH7.4信号的百分比。在图23的所有图中，pH7.4灰色圆形），pH6.0黑色圆形），pH5.5黑色方形），pH5.0灰色倒三角形），pH4.5灰色菱形），pH4.0灰色三角形）。[0112]图24A至图241是显示通过ELISA测得的I3D-Ll抗体（23F11图24A，23A11图24B，26F5图24C，18G4图24D，4B6图24E，21F11图24F，22C9图24G，23F11-H4L4图24H和23A11-H3L5图241与丙氨酸突变的hPD-Ll-Fc在实施例18中产生结合的柱状图。[0113]图25显示了在MC38人PD-LlKI肿瘤模型中注射人源化PD-Ll抗体实心圆形表示载剂，空心方形表示BT-GM以及空心圆形表示4B6-H3L3-N297A，其抗肿瘤活性以随时间变化的平均肿瘤体积表示，3次周（每组n=8腹腔注射3mpk抗体，持续3周，结果以平均值±S·E·M表示。[0114]图26A显示了在给予了载剂（实心圆形）、BM-ME空心方形）、BM-GT空心菱形）、23A11-H3L5空心三角形和23F11-H4L4空心倒三角形）的MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中测得的平均肿瘤体积随时间变化的情况，结果表明人源化PD-Ll抗体在体内抑制肿瘤生长方面具有抗肿瘤活性；图26B显示了注射了Impk抗体的小鼠在第28天的平均肿瘤体积；图26C显示了与图26A相同的实验，但使用IOmpk抗体；图26D显示了与图26B进行相同的实验，但使用IOmpk抗体；图26E比较注射了不同抗体及剂量（实心圆形表示载剂，实心菱形表示ImpkBM-GT，实心倒三角形表示3mpkBM-GT，实心方形表示IOmpkBM-GT和空心圆形表示Impk23F11-H4L4的小鼠中的肿瘤体积。3次周向小鼠海组η=8腹腔注射抗体，持续3周结果以平均值土S.E.M表示。[0115]图27Α显示了在MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中注射人源化PD-Ll抗体后的平均肿瘤体积随时间变化的情况，表明抗体在抑制肿瘤生长方面具有体内抗肿瘤活性实心圆形表示载剂，空心三角形表示BM-GT，空心圆形表示23A11-H3L5和虚线空心圆形表示23F11-H4L4。图27Β显示了给予抗体的各组小鼠在第26天的平均肿瘤体积实心圆形表示载剂，实心三角形表示BM-GT，实心倒三角形表示23Α11-H3L5和空心圆形表示23F11-H4L4。在第0天和第15天向小鼠（每组η=12静脉注射Impk抗体，结果以平均值土S.E.M表示。[0116]图28Α至图28D是显示以静脉注射lmgkgPD-Ll抗体（载剂（图28Α，BM-GT图28B，23A11-H3L5图28C和23F11-H4L4图28D处理的小鼠，其肿瘤大小归一化至初始点的肿瘤尺寸变化情况的瀑布图。[0117]图29A显示了在静脉注射给予不同剂量PD-Ll抗体实心圆形表示载剂，空心方形表示ImpkBM-GT，实心方形表示IOmpkBM-GT，实心菱形表示Impk23F11-H4L4,实心倒三角形表示IOmpk23F11-H4L4,空心圆形表示Impk23A11-H3L5,实心三角形表示IOmpk23A11-H3L5的MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中在抑制肿瘤生长方面测定的平均肿瘤体积随时间变化的情况，表明其具有体内抗肿瘤活性。图29B显示了给予了不同抗体实心圆形表示载剂，黑色空心方形表示ImpkBM-GT，浅色空心方形表示IOmpkBM-GT，浅色空心圆形表示Impk23A11-H3L5,黑色空心三角形表示IOmpk23A11-H3L5,黑色空心圆形表示Impk23F11-H4L4和黑色空心倒三角形表示IOmpk23F11-H4L4的各组小鼠在第15天的平均肿瘤体积。在第0天向小鼠海组η=12静脉注射抗体，结果以平均值±S.E.M表示。[0118]图30显示了在第35天用肿瘤细胞再攻毒的MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中，人源化H-L1抗体23A11-H3L5三角形和23F11-H4L4圆形）的体内抗肿瘤活性。[0119]图31A显示了染料标记的pH依赖性PD-L1抗体23F11-H4L4和BM-GT在静脉注射Imgkg剂量后，在不同时间点渗透进入MC38hPD-Ll肿瘤细胞的抗体辐射信号的图像；图31B显示了在各小鼠中测得的辐射肿瘤体积比随小时变化的情况对于BM-GT，2-1灰色倒三角形），2-2实心灰色菱形），2-3空心灰色圆形），以及对于23F11-H4L4,4-1黑色空心菱形），4-2黑色实心菱形），4-3黑色星形）；图31C显示了在给予BM-GT方形）或23F11-H4L4倒三角形的各小鼠中测得的肿瘤体积随天数变化的情况，线条表示平均值。[0120]图32A显示了在分别给予载剂实心圆形）、仅DClOl空心方形表示的抗-VEGFR2抗体）、仅23A11-C空心倒三角形）以及23A11-C和DClOl的组合空心圆形）的hPD-LlMC38小鼠肿瘤模型中测得的平均肿瘤体积随时间变化的情况，表示组合具有体内抗肿瘤活性；图32B显示了分别注射载剂实心圆形）、仅DClOl实心方块表示的抗-VEGFR2抗体）、仅23A11-C实心倒三角形）以及23A11-C和DClOl组合实心菱形）的小鼠在第29天的平均肿瘤体积；图32C显示了分别给予载剂（实心圆形）、仅DClOl实心方形表示的抗-VEGFR2抗体）、仅23A11-C实心倒三角形）以及23A11-C和DClOl组合实心菱形）的小鼠在相同实验中测得的平均小鼠体重随时间变化的情况，并且每周3次向小鼠^$组11=8静脉注射0.3mpk23A11-C和或20mpkDCl01，持续3周。图32D表明分别给予了IOmpk对照IgG实心圆形）、仅ImpkDClOl实心方块）、仅Impk23A11-H3L5实心菱形）以及Impk23A11-H3L5和ImpkDClOl组合实心三角形）的小鼠测得的平均肿瘤体积随时间变化的情况；图32E显示了分别给予了IOmpk对照IgG实心圆形）、仅3mpkDClOl实心三角形）、仅3mpk23A11-H3L5空心圆形）以及3mpk23A11-H3L5与3mpkDClOl的组合空心倒三角形）的小鼠测得的平均肿瘤体积随时间变化的情况。每周一次每组n=8静脉注射抗体，持续2-3周。结果以平均值±5^.M表不。[0121]图33A和图33B分别示出了通过差示扫描量热法DSC测得的23F11-H4L4和23A11-H3L5的热转变中点Tm的图表。[0122]图34显示了本公开内容中描述的序列表。[0123]图35显示了23F11-H4L4内吞进入MC38hPD-Ll细胞的图表。Y轴显示通过VarioskanFlash测得的在不同抗体浓度下内吞进细胞中23F11-H4L4的荧光信号。灰色小圆形表示24小时后测得的23F11-H4L4,以及黑色大圆形表示6小时后测得的23F11-H4L4。[0124]图36A和图36B显示了23F11-H4L4与活化的人T细胞的结合。图36A显示了23F11-H4L4与⑶3和⑶28阳性单核细胞的结合，而在⑶3和⑶28阴性单核细胞中几乎没有结合。[0125]图37A-37C显示了I3D-Ll抗体在接种MC38hPD-Ll细胞的人ro-Ι敲入小鼠模型中的体内有效性研究。图37A显示了在分别施用了I3BS和23F11-H4L4的人PD-I敲入C57BL6小鼠中肿瘤体积随时间变化的情况。图37B显示了在分别以静脉注射PBS或3mgkgPD-Ll抗体处理的每只小鼠肿瘤大小归一化至起始点的肿瘤尺寸变化情况。图37C显示了分别给予PBS实心圆形和23F11-H4L4实心方形）的小鼠在相同实验中测得的平均小鼠体重随时间变化的情况。[0126]图38A-38C显示了I3D-Ll抗体在接种MC38hPD-Ll细胞的人ro-Ι敲入小鼠模型中的体内有效性研究。图38A和38B显示了在分别施用了23F11-H4L4lmgkg、3mgkg和IOmgkg，对照hlgGAB160160,10mgkg和BM-GT10mgkg的人Η-1敲入C57BL6小鼠中肿瘤体积随时间变化的情况。图38C显示了在分别以腹腔注射PD-L1抗体、对照hIgG或BM-GT处理的每只小鼠肿瘤大小归一化至起始点的肿瘤尺寸变化情况。[0127]图39显示了在具有MC38hro-Ll肿瘤的小鼠中静脉注射23F11-H4L4和BM-GT后第2、7和14天测得的PD-Ll受体占据比例。[0128]图40显示了IOmpk给药后第7天23F11-H4L4和TIL在MC38hro-LlCDx冰冻肿瘤切片上的浸润图像。图A:用AlexaFluor488山羊抗-人IgGH+L二抗染色的23F11-H4L4绿色）；图B:用AlexaFluor®594抗-小鼠CD8b.2染色的TIL红色）；图C:用AlexaFluor®594抗-小鼠⑶31染色的血管红色）；图D:阴性对照。用DAPI进行核染色蓝色）。具体实施方式[0129]本申请的以下描述只为说明本申请的多种实施方式。因此，此处讨论的具体修改方式不应理解为对申请范围的限制。本领域的技术人员在不偏离本申请范围的情况下即可很容易地得出多种等同方式，变化和修改，应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。在本申请中引用的所有文献，包括公开出版物、专利和专利申请都通过引用的方式全文并入。[0130][0131]本发明中的“PD-L1”（也称为B7-H1⑶274—词指程序性细胞死亡配体IPD-L1，参见例如Freeman等（2000J·Exp·Med·192:1027。其在胎盘、脾脏、淋巴结、胸腺、心脏、胎儿肝脏中表达，并且也存在于多种肿瘤或癌细胞上。“PD-L2”指程序性细胞死亡配体2PD-L2,参见例如Latchman等，（2001Nat.Immunol.2:261〇“PD-l”（也称为CD279指程序性细胞死亡蛋白1，其为⑶28家族的成员，由PD⑶1基因编码，并且是在T细胞表面上表达的一种抑制性受体，功能是在生理上限制T细胞的活化和增殖。代表性的人PD-I氨基酸序列如NCBI登录号:NP_005009.2所示，并且代表性的人PD-I核酸序列如NCBI登录号：NM_005018.2所示。“ro-Ι配体”包括PD-Ll和ro-L2两者或两者之一，以及其由细胞天然表达的任何变体或异构体，和或其具有全长多肽的至少一种生物活性的片段。人ro-Ll的序列如NCBI登录号：NP_054862.1代表性的氨基酸序列）和NCBI登录号：NM_014143.3所示（代表性的核酸序列）。[0132]本发明中的“抗体”一词包括任意可结合某特定抗原的免疫球蛋白、单克隆抗体、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体或双特异性二价抗体或其功能性片段。一个天然的完整抗体包含通过二硫键彼此连接的两条重链H和两条轻链L。每条重链由一可变区VH和第一、第二、第三恒定区（分别为CHl、CH2和CH3组成，每条轻链由一可变区VL和一恒定区（CL组成。哺乳动物的重链可分为α、δ、ε、γ和μ，哺乳动物的轻链可分为λ或κ。轻链和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区通常分成三个高变区，称互补决定区CDR轻链L的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3，重链⑹的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3。本发明中公开的抗体和抗原结合片段的⑶R边界可通过Kabat，Chothia或Al-Lazikani命名法命名或辨别。（Al-Lazikani，B.，Chothia，C.，Lesk,Α·Μ·,J.Mol.Biol.,273⑷，9271997;Chothia，C.等，JMolBiol.Dec5;1863:651-631985;Chothia，C.andLesk，A.M·，J.Mol.Biol.,196,9011987;Chothia，C.等，Nature-Dec21-28;3426252:877-831989;KabatE.A.等，NationalInstitutesofHealth，Bethesda,Md.1991。其中，三个CDR由被称为框架区FR的侧翼延伸部分间隔开，框架区比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。因此，VH和VL各自以下述顺序从氨基酸残基的N末端至C末端包含三个CDR和四个FR:FRl、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关，但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列分成五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其分别含有α、δ、ε、γ和μ重链。几个主要的抗体类别的亚类为，如IgGlγI重链）、IgG2γ2重链）、IgG3γ3重链）、IgG4γ4重链）、IgAlαΐ重链或IgA2α2重链等。[0133]本发明中的“抗原结合片段”一词，指由含有一个或多个CDR的抗体片段或者任何其他结合抗原但不具有完整天然抗体结构的抗体的片段所形成的一种抗体片段。在某些实施方式中，本申请所述的抗体是抗原结合片段。抗原结合片段的例子包括，但不限于，双功能抗体diabody、Fab、Fab’、Fab’）2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段dsFv、（dsFv2、双特异性dsFvdsFv-dsFv’）、二硫键稳定的双功能抗体dsdiabody、单链抗体分子（scFv、scFv二聚体（二价的双功能抗体）、多特异性抗体、胳盤化单域抗体（camelizedsingledomainantibody、纳米抗体、域抗体、分离的⑶R和二价域抗体。抗原结合片段可以与亲本抗体结合相同的抗原。在某些实施方式中，抗原结合片段可以含有来自特定人抗体的一个或多个CDR。[0134]抗体的“Fab”片段是指抗体的单价抗原结合片段，其由一条轻链包括可变区和恒定区）和一条重链的可变区和第一恒定区经二硫键结合组成。Fab可以通过在抗体铰链区的重链之间近二硫键N-末端的残基处经由木瓜蛋白酶消化来获得。[0135]“Fab’”指包含了部分铰链区的Fab片段，其可以通过抗体在铰链区的重链之间的近二硫键C末端的残基处由胃蛋白酶消化来获得，因此其与Fab在铰链区有少量残基包括一个或多个半胱氨酸的不同。[0136]“Fab’）2”是指Fab’的二聚体，其包含两条轻链和两条重链的一部分。[0137]抗体的“Fc”是指由第一重链的第二、第三恒定区经二硫键与第二重链的第二和第三恒定区结合组成的抗体部分。IgG和IgM的Fc区含有三个重链恒定区（在每条链中的第二、第三和第四重链恒定区）。其可以通过抗体的木瓜蛋白酶消化获得。抗体的Fc段负责多种不同的效应功能如ADCC和CDC，但不参与抗原的结合。[0138]抗体的“Fv”段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区结合至一条重链的可变区组成。“dsFv”指二硫键稳定的Fv片段，其单个轻链可变区与单个重链可变区之间的键是二硫键。[0139]“单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个多肽连接子序列连接而成的工程化抗体HustonJS等，ProcNatlAcadSciUSA,85:58791988‘scFv二聚体”是指包含通过连接子连接的两个重链可变区和两个轻链可变区的单链。在某些实施方式中，“scFv二聚体”是二价双功能抗体或二价ScFv；BsFv，其包含与另一Vh-I部分二聚化的Vh-M通过一个肽连接子连接），以使得一个部分的Vh与另一部分的Vl配位并形成能够革G向相同抗原或表位或不同抗原或表位的两个结合位点。在其他实施方式中，“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体，其包含Vhi-Vu通过一个肽连接子连接与Vu-Vh2也是通过一个肽连接子连接结合，以使得¥111与Vu配位且Vh2与Vl2配位，并且每个配位对具有不同的抗原特异性。[0140]“单链Fv-Fc抗体”或“scFv-Fc”是指由scFV连接到抗体Fc区组成的工程化抗体。[0141]“胳盤化单域抗体Camelizedsingledomainantibody”、“重链抗体”、“纳米抗体”或“HCAb”都是指含有两个Vh域而不含有轻链的抗体RiechmannL.和MuyldermansS.，JImmunolMethods.Dec10；2311-2:25-381999；MuyldermansS.,JBiotechnol.Jun;744:277-3022001;W09404678;W09425591;美国专利号6,005，079。重链抗体最初从驼科（骆驼、单峰驼和美洲驼）得到。虽然缺失轻链，骆驼化抗体camelizedantibodies有确证的抗原结合全部功能（Hamers-CastermanC等，Nature.Jun3;3636428:446-81993;NguyenVK.等，“Heavy-chainantibodiesinCamelidae；acaseofevolutionaryinnovation，’’Immunogenetics.Apr;54I:39-472002;NguyenVK.等，Immunology.May;109I:93-1012003。重链抗体的可变区（VHH±或是最小的已知的获得性免疫产生的抗原结合单位Koch-NoIteF.等，FASEBJ.Nov;2113:3490-8.Epub2007Jun152007。“双功能抗体diabody”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段，其中该片段含有在同一条多肽链上相连的Vh域和Vl域VHi或Vh-Vl参见例如HolligerP.等，ProcNatlAcadSciUSA.Jul15;9014:6444-81993;EP404097;W09311161。同一条链上的两个域由于连接子过短而不能配对，因此迫使两个域与另一条链的互补域配对，形成两个抗原结合位点。这两个抗原结合位点可靶向结合相同或不同的抗原或抗原表位）。[0142]“域抗体”是指仅含有重链可变区或轻链可变区的抗体片段。在某些实施方式中，两个或多个Vh域由一个肽连接子共价结合以形成二价或多价域抗体。二价域抗体的两个Vh域可靶向作用于相同或不同的抗原。[0143]在某些实施方式中，“dsFv2”含有三条肽链:两个Vh部分间通过肽连接子相连，并通过二硫键与两个Vl部分结合。[0144]在某些实施方式中，“双特异性ds双功能抗体”含有Vh1-Vl2由肽连接子相连）与Vu-Vh2他是由肽连接子相连通过在VHdPVu间的二硫键结合。[0145]在某些实施方式中，“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”含有三条肽链:VH1-VH2部分，其中两者的重链通过肽连接子如:长的柔性连接子相结合，并通过二硫键分别与Vu和VL2部分配对。每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。[0146]本申请中使用的术语“人源化”或“人源化版本”当用于抗体或抗原结合片段时，是指包括来源于非人动物例如，啮齿动物、家兔、犬、山羊、马或鸡）的CDR、来源于人的FR区，以及来源于人的恒定区（当适用时）的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，来自人抗体的恒定区与非人可变区融合。人源化抗体或抗原结合片段可用作人用治疗剂，因为其与非人物种抗体相比具有降低的免疫源性，或者在人体内诱导免疫应答的可能性更小。在一些实施方式中，所述非人动物是哺乳动物例如小鼠、大鼠、家兔、山羊、绵羊、豚鼠、仓鼠或非人灵长动物（例如，猴（例如，食蟹猴或恒河猴）或猿（例如，黑猩猩、大猩猩、类人猿或猴affen。在一些实施方式中，所述人源化抗体或抗原结合片段除了CDR序列是非人源的以夕卜，基本上全部由人源序列组成。在一些实施方式中，对人源化抗体或抗原结合片段进行修饰以改善抗体性能，如结合或结合亲和性。例如，改变一个或多个非人CDR中的一个或多个氨基酸残基以降低在人体内的潜在免疫原性，其中改变的氨基酸残基对免疫特异性结合不起关键作用，或者改变是保守性改变，以使得人源化抗体与抗原的结合不受到显著影响。在一些实施方式中，所述来源于人的FR区可以包括与其来源的人源抗体相同的氨基酸序列，或其可以包括一些氨基酸改变，例如，不超过1〇、9、8、7、6、5、4、3、2或1个氨基酸改变。在一些实施方式中，该氨基酸改变可以仅存在于重链FR区、仅存在于轻链FR区或同时存在于两个链中。在一些优选实施方式中，所述人源化抗体包括人源FRl-3和人源JH和Jk。[0147]本申请中使用的术语“嵌合”是指具有来源于一个物种的重链和或轻链的一部分，且所述重链和或轻链其余部分来源于不同物种的抗体或抗原结合片段。在一个示例性的例子中，嵌合抗体可以包括来源于人的恒定区和来源于非人动物物种例如小鼠）的可变区。[0148]本申请中使用的“抗-PD-Ll抗体”是指能够特异性结合H-L1例如，人或非人灵长动物ro-i的抗体，其具有足以提供诊断和或治疗用途的亲和性。[0149]在本申请中的“基本上”、“基本上相同”是指两个数值之间具有较高的相似度，并且本领域技术人员将不会识别或考虑这两个值之间有显著差异，或者在由其值所示的统计学和或生物活性方面几乎没有差异。相比之下，“基本上更低”是指数值低于约50%、低于约40%、低于约30%、低于约20%、低于约10%的参照值。[0150]本申请中的“特异性结合”或“特异性的结合”是指，指两分子间的非随机结合反应，如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中，本申请的抗体或抗原结合片段与人和或非人灵长类动物PD-I特异性结合，并且在pH7.4下其结合亲和力（Kd为约0.OlnM至约ΙΟΟηΜ、约0.InM至约100nM、0.OlnM至约10nM、约0.InM至约10nM、0.OlnM至约InM、约0.InM至约InM，或者约0.OlnM至约0.InM。本申请中的Kd是指解离速率与结合速率的比值krffkcj，可通过表面等离子体共振的方法测定，例如使用如Biacore的仪器。[0151]本申请中的“阻断结合”或“竞争相同表位”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合例如人I3D-Ll和抗-PD-Ll抗体的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中，阻断两个分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少50%。在某些实施方式中，这样的抑制作用可以大于60%，大于70%，大于80%，或大于90%。[0152]本申请中使用的术语“表位”是指抗原上与抗原结合蛋白（如抗体结合的特定的原子基团（例如，糖侧链、磷酰基、磺酰基或氨基酸。表位可以是构象型的或线形的。由于蛋白的三维三级折叠，构象型表位可以包含不连续的但在空间上相邻的氨基酸残基，其中这种残基直接有助于相互作用的亲和性，并且在暴露于变性溶剂时将失去相互作用的能力。相比之下，线形表位的所有相互作用位点沿蛋白上的一级氨基酸残基线形排布，并且连续氨基酸的小区段可以由与主要组织相容性复合物MHC分子结合的抗原消化获得，或者在暴露于变性溶剂后被保留Salmer0nA等，JImmunol·1991Nov1;1479:3047-52;Goldsby等，ImmunologyFifthed..NewYork:ff.H.FreemanandCompany.pp.57-75.ISBN0-7167-4947-5。在本公开内容的一个实施方式中，与本申请所述的PD-Ll抗体结合的表位是构象型的。在本公开内容的另一个实施方式中，与本申请公开的ro-Li抗体结合的表位是线形的。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合，则可能结合抗原上的相同表位。例如，如果抗体或抗原结合片段阻断本公开内容的示例抗体如21F11、18G4、4B6、26F5、23A11、23F11、22C9，其嵌合抗体，人源化4B6、人源化23A11和人源化23F11与人PD-I的结合，那么所述抗体或其抗原结合片段可以被认为与那些示例的抗体结合相同的表位。[0153]可以将表位中的特定氨基酸残基突变例如，通过丙氨酸扫描诱变），并且鉴定减少或阻止蛋白结合的突变。“丙氨酸扫描诱变”是一种能够用于鉴定蛋白的某些残基或区域的方法，这些残基或区域影响表位同与其结合的另一化合物或蛋白的相互作用。蛋白中的残基或目标残基组被中性或带负电荷的氨基酸最优选的是丙氨酸或聚丙氨酸，或者保守性氨基酸替代取代。氨基酸残基或编码其的密码子的任何下述突变都可能在与蛋白结合的表位内，该突变对蛋白结合的减少超过阈值，或者对蛋白结合的减少达到高于其他突变的最大程度。在本公开内容的某些实施方式中，对pH依赖性ro-Ll抗体至关重要的表位包含氨基酸残基E58、N63、S80、Y81和I64中的至少一个。[0154]下文中所述的序列可以参见图34。[0155]本申请中的“18G4”是指具有如SEQIDNO:55对应的编码DNA序列为SEQIDNO:93所示的重链可变区和如SEQIDNO:56对应的编码DNA序列为SEQIDNO:94所示的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。其嵌合抗体（即18G4-C18G4-嵌合包含与小鼠可变区融合的IgGl同种型人恒定区。[0156]本申请中的“4B6”是指具有如SEQIDN0:85所示的重链可变区和如SEQIDN0:86所示的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。其嵌合抗体（即4B6-C4B6-嵌合包含与小鼠可变区融合的IgGl同种型人恒定区。将抗体的重链和轻链人源化以产生人源化重链Hl对应于序列SEQIDN0:81;H2对应于序列SEQIDN0:83;H3对应于序列SEQIDN0:65其编码DNA序列为SEQIDN0:99;以及H4对应于序列SEQIDN0:67和轻链LI对应于序列SEQIDNO:82，L2对应于序列SEQIDN0:84，L3对应于序列SEQIDN0:66其编码DNA序列为SEQIDN0:100，以及L4对应于序列SEQIDN0:68，从而产生人源化抗体，如4B6-H3L3、4B6-H3L4、4B6-H4L3和4B6-H4L4。还可以在CHO细胞中产生人源化抗体，用于小规模大规模生产在Fe区的第297位处由N突变为A的抗体。[0157]本申请中的“26F5”是指具有如SEQIDN0:59其编码DNA序列为SEQIDN0:97所示的重链可变区和如SEQIDN0:60其编码DNA序列为SEQIDN0:98所示的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。其嵌合抗体即26F5-C26F5-嵌合包含与小鼠可变区融合的IgGl同种型人恒定区。[0158]本申请中的“21F11”是指具有如SEQIDN0:57其编码DNA序列为SEQIDN0:95所示的重链可变区和如SEQIDN0:58其编码DNA序列为SEQIDN0:96所示的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。其嵌合抗体即21F11-C21F11-嵌合包含与小鼠可变区融合的IgGl同种型人恒定区。[0159]本申请中的“23Α1Γ是指具有如SEQIDN0:73所示的重链可变区和如SEQIDNO:74所示的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。其嵌合抗体S卩23A11-C23A11-嵌合包含与小鼠可变区融合的IgGl同种型人恒定区。将抗体的重链和轻链人源化以产生人源化重链H3对应于序列SEQIDN0:71其编码DNA序列为SEQIDN0:103;H5对应于序列SEQIDN0:69和轻链L3对应于序列SEQIDN0:72，L5对应于序列SEQIDN0:70其编码DNA序列为SEQIDN0:104，从而在293细胞中产生人源化抗体，如23A11-H3L5、23A11-H5L3、23A11-H3L3和23A11-H5L5。还可以在CHO细胞中产生抗体，用于小规模大规模生产在Fe区的297位中由N突变为A的抗体，如23A11-H3L5H3和L5的相应序列分别为SEQIDN0:61和SEQIDNO:62〇[0160]本申请中的“23F11”是指具有如SEQIDN0:79所示的重链可变区和如SEQIDNO:80所示的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。其嵌合抗体S卩23F11-C23F11-嵌合包含与小鼠可变区融合的IgGl同种型人恒定区。将重链和轻链人源化以产生人源化重链H4对应于序列SEQIDN0:75其编码DNA序列为SEQIDN0:105;H6对应于序列SEQIDN0:77和轻链L4对应于序列SEQIDN0:76具有编码DNA的序列SEQIDN0:106，L6对应于序列SEQIDN0:78，从而在293细胞中产生人源化抗体，如23F11-H4L4、23F11-H6L4、23F11-H4L6、23F11-H6L6。还可以在CHO细胞中产生抗体，用于小规模大规模生产在Fe区的297位中由N突变为A的抗体，如23A11-H4L4H4和L4的相应序列分别为SEQIDN0:63和SEQIDN0:64。[0161]本申请中使用的“22C9”指具有如SEQIDN0:21其编码DNA序列为SEQIDNO:101所示的重链可变区和具有SEQIDNO:22其编码DNA序列为SEQIDNO:102所示的轻链可变区的小鼠单克隆抗体。其嵌合抗体（即22C9-C22C9-嵌合包含与小鼠可变区融合的IgGl同种型人恒定区。[0162]当“保守替代”用于氨基酸序列时，是指将一个氨基酸残基用另一个具有相似理化性质的侧链的氨基酸残基替代或用对多肽的活性不起关键作用的那些氨基酸替代。例如，可以在具有非极性侧链的氨基酸残基间（例如，1的）1、¥1、1^11和116、？仰、？1^、1'印）、具有不带电荷的极性侧链的残基间（例如，〇78、361'、1111'、4811、617和6111、具有酸性侧链的残基间（例如，Asp、Glu、具有碱性侧链氨基酸间（例如，His、Lys和Arg、具有β支链侧链的氨基酸间（例如，Thr、Val和lie、具有含硫侧链的氨基酸间（例如，Cys和Met或者具有芳香侧链的残基间（例如，Trp、Tyr、His和Phe进行保守替代。在某些实施方式中，替代、缺失或添加也可以认为是“保守替代”。插入或缺失的氨基酸数量可以在约1至5个范围内。本领域公知保守替代通常不会引起蛋白构象结构的显著变化，因此能够保留蛋白质的生物活性。[0163]当“百分比（％序列同一性”用于氨基酸序列或核酸序列时，是指在进行序列比对，并且必要时引入空位使对应氨基酸或核酸数目达到最多后，在候选序列中，与参比序列相同的氨基酸或核酸残基占所述候选序列的氨基酸或核酸残基的百分比。所述氨基酸残基的保守替代可以认为或可以不认为是相同残基。可以通过本领域公开的工具，例如BLASTN，BLASTp美国国家生物技术信息中心网站NCBI，也可参见AltschulS.F.等、J.Mol.Biol.，215:403-4101990!StephenF.等，NucleicAcidsRes.，25:3389-34021997、ClustalW2欧洲生物信息研究所网站，可参见HigginsD.G.等，MethodsinEnzymology，266:383_4021996;LarkinΜ·Α·等，BioinformaticsOxforcUEngland，2321:2947-82007和ALIGN或MegalignDNASTAR软件，对序列进行比对以确定氨基酸或核酸序列的百分比序列同一性。本领域技术人员可以使用所述工具的默认参数或根据比对的需要适当调整参数，例如通过挑选合适的算法。[0164]本申请使用中的“同源序列”和“同源性序列”可以互换使用，是指与另一序列任选地比对时具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的多核苷酸序列或其互补链或氨基酸序列。[0165]本申请中使用的“T细胞”是指一种在细胞介导的免疫中起关键作用的淋巴细胞，包括辅助T细胞例如，CD4+T细胞、T辅助1型T细胞、T辅助2型T细胞、T辅助3型T细胞、T辅助17型T细胞）、细胞毒性T细胞例如，CD8+T细胞）、记忆T细胞例如，中央记忆T细胞胞）、效应记忆T细胞TEM细胞和TEMRA细胞和常驻记忆T细胞TRM，其为⑶8+或⑶4+、自然杀伤TNKT细胞和抑制性T细胞。[0166]本申请中使用的“效应功能”或“抗体效应功能”是指抗体的Fc区与其效应器例如Cl复合物和Fc受体结合的生物活性。示例性的效应功能包括抗体与Cl复合物上的Clq相互作用诱导的补体依赖性细胞毒性CDC、抗体的Fc区与效应细胞上的Fc受体结合诱导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性ADCC，以及吞噬。“降低或耗竭效应功能”是指抗体效应功能与亲本抗体相比降低至少50%例如，60%、70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%。在某些实施方式中，通过Fe区中消除糖基化的突变例如N297A或D265A以消除效应功能，（参见Shields等，J.Biol.Chem.2769:6591-66042001、K322A、L234AL235A。本申请中使用的“Fc区”是指免疫球蛋白重链的C-末端区域。[0167]本申请中使用的“癌症”或“癌症病况”是指以恶性细胞生长或赘生物、异常增殖、浸润或转移为特征的任何医学病况，并且包括实体肿瘤癌症和非实体癌症（血液恶性肿瘤），如白血病。实体肿瘤包括肉瘤sarcoma和癌carcinoma。肉瘤是在血管、骨豁、脂肪组织、韧带、淋巴管、肌肉或肌腱中的非上皮肿瘤，而癌（carcinoma是在皮肤、腺体和器官内层的上皮肿瘤。本申请中使用的“肿瘤”是指赘生细胞和或恶性细胞的实体团块。[0168]本申请中使用的对某种病况的“治疗treating”、“治疗（treatment”或“疗法”可以互换使用，并且包括治疗性治疗、预防性prophylactic或预防性preventative措施，如预防或减轻病况、减缓病况的发病或发展的速率、减少发展出某种状况的风险，预防或推迟与病况相关的症状发展，减少或终止与病况相关的症状，产生病况的完全或部分消退，治愈病况，或其某些组合。对于癌症而言，“治疗treating”、“治疗treatment”或“疗法”可以指抑制或减缓赘生细胞或恶性细胞生长如与对照相比减小肿瘤体积）、增殖、浸润至其他器官或转移，预防、推迟或停止赘生细胞或恶性细胞生长、增殖或转移的发展，或其某些组合。对于肿瘤而言，“治疗treating”或“治疗treatment”包括根除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长和转移、预防或推迟肿瘤的发展，或其某些组合。“分离的”物质在人工处理后，由自然状态发生改变。如果自然界中出现某种“分离的”成分或物质，那么其发生改变或脱离其原始状态，或二者均有发生。例如，“分离的”多核苷酸或多肽是分别不含其他多核苷酸或多肽的多核苷酸或多肽，并且不与在天然状态下与该多核苷酸或多肽共存的天然组分结合。在某些实施方式中，通过至少一个步骤将“分离的”抗体纯化成纯度至少为90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%，其通过电泳方法如使用考马斯亮蓝或银染进行的SDS-PAGE、等电聚焦、毛细管电泳）、色谱方法（如离子交换色谱或反相HPLC或Lowry法确定。[0169]本申请中使用的“载体”是指，可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入并转运至其中，以在宿主细胞中表达该蛋白的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内得以表达。载体的示例性类型包括但不限于:质粒例如，菌粒、柯斯质粒、酵母人工染色体YAC、细菌人工染色体BAC或Pl衍生的人工染色体PAC、病毒载体噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体或动物病毒）、细菌载体或非游离型哺乳动物载体。用作载体的动物病毒种类包括逆转录病毒包括慢病毒）、腺病毒、腺相关病毒、疱瘆病毒例如，单纯疱瘆病毒）、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒和乳头多瘤空泡病毒如SV40。载体可含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体例如，病毒载体或游离型哺乳动物载体可以含有复制起始位点。载体还可包含协助其进入细胞的成分，包括但不限于，病毒颗粒、脂质体或蛋白衣壳。[0170]本申请中使用的“宿主细胞”是指引入外源多核苷酸和或载体以表达一种或多种外源性蛋白的细胞。其旨在指特定的对象细胞及其后代。宿主细胞可以是原核细胞、真核细胞、植物细胞、动物细胞或杂交瘤。其可以是不能表达所需水平的蛋白但包含该核酸的细胞，除非将调节剂引入细胞或将调控序列引入宿主细胞以使得其与核酸可操作地连接。[0171]本申请中使用的“PD-L1相关病况”是指由PD-L1例如，人PD-L1增加或减少的表达或活性引起、加剧或以其他方式相关的任何病况。[0172]本申请中使用的术语“治疗有效量”或“有效剂量”是指有效治疗与人PD-Ll相关的疾病或病况的药物的剂量或浓度。例如，对于使用本申请公开的抗体或抗原结合片段治疗癌症，治疗有效量是能够减小肿瘤体积、根除全部或部分肿瘤、抑制或减缓肿瘤生长或癌细胞浸润至其他器官、抑制介导癌症病况的细胞生长或增殖、抑制或减缓肿瘤细胞转移、减轻与肿瘤或癌症病况相关的任何症状或标志、阻止或延缓肿瘤或癌症病况进展，或其某些组合的抗体或抗原结合片段的剂量或浓度。[0173]术语“药学上可接受的”是指所指的运载体、载剂、稀释剂、辅料和或盐，总的来说在化学上和或在物理上与制剂中的其他配料相兼容，并在生理上与接受者相兼容。[0174]术语“受体占据”是指在平衡状态下时被配体占据的受体与可用受体总数之比，通常以百分比表示。可以通过测量和比较不同时间点的受体占据情况评估受体占据持续时间。受体占据的测量方法是本领域公知的，如FACS、正电子发射计算机断层显像PET、放射自显影等。[0175]抗-PD-Ll抗体[0176]本公开内容提供了抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段。在某些实施方式中，本公开内容提供了示例性的单克隆抗体21?11、1864、486、26?5、23六11、23?11、2209、其嵌合抗体、人源化4B6、人源化23A11和人源化23F11。[0177]在某些实施方式中，抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段与抗原例如，人I3D-Ll的结合是pH依赖性的。pH依赖性的抗体在生理中性pH即pH7.4下显示出比在酸性pH5.5或6.0下例如，在内涵体pH下更高的抗原结合。此类pH依赖性抗体优选地在内涵体中与抗原解离。当抗原经历抗原介导的清除时，这能够增加抗体的半衰期，因为通过在内涵体中与抗原解离并且再循环离开细胞，PH依赖性抗体能够逃离溶酶体中抗原介导的降解。由于与参照PD-Ll抗体相比，pH依赖性抗体具有改善再循环和延长的血清半衰期的特性，因而治疗性PH依赖性抗体的优点包括更低的剂量不超过参照PD-Ll抗体在另外的情况下为了达到相当的体内治疗效果所需要的剂量的80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%或10%的剂量）或更低的给药频率，两种抗体均达到相当的体内治疗作用。参照抗体是非PH依赖性的，其在酸性和中性pH下与PD-Ll均具有相似的结合，并且其在中性pH下具有与pH依赖性抗体相似的结合。在某些实施方式中，与其具有相同的与PD-Ll的结合的非pH依赖性的版本相比，pH依赖性抗体具有上述优点。[0178]在某些实施方式中，pH依赖性抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段在中性pH例如，pH7.4下与人PD-Ll的特异性结合比在酸性pH下例如，pH6.0、5.5、5.0、4.5或4.0更高。在某些实施方式中，在相同的实验条件下，抗体在酸性pH5.5下与PD-Ll的结合显著低于其在pH7.4下与H-L1的结合。在某些实施方式中，本申请所述的PD-Ll抗体及其抗原结合片段在酸性口!1下的结合至多是其在中性口!18卩7.4下的2%、5%、10%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或85%，其通过ELISA测定。在某些实施方式中，pH依赖性抗-PD-Ll抗体与人I3D-Ll在酸性pH中性pH下的Kd比和或Kciff比是2、3、4、5、8、10、15、20、30、40或100或者更高。在某些实施方式中，在25°：或37°：的酸性?!1下，？!1依赖性抗-PD-Ll抗体与人PD-Ll的解离半衰期t12小于5、4、3、2、1、0.5、0.2或0.1分钟。在某些实施方式中，与在中性pH下的参照I3D-Ll抗体相比，本申请所述的pH依赖性抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段在酸性pH下与人PD-Ll的解离半衰期（t12减少至少约2、3、5、8、10、15、20、30、50或100倍。在某些实施方式中，与在中性pH下具有相似的与I3D-Ll的结合的参照PD-Ll抗体相比，暴露于pH依赖性抗-PD-Ll抗体可以使体内PD-Ll蛋白的量的减少维持更长时间。在某些实施方式中，施用某一剂量后，与相同剂量的参照PD-Ll抗体相比，pH依赖性抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段与人ro-Li结合具有增加的靶器官半衰期。在某些实施方式中，如果抗体及其抗原结合片段在酸性PH和中性pH下与PD-Ll有相似的结合，则其在靶器官中的体内半衰期会较短。在某些实施方式中，靶器官包括但不限于血液或血清、肾、肺、胰脏、肝、胆囊、膀胱、皮肤、食道、卵巢、乳腺、结肠、直肠、胃、脾或脑。[0179]本领域技术人员将理解，可以对本申请所述的CDR序列进行修饰，以包含一个或多个氨基酸残基的取代（或者插入或缺失），以使得所得到抗体一个或多个性质上有所改进如改进的结合或结合亲和性、增加的药代动力学半衰期、PH敏感性、对偶联的相容性、降低的CDR残基上的糖基化和或脱氨基的风险，以及降低的免疫原性），以及其他与亲本抗体相当（即除上述修饰和改变外具有相同CDR序列的抗体），或至少实质上保留了亲本抗体的抗原结合性质。例如，可以利用噬菌体展示技术生产并表达抗体变体库（例如，Fab或scFv变体），随后筛选与人H-L1结合或有结合亲和性的抗体。另一个例子中，可以用计算机软件模拟所述抗体与人PD-Ll的结合并鉴别抗体上形成结合界面的氨基酸残基，来避免这些残基的替代以防止结合或结合亲和性降低，或可以靶向这些残基进行替代以形成更强的结合。在某些实施方式中，CDR序列中的至少一个或全部取代是保守替代。[0180]在某些实施方式中，所述抗体及其抗原结合片段包括一个或多个CDR序列，这些序列与本申请所述的序列具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性，并且同时保留了与其亲本抗体水平相似或甚至更高的与人H-L1的结合活性或结合亲和性，所述亲本抗体具有基本相同的序列，除了其相应的CDR序列与本申请所述的序列具有100%序列同一性。[0181]在某些实施方式中，所述抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段是嵌合的。嵌合抗体含有来自某一抗体的一个或多个区域和来自其他抗体或物种的一个或多个区域。在某些实施方式中，嵌合抗-PD-Ll抗体的至少一个CDR来源于一个物种。在某些实施方式中，所有CDR来源于另一物种。在某些实施方式中，嵌合抗-PD-Ll抗体的可变区来源于一个物种，并且与另一物种的抗体的恒定区连接。嵌合抗体保留了亲本抗体的结合活性或结合亲和性。[0182]在某些实施方式中，所述抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段是人源化的。在某些实施方式中，人源化抗体源自非人物种，并对重链和轻链框架区和恒定区的若干氨基酸残基进行了突变以降低或避免在人体内的免疫原性。在某些实施方式中，将非人物种的可变区与人抗体的恒定区融合。在某些实施方式中，通过⑶R移植产生人源化抗体，即用非人抗体的对应CDR替代人抗体的CDR。这样，人源化抗体在人体内的免疫原性较低。在某些实施方式中，人框架区被CDR序列来源的非人抗体例如，小鼠框架区）的一个或多个氨基酸残基取代以，例如，改善或保持结合活性或结合亲和性。在某些实施方式中，人源化抗体保持或增强亲本抗体的结合活性或结合亲和性。[0183]在一些实施方式中，嵌合的或人源化的抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段包含选自下组的重链可变区：SEQIDN0:21、47、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83和85,以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列；和或选自下组的轻链可变区：SEQIDNO:22、48、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82、84和86，以及与其具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%序列同一性的同源序列。这些人源化抗体保持了与人ro-Li的结合活性或结合亲和性，优选地以与下述示例性抗体之一的结合水平相似:4B6、18G4、26F5、21F11、23A11、23F11、22C9及其嵌合抗体、人源化4B6、人源化23F11和人源化23A11。[0184]在某些实施方式中，PD-Ll抗体486、26?5、21?11、23六11、23?11、2209及其嵌合抗体、人源化4B6、人源化23F11和人源化23A11与人以及非人灵长动物H-L1结合，但不与小鼠PD-Ll结合。在某些实施方式中，PD-Ll抗体例如，18G4及其嵌合抗体以及其抗原结合片段能够与人以及小鼠PD-Ll结合。结合活性或结合亲和性通过如ELISA、放射性配体竞争结合实验和FACS分析确定。[0185]在一些实施方式中，本申请所述的抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段能够以约HT7M或更低例如，l〇_8M、10_9M、10_1M、10_11M、IT12M的结合亲和性0d与人PD-Ll特异性结合，其通过表面等离子体共振结合法测定。结合亲和性可以用Kd值表示，其通过当抗原和抗原结合分子的结合达到平衡时的解离速率与结合速率的比值koffkon计算得到。所述抗原结合亲和性例如Kd可以通过本领域已知的适宜方法适宜地确定，所述方法包括使用仪器如Biacore的表面等离子体共振结合法（参见例如Murphy，M.等，Currentprotocolsinproteinscience,Chapter19,unit19.14,2006。[0186]在某些实施方式中，PD-Ll抗体及其抗原结合片段能够以0.001ygml-lygml例如，0·OOlygml-O·5ygml、0·OOlygml-O·2ygml、0·OOlygml-O·lygml、0·01ygml-〇·2μgml、0·01ygml-〇·lygml、0·01ygml-〇·05ygml、0·01ygml-〇·03ygml或0·001ygml-0·01ygml的EC5Q即50%结合浓度）与hPD-Ll结合，其通过ELISA测定，或者以0·01ygml-lygml例如，0·01ygml-〇·5ygml、0·01ygml-〇·2ygml、0·05ygml_lygml、0·05ygml_0·5ygml或0·05ygml-0·2ygml的EC5q与hPD-Ll结合，其通过FACS测定。可以通过本领域公知的方法测量抗体与人PD-Ll的结合，例如ELISA、FACS、表面等离子体共振、GSTpulldown、表位标签、免疫沉淀、Far-Western、荧光共振能量转移、时间分辨荧光免疫测定TR-FIA、放射免疫测定RIA、酶免疫测定、乳胶凝集、Western印迹和免疫组织化学或者其他结合测定。在一个说明性实例中，测试抗体（即一抗能够与固化的人PD-Ll或表达人PD-Ll的细胞结合，随后洗掉未结合抗体，引入标记的二抗，其能够与一抗结合因此能够检测出结合的一抗。当使用固化的H-L1时，可以使用酶标仪进行检测，或者当使用表达人PD-Ll的细胞时，通过使用FACS分析进行检测。[0187]在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段以0.05ygml-lygml例如，0.05ygml-〇·8ygml、0·05ygml_0·5ygml或0·05ygml_0·3ygml的IC5Q抑制人F1D-I与人]3D-LI的结合，其通过FACS测定，或者以0·001ygml-0·5ygml例如，0·OOlygml-O·2ygml、0·OOlygml-O·lygml、0·OOlygml-O·05ygml、0·OOlygml-O·02ygml、0·005ygml_0·05ygml、0·005ygml-0·02ygml或0·005ygml-0·01ygml的IC5Q抑制人ro-1与人PD-Ll的结合，其通过ELISA测定。[0188]在某些实施方式中，本申请所述的抗体及其片段阻断人PD-Ll与其受体（即人PD-1的结合，从而提供下述生物活性，包括例如从活化的T细胞如CD4+T细胞和CD8+T细胞）中诱导细胞因子产生、诱导活化的T细胞如CD4+T细胞和CD8+T细胞）的增殖以及逆转Treg的抑制功能。示例性的细胞因子包括IL-2和IFNy。术语“IL-2”是指白介素2,是免疫系统中一种调节白血细胞例如，白细胞活性的细胞因子信号分子。术语“干扰素γIFNy”是由自然杀伤NK细胞、NKT细胞、CD4+和CD8+T细胞产生的一种细胞因子，其是巨噬细胞的关键激活剂和主要组织相容性复合物MHC分子表达的诱导剂。可以使用本领域公知的方法确定细胞因子的产生情况，例如，通过ELISA。也可以使用检测T细胞增殖的方法，包括[3H]胸腺嘧啶掺入测定和发光细胞活力测定。[0189]抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段对人PD-Ll和或非人灵长动物是特异性的。在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段不与H-L2例如，人PD-L2结合。例如，与TO-L2的结合亲和性小于与人PD-Ll的结合亲和性的15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。[0190]在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段以0.001ygml-0.5ygml例如，0.001ygml-〇·2ygml、0·OOlygml-O·lygml、0·OOlygml-O·05ygml、0·OOlygml-O·02ygml、0·005ygml_0·05ygml、0·005ygml_0·02ygml或0·005ygml_0·01ygml的EC5Q与非人灵长动物ro-Ll结合，其通过ELISA测定。[0191]抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段对人PD-Ll和或非人灵长动物PD-Ll是特异性的。在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段不与小鼠PD-L1结合。例如，与小鼠PD-L1的结合亲和性小于与人PD-Ll的结合亲和性的15%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%或1%。[0192]在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段不与小鼠PD-Ll结合，但是以与人PD-Ll相似的结合活性或结合亲和性与非人灵长动物PD-Ll结合。例如，在常规结合测定（如ELISA或FACS分析）中，示例性抗体4B6、26F5、2IFlI、23A11、23F11、22C9及其嵌合抗体、人源化4B6、人源化23Fll和人源化23All与小鼠ro-Ll的结合极低，而这些抗体通过ELISA或FACS测定的与非人灵长动物PD-Ll的结合与人PD-Ll类似。在某些实施方式中，抗体及其抗原结合片段如18G4以与人PD-Ll相似的结合活性或结合亲和性与小鼠PD-Ll以及非人灵长动物I3D-Ll结合。[0193]在某些实施方式中，可以将本申请所述的抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段与免疫原性剂联用，如肿瘤细胞、纯化的肿瘤抗原以及转染了编码免疫刺激细胞因子的基因的细胞、肿瘤疫苗。此外，可以将抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段包括在联用疗法中，包括标准化疗和放疗例如，放射疗法、X-射线疗法）、基于靶点的小分子疗法例如，酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼、吉非替尼；单克隆抗体、光动力疗法）、免疫疗法（例如，针对肿瘤标记物的抗体，如癌胚抗原、前列腺特异性抗原、泌尿肿瘤相关抗原、胚胎抗原、酪氨酸酶P97、gp68、TAG-72、HMFG、唾液酸Lewis抗原、MucA、MucB、PLAP、雌激素受体、层粘连蛋白受体、erbB和?155、01^4川〇七吐1、吣忱1123、卩217或者術^、^口〇11^111«?01、1«?02、1«?03或1«?04、新兴的其他免疫检查点调节剂疗法（例如，疫苗）、激素疗法、血管生成抑制（血管生成抑制剂）、基因疗法细胞增殖诱导剂、细胞增殖抑制剂或程序性细胞死亡调节剂）、姑息治疗（即旨在改善护理质量以减轻疼痛例如，吗啡和羟考酮）的治疗、恶心、呕吐（例如，昂丹司琼和阿瑞吡坦）、腹泻和出血的治疗和手术。在某些实施方式中，可以将抗体及其抗原结合片段作为抗体-药物偶联物、双特异性或多价抗体的基础分子。[0194]本申请所述的抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段可以是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、重组抗体、双特异性抗体、标记抗体、二价抗体或抗独特型抗体。重组抗体是在体外使用重组方法而非动物制备的抗体。双特异性抗体或二价抗体是具有两种不同的单克隆抗体的片段的人工抗体，其能结合两种不同的抗原。“二价”的抗体和其抗原结合片段包括两个抗原结合位点。两个抗原结合位点可以结合相同抗原，或者可以各自结合到不同的抗原在这种情况下，抗体或抗原结合片段为“双特异性”）。[0195]在一些实施方式中，本申请所述的抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段是人源化抗体或嵌合抗体。在某些实施方式中，使用重组方法制备人源化抗体或嵌合抗体。例如，可以用合适的抗原（如人I3D-Ll蛋白）免疫非人动物。从小鼠单克隆抗体的基因剪切下编码与抗原结合的抗体可变区的基因片段，并将这一部分与来源于人IgGl的抗体的恒定区基因可操作地连接。将此重组基因片段掺入表达载体，然后将该表达载体引入用于产生嵌合抗体的宿主细胞参见美国专利号4,816,397;4,816,567;5,807,715。[0196]“人源化抗体”是通过将非人源抗体⑶R基因移植到人抗体基因上而获得的抗体，使得可变区框架和恒定区（如果存在全部或基本上来自人抗体序列。用于制备人源化抗体的方法是本领域公知的参见例如美国专利号5,225,539、美国专利号5,530，101、美国专利号6,407,213;美国专利号5,859,205;美国专利号6,881，557^?239400^?125023、¥09007861和W09602576。在某些实施方式中，人源化抗体包含人源化重链和人源化轻链。在某些实施方式中，在人源化I3D-Ll抗体中移植的⑶R序列与对应的⑶R至少60%、70%、80%、82%、85%、88%、90%、95%或100%相同。在某些实施方式中，在人源化PD-I抗体的CDR中存在不超过3个连续的氨基酸取代。在某些实施方式中，将人源化PD-Ll抗体可变区框架的氨基酸残基取代以进行序列优化。在某些实施方式中，人源化ro-Li抗体链的可变区框架序列与对应的人可变区框架序列至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%相同。[0197]在一些实施方式中，抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段是骆驼化单域抗体camelizedsinglechaindomainantibody、双功能抗体diabody、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、（dsFv2、dsFv_dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、Fab’）2、ds双功能抗体（dsdiabody、纳米抗体、域抗体、分离的⑶R或双价域抗体。[0198]在一些实施方式中，抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段还包含免疫球蛋白恒定区。在一些实施方式中，免疫球蛋白恒定区包含重链和或轻链恒定区。重链恒定区包含CHl、CH1-CH2或CH1-CH3区。在一些实施方式中，恒定区还可以包含一个或多个修饰以使其具有所需的性质。例如，可以对恒定区进行修饰以降低或消除一个或多个效应功能，以改善FcRn受体结合，或引入一个或多个半胱氨酸残基。[0199]在某些实施方式中，抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段具有改善的热稳定性。本申请中使用的术语“热稳定性”或“耐热性”是指抗-PD-Ll抗体的功能稳定性，而不是热力学性质，以及指抗体对由热和或物理化学操作导致的不可逆变性的抗性，所述操作包括但不限于:加热、冷却、冷冻、冻融循环、振荡、涡旋、超声、化学变性剂、PH、去垢剂、盐、添加剂、蛋白酶或温度。不可逆变性导致抗体的功能构象不可逆的解折叠、生物活性丧失和变性蛋白的聚集。可以通过测量配体结合或通过使用对在升高温度下的解折叠敏感的光谱法如荧光、圆二色光谱CD或光散射确定热稳定性的增加情况。本申请所述的PD-Ll抗体能够增加热稳定性，其通过在有功能构象的状态下至少2°C、至少5°C、至少8°C、至少10°C、至少15°C、至少2O°C或至少3O°C下热稳定性的增加测定。本申请所述的抗体的热稳定性可以通过以下方法检测，例如通过差示扫描荧光法（DSF或差示扫描量热法DSC参见HeF等，JPharmSci.2011Apr；1004:1330-40.，其中测得热转变中点（Tm，结果表明蛋白在液体中相对稳定。在某些实施方式中，PD-Ll抗体的Tm高于74°C、高于76°C、高于78°C、高于80°C、尚于82C、尚于84C、尚于86C、尚于88C、尚于90C、尚于92C、尚于94C、尚于96C或尚于98°C。在某些实施方式中，具有改善的热稳定性的PD-Ll抗体是23F11例如，23F11-H4L4、23A11-H6L4、23A11-H4L6或23A11-H6L6，其热转变中点（Tm高于90°C。[0200]在一些实施方式中，抗-PD-Ll抗体及其抗原结合片段进一步形成抗体-药物偶联物ADC。可以设想，可以将多种有效载荷与本申请所述的抗体或抗原结合片段连接参见例如“ConjugateVaccines”，ContributionstoMicrobiologyandImmunology,J.M.CruseandR.E.Lewis，Jr·编），CargerPress，纽约（1989。术语“有效载荷”可以与“药物”互换使用，并且这些有效载荷可以通过共价结合、亲和结合、嵌入、同等结合coordinatebinding、络合、结合、混合或加入等其他方式与所述抗体或抗原结合片段连接。在某些实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段可以通过工程化的方法使其含有表位结合部分以外的特定位点，这些位点可用来结合一种或多种有效载荷，如肽、核酸分子、药物、细胞毒素、多肽、蛋白、融合蛋白、抗体、半抗原、小分子、模拟剂、合成药物、无机分子、有机分子、放射性核素和报告基团。例如，这种位点可以包括一个或多个反应性氨基酸残基，如半胱氨酸组氨酸残基，以促进其与有效载荷的共价连接。在某些实施方式中，抗体可以通过接头，或通过另一有效载荷，与有效载荷间接连接。例如，抗体或抗原结合片段可以与生物素偶联，然后与同亲和素偶联的第二有效载荷间接偶联。有效载荷可以是报告基团或可检测的标记、药代动力学修饰部分、纯化部分或细胞毒性部分。可检测的标记的例子可以包括荧光标记例如，荧光素、罗丹明、丹酰、藻红蛋白或德克萨斯红）、酶-底物标记物例如，辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、荧光素酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶或β-D-半乳糖苷酶）、放射性同位素例如，123I、124I、125I、131I、35S、3H、mIn、112In、14C、64Cu、67Cu、86Y、88Y、9QY、177Lu、211At、186Re、188Re、153Sm、212Bi和32P、其他镧系元素、发光标记）、发色团部分、地高辛、生物素亲和素、DNA分子或金以进行检测。在某些实施方式中，有效载荷可以是药代动力学修饰部分如PEG，其帮助延长抗体的半衰期。其他适宜的聚合物包括例如羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、乙二醇丙二醇共聚物等。在某些实施方式中，有效载荷可以是纯化部分例如磁珠。“细胞毒性”部分的有效载荷可以是对细胞有害的或可能损坏或杀死细胞的任何试剂。细胞毒性部分的示例包括，但不限于:化疗剂、抗肿瘤剂、生长抑制剂、药物、毒素，如紫杉醇、细胞松弛素B、短杆菌肽D、溴化乙锭、吐根碱、丝裂霉素、依托泊苷、替尼泊苷、长春新碱、长春碱、秋水仙碱、阿霉素、柔红霉素、二羟基炭疽菌素二酮、米托蒽醌、光神霉素、放线菌素D、l-去氢睾酮、糖皮质激素、普鲁卡因、丁卡因、利多卡因、普萘洛尔、嘌呤霉素及其类似物、抗代谢物例如，甲氨蝶呤、6-巯基嘌呤、6-硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、5-氟尿嘧啶达卡巴）、烷化剂例如，氮芥、塞替派苯丁酸氮芥、美法仑、卡莫司汀BSNU和洛莫司汀CCNU、环磷酰胺、白消安、二溴甘露醇、链脲霉素、丝裂霉素C和顺-二氯二胺铂IIDDP顺铂）、蒽环类抗生素例如，柔红霉素（以前称为道诺霉素和阿霉素）、抗生素例如，更生霉素（以前称为放线菌素）、博来霉素、光神霉素、铂类例如，顺铂和奥沙利铂）、植物生物碱例如，拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱、紫杉烷和表鬼臼毒素和氨茴霉素AMC以及抗有丝分裂剂例如，长春新碱和长春碱）。本申请中使用的术语“载荷”或“药物载荷”或“有效载荷”是指每个抗体的平均药物有效载荷数。药物载荷可以在每个抗体1至20例如，1至15、1至10、2至10、1至8、2至8、2至6、2至5或2至4个药物的范围内池称为药物与抗体之比），其通过本领域中的适宜方法确定，如质谱、UV可见光谱、ELISA测定和HPLC。在某些实施方式中，药物载荷是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。[0201]多核苷酸和重组方法[0202]本公开内容提供了编码抗-PD-Ll抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸。在某些实施方式中，所述分离的多核苷酸包括一个或多个核苷酸序列，其编码本公开内容中所述的⑶R序列。[0203]产生单克隆抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段的方法包括：用人PD-Ll蛋白或产生hPD-Ll的细胞免疫适宜的动物。动物可以是小鼠、大鼠、绵羊、山羊、家兔或豚鼠。使用脾脏或淋巴结产生杂交瘤，或者收集免疫动物的B细胞并测量PD-Ll抗体滴度。用适宜滴度的杂交瘤或来自免疫动物的B细胞克隆，来克隆编码PD-Ll抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。将克隆的或经修饰的（例如，嵌合的、人源化的）多核苷酸掺入适宜载体，然后将该载体引入宿主细胞以产生本公开内容所述的抗体。可以通过培养宿主细胞，随后分离和纯化宿主细胞或培养液例如，上清液），获得基本上纯净且均一形式的本申请所述的抗体及其抗原结合片段。可以采用用于多肽纯化的常规方法分离和纯化抗体或其抗原结合片段。[0204]在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码重链可变区并包括选自下组的序列：SEQID冊：93、95、97、99、101、103和105，以及与之具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性的同源序列。在一些实施方式中，所述分离的多核苷酸编码轻链可变区并包括选自下组的序列：SEQID勵:94、96、98、100、102、104和106，以及与之具有至少80%例如，至少85%、88%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%的序列同一性的同源序列。在某些实施方式中，所述同一性的百分比是源自遗传密码的简并性，而编码的蛋白序列保持不变。[0205]使用本领域公知的重组技术，可以将编码所述抗-PD-Ll抗体和其抗原结合片段的分离的多核苷酸插入载体用于进一步克隆扩增DNA或用于表达。在另一实施方式中，所述抗体可通过本领域公知的同源重组的方法制得。编码所述单克隆抗体的DNA可以通过常规的方法分离和测序如可以使用寡核苷酸探针，该探针可特异性与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合）。多种载体可供选择。载体组分通常包括，但不限于，以下的一种或多种：信号序列（例如，翻译信号或前导序列）、复制起始点、一种或多种选择性标记基因、增强子元件、启动子例如，SV40、CMV、EF-Ια和转录终止序列。[0206]在一些实施方式中，所述载体系统包括哺乳动物、细菌、酵母系统等，并包括质粒例如但不限于PALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pCMV、pEGFP、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS420、pLexA、pACT2·2、pCDM8、pCDNAl·1amp、pcDNA3·I、pRcRSV、pEF-1、pCMV-SCRIPT·RTM·、pFB、pSG5、pXTI、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等，以及其他可从实验室获得或市售的表达载体。适宜的载体可以包括质粒或病毒载体例如，复制缺陷型逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒）。载体可以维持单一拷贝或多个拷贝，或者整合至宿主细胞基因组中。可以将包括编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸序列的载体引入宿主细胞用于复制或基因表达。适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞为原核细胞、酵母、昆虫细胞或上述高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包括真细菌如，革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌，例如肠杆菌科，如肠杆菌属，例如大肠杆菌，肠杆菌，欧文氏菌属，克雷白氏杆菌属，变形杆菌属，沙门氏菌属，如，鼠伤寒沙门（氏杆菌，沙雷氏菌属，如，粘质沙雷氏菌，以及志贺氏菌属，及杆菌属，如枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，假单胞菌，如绿脓杆菌和链霉菌，芽孢杆菌，链球菌，链霉菌，葡萄球菌，肠球菌，乳酸杆菌，乳球菌，梭菌，土芽孢杆菌，海洋杆菌，假单胞菌，沙门氏菌，弯曲杆菌，螺杆菌，黄杆菌，梭杆菌，泥杆菌，奈瑟氏菌和脲原体。适宜的昆虫细胞包括果绳SchniederS2细胞和SfO。适宜的酵母包括甲醇毕赤酵母、巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母或普通面包酵母。优选的哺乳动物细胞包括CHO细胞、HEK293细胞、淋巴细胞和骨髓瘤。在某些实施方式中，当不需要抗体的糖基化和Fc效应功能时，抗体可以在细菌中产生。[0207]除了上面的例子以外，许多其他属、种和株都比较常用且在本发明中适用，如粟酒裂殖酵母;克鲁维酵母属宿主，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母ATCC12,424、保加利亚克鲁维酵母ATCC16,045、魏氏克鲁维酵母ATCC24,178、克鲁雄酵母ATCC56，500、果蝇克鲁维酵母ATCC36,906、耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母;解脂耶氏酵母EP402,226;巴斯德毕赤酵母EP183,070;假丝酵母;里氏木霉EP244,234;链孢霉;许旺酵母，如西方许旺酵母;和丝状真菌，如脉孢菌、青霉菌、弯颈霉和曲霉菌，如钩巢曲霉和黑曲霉。[0208]本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株baculoviralstrains及其变体以及对应的容许性昆虫宿主细胞permissiveinsecthostcells，来自于诸如以下的宿主:草地夜蛾（毛虫）、埃及斑蚊蚊子）、白纹伊蚊蚊子）、黑腹果蝇果蝇及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得，例如苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的L-I变体和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种，这些病毒都可在本发明中使用，特别是用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿和烟草的植物细胞培养也可用作宿主。[0209]但是，脊椎动物细胞最为重要，且培养的脊椎动物细胞组织培养）的扩增已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有，SV40转化的猴肾细胞CVl系（C0S-7,ATCCCRL1651;人胚胎肾细胞系（293或悬浮培养的293细胞亚克隆，Graham等，J.GenVirol.36:591977;幼地鼠肾细胞BHK，ATCCCCL10;中国仓鼠卵巢细胞-DHFRCH0，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77:42161980;小鼠睾丸支持细胞（TM4，Mather,Biol·Reprod·23:243-2511980;猴肾细胞（CV1ATCCCCL70;非洲绿猴肾细胞〇^尺0_76，ATCCCRL-1587;人宫颈癌细胞HELA，ATCCCCL2;犬肾细胞MDCK，ATCCCCL34;布法罗大鼠肝细胞BRL3A，ATCCCRL1442;人肺细胞W138，ATCCCCL75;人肝细胞癌细胞HepG2，HB8065;小鼠乳腺瘤MMT060562，ATCCCCL51;TRI细胞Mather等，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383:44-681982;MRC5细胞；FS4细胞；PC12;小鼠胚胎成纤维细胞系3T3;NSO骨髓瘤细胞不能内源性产生任何功能性免疫球蛋白链的鼠骨髓瘤细胞系）。不同的宿主细胞具有蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰的各种特征和机制。因此，可以选择适宜的细胞系作为宿主细胞以确保对所表达抗体正确的修饰和加工如初级转录物、糖基化和磷酸化）。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是HEK293T细胞。在一些优选的实施方式中，宿主细胞是CHO细胞。[0210]用上述的可产生抗-PD-Ll抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞，并将其在常规的营养培养基中培养，所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码目的序列的基因。在某些实施方式中，可以采用本领域公知的方法将载体转移进入宿主细胞，如转化、电穿孔、磷酸钙处理、脂质体转染。在某些实施方式中，将载体转染进入真核细胞包括磷酸钙共沉淀、显微注射、电穿孔、脂质体转染和病毒感染。可以将真核宿主细胞与编码抗体的第二多核苷酸共转化。在某些实施方式中，含有转染载体的宿主细胞能够瞬时表达抗-PD-Ll抗体。[0211]本发明中用于生产所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham’sFlOSigma、最低基本培液MEMSigma、RPMI-1640Sigma及Dulbecco’sModifiedEagle’sMediumDMEMSigma，Luria肉汤（LB和Terrific肉汤TB可用于培养所述宿主细胞。另外，任何在Ham等，Meth.Enz.58:441979,Barnes等，Anal.Biochem.102:2551980，美国专利号4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;或5，122，469;TO9003430;TO8700195;或美国专利申请Re.30，985中描述的培养基都可以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和或其他生长因子如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子）、盐类（如氯化钠、氯化钙、氯化镁和磷酸盐）、缓冲液如HEPES、核苷酸如腺苷酸和胸腺嘧啶）、抗生素如庆大霉素）、微量元素定义为终浓度通常在微摩尔范围无机化合物），和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件，如温度、pH值等类似条件，为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件，为普通技术人员所熟知。[0212]在使用重组技术时，所述抗体及其抗原结合片段可在胞内、壁膜空间生成，或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成，首先除去宿主细胞或裂解片段的颗粒残骸，例如，可通过离心或超声的方法。Carter等，BioTechnology10:163-1671992描述了将分泌到大肠杆菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说，在醋酸钠pH3.5、EDTA和苯甲磺酰氟PMSF存在的条件下解冻细胞糊cellpaste约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体及其抗原结合片段分泌到培养基中，则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器，如Amicon或MilliporePelIicon超滤单元，浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解，以及抗生素以防止偶然污染物的生长。[0213]从所述细胞中制得的抗体可采用纯化方法进行纯化，例如羟磷灰石色谱、疏水色谱、反相色谱、吸附色谱、过滤、超滤、溶剂沉淀、溶剂提取、蒸馏、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、透析、DEAE-纤维素离子交换色谱柱、硫酸铵沉淀、盐析、免疫沉淀、等电聚焦、重结晶以及亲和色谱，其中亲合色谱为优选的纯化技术。所述抗体的种类以及所述抗体中存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化基于人γΐ，γ2或γ4重链的抗体Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-131983。蛋白A柱的实例包括HyperD、P0R0S和SepharoseFFGEHealthcareBiosciences。蛋白G适用于所有鼠源同种型和人γ3Guss等，EMBOJ.5:156715751986。琼脂糖是最常用的亲和配体附着基质，但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻璃或聚苯乙烯苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含有CH3结构域，则可用BakerbondABX.TM树脂进行纯化J.T.Baker，Phi11ipsburg，N.J.。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术，如离子交换柱中的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖，疑胶色谱如聚天冬氨酸柱）、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。[0214]在任意初步纯化步骤之后，可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有目的抗体和杂质的混合物，用pH约2.5-4.5的洗涤缓冲液，优选地在低盐浓度下进行例如，从约0到0.25M盐浓度）。[0215]试剂盒[0216]本公开内容提供了试剂盒，所述试剂盒包含抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段，或者包含本申请所述的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段的药物组合物。在一些实施方式中，所述试剂盒用于检测生物样品中ro-Li的存在情况或水平。生物样品可以包含细胞或组织。[0217]在一些实施方式中，在试剂盒中包含的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段与可检测标记偶联例如，荧光、放射性或酶标记）。在某些其他实施方式中，试剂盒包含未标记的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段，或者含有未标记的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段的药物组合物，并且进一步包含能够与未标记的抗-PD-Ll抗体结合的第二标记抗体。试剂盒可以进一步包括检测标记的手段例如，用于检测荧光标记的滤波器组，用于酶标记的酶底物等）。试剂盒可以包含用于进行特定方法的其他试剂和缓冲剂。试剂盒可以进一步包含使用说明书，以及分隔试剂盒中各成分的包装。在某些实施方式中，试剂盒包含用于检测PD-Ll抗体的免疫测定。[0218]在某些实施方式中，在试剂盒中包含的抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段与用于夹心测定如ELISA或用于免疫成像测定的底物或装置相关。可用的底物或装置可以是例如酶标板和检测试纸。[0219]在某些实施方式中，提供了用于检测PD-Ll蛋白水平的试剂盒。在一些实施方式中，试剂盒用于预测、诊断、预防或治疗与ro-Li相关的病况。[0220]药物组合物和治疗方法[0221]本公开内容进一步提供了包括抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段和一种或多种药学上可接受的运载体的药物组合物。[0222]用在本申请公开的药物组合物中的药用可接受载剂可包括，例如，药用可接受的液体、凝胶或固体运载体、水相介质、非水相介质、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料或无毒辅助物质，其他本领域公知的组分或以上的多种组合。[0223]适用的组分可包括，例如，抗氧剂、保湿剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂、着色剂、乳化剂或稳定剂例如糖和环糊精。适用的抗氧剂可包括，例如，甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲苯和或没食子酸丙酯。如本发明所公开，在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸，可将降低所述抗体或其抗原结合片段的氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合活性或结合亲和力的降低，从而提高抗体稳定性并延长保质期。因此，在某些实施方式中，本发明提供的组合物中含有一种或多种所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种抗氧剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供了多种方法，通过将本发明中提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧剂混合，例如甲硫氨酸，可防止所述抗体或其抗原结合片段氧化、延长其保质期和或提高其活性。适宜的保湿剂包括乙二醇、甘油或山梨醇。适宜的润滑剂包括，例如，鲸酯蜡、氢化植物油、硬脂酸镁、硬脂酸甲酯、矿物油、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物、聚乙二醇、聚乙烯醇、十二烷基硫酸钠或白蜡，或者其两种或多种的混合物。适宜的乳化剂包括卡波姆、聚氧乙烯-20-十八烷基醚、十六十八醇、十六醇、胆固醇、硬脂酸二甘醇酯、硬脂酸甘油酯、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羊毛脂、聚氧乙烯十二烷基醚、甲基纤维素、聚氧乙烯硬脂酸酯、聚山梨醇酯、丙二醇单硬脂酸酯、脱水山梨醇酯或硬脂酸。[0224]进一步的说，药用可接受的运载体可包括，例如，水相介质如氯化钠注射液、林格氏液注射液、等渗葡萄糖注射液、无菌水注射液、或葡萄糖和乳酸林格注射液、非水介质例如:植物来源的不挥发性油、棉花子油、玉米油、芝麻油、或者花生油、细菌抑制或真菌抑制浓度下的抗菌物质、等渗剂如:氯化钠或葡萄糖、缓冲液如:磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液，抗氧化剂如:硫酸氢钠，局部麻醉剂如:盐酸普鲁卡因，助悬剂和分散剂如:羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素或聚乙烯吡咯烷酮，乳化剂如：聚山梨醇酯80吐温-80、螯合试剂如EDTA乙二胺四乙酸或EGTA乙二醇四乙酸）、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合物中，其包括酚类或甲酚、汞制剂、苯甲醇、氯代丁醇、甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包括，例如，水、盐、葡萄糖、甘油或乙醇。适用的无毒辅助物质可包括，例如，润湿剂或乳化剂、PH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂，或者醋酸钠、去水山梨糖醇月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯或者环糊精之类的物质。[0225]所述药物组合物可以是液体溶液、悬浮液、乳剂、乳液、泡沫、丸剂、胶囊、片剂、持续释放制剂、软膏剂、乳膏剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或粉末。口服制剂可以包括标准载体如药物级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。[0226]在某些实施方式中，所述药物组合物被制剂成可注射的组合物。可注射的药物组合物可以任何常规的形式制备，例如，液体溶剂、悬浮剂、乳化剂或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂的固体形式。注射制剂可包括现用于注射的无菌和或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌干燥的可溶物，如冻干粉，包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无菌干燥不溶产品，和无菌和或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。[0227]在某些实施方式中，单位剂量的胃肠外制剂包装在安瓿、药瓶或带有针头的针筒中。本领域习知，所有胃肠外给药的制剂应为无菌无热原。[0228]在某些实施方式中，通过将本申请公开的抗体或其抗原结合片段溶解于适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有提高稳定性的赋形剂或者粉末状或由粉末制备的重构溶液的其他药理成分。适用的赋形剂包括，但不限于，水、葡萄糖、三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲液，如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸钾缓冲液或其他本技术人员公知的缓冲液，在一个实施方式中，缓冲液的PH为中性。在本领域公知的标准条件下对所述溶解进行随后的过滤除菌，然后冻干制得理想的制剂。在一个实施方式中，将所得的溶液分装至药瓶中冻干。每支药瓶可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段或其组合物。每支药瓶中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需例如，10%过量），从而保证取样准确和给药准确。冻干粉可在适当的条件下储存，如在约4°C到室温范围。[0229]用注射用水将冻干粉重构得到用于胃肠外给药的制剂。在一个实施方式中，可将冻干粉加至无菌和或无热原水或其他适用的液体载剂中重构。精确的量由选择的疗法决定，可根据经验确定。[0230]还提供了用于治疗PD-Ll相关病况的治疗方法，包括将治疗有效量的本申请所述的PD-Ll抗体或其抗原结合片段施用给个体，由此治疗或预防与PD-Ll相关的病况或病症。在另一个实施方式中，还提供了治疗会从上调的免疫应答获益的个体的病况的方法，包括对所述需要其的个体施用治疗有效量的本申请所述的I3D-Ll抗体。[0231]本申请中提供的抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量当单独使用或与其他药剂如化疗剂联用时）依赖于本领域公知的多种因素，例如所治疗的疾病类型、抗体类型、体重、年龄、过往病史、现用治疗、个体的健康状况、免疫状况和交叉反应的潜在可能性、过敏、敏感和副作用，以及给药途径和类型、疾病的严重程度和进展，以及主治医师或兽医的判断。在某些实施方式中，本申请所述的抗体或抗原结合片段可以每日一次或多次以约0·01mgkg至约100mgkg例如，每日一次或多次以约0·01mgkg、约0·3mgkg、约0·5mgkg、约lmgkg、约3mgkg、约5mgkg、约10mgkg、约15mgkg、约20mgkg、约25mgkg、约30mgkg、约35mgkg、约40mgkg、约45mgkg、约50mgkg、约55mgkg、约60mgkg、约65mgkg、约70mgkg、约75mgkg、约80mgkg、约85mgkg、约90mgkg、约95mgkg或约100mgkg的治疗有效剂量施用。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段以约50mgkg或更低的剂量施用，在某些实施方式中，剂量为20mgkg或更低、10mgkg或更低、3mgkg或更低、lmgkg或更低、0·3mgkg或更低，或者0.lmgkg或更低。在某些实施方式中，施用剂量可以在治疗过程中改变。例如，在某些实施方式中，初始施用剂量可以高于随后的施用剂量。在某些实施方式中，可以在治疗过程中根据个体的反应改变施用剂量。[0232]给药方案可通过调整达到最佳所需应答例如，治疗应答）。在某些实施方式中，一次性地或在一系列的治疗中向个体施用本申请所述的抗体或抗原结合片段。在某些实施方式中，取决于疾病的类型和严重程度，通过一次或多次的单独施用，或通过连续输注，向个体施用本申请所述的抗体或抗原结合片段。指导可见于例如美国专利号4,657,760;5,206，344；5,225,212〇[0233]本发明中公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的任何给药途径给药，例如胃肠外给药例如，皮下注射、腹腔注射、静脉注射，包括静脉输注、肌肉注射或皮内注射）或非胃肠外给药例如，口服给药、鼻内给药、眼内给药、舌下给药、直肠给药或局部给药途径。[0234]在某些实施方式中，可以以控释方式施用本申请公开的抗体和抗原结合片段。可以将控释胃肠外制剂制成植入物、油性注射剂或微粒系统例如，微球、微粒、微囊、纳米胶囊、纳米球和纳米颗粒）（参见Banga,A.J.,TherapeuticPeptidesandProteins:Formulation,Processing,andDeliverySystems,TechnomicPublishingCompany,Inc.,Lancaster,Pa.,1995；Kreuter,J.,ColloidalDrugDeliverySystems,J.Kreuter编，MarceIDekker,Inc·，纽约州纽约，pp.219_3421994;TiceTabibi,TreatiseonControlledDrugDelivery，A·Kydonieus编，MarcelDekker,Inc.NewYork，纽约州纽约，pp.315-339,（1992。在某些实施方式中，可以在可降解或不可降解的聚合物基质中施用本申请公开的PD-Ll抗体和抗原结合片段（参见Langer,AccountsChem.Res.26:537-542,1993〇[0235]与PD-Ll相关的病况可以是与免疫相关的疾病或病症。在某些实施方式中，病况是实体瘤、血液病、传染病、自身免疫性疾病或纤维化疾病。在某些实施方式中，实体瘤包括例如非小细胞肺癌鳞状非鳞状）、小细胞肺癌、肾细胞癌、结直肠癌、结肠癌、卵巢癌、乳腺癌包括基底乳腺癌、导管癌和小叶乳腺癌）、胰腺癌、胃癌、膀胱癌、食道癌、间皮瘤、黑色素瘤、头颈癌、甲状腺癌、肉瘤、前列腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、胸腺癌，黑色素瘤、骨髓瘤、真菌病、梅克尔细胞癌、肝细胞癌HCC、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、淋巴恶性肿瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤。血液系统病症包括如经典型霍奇金氏淋巴瘤CHL、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤、富含T细胞组织细胞的B细胞淋巴瘤、急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性髓性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞、骨髓单核细胞、单核细胞白血病和红白血病、慢性髓细胞性粒细胞性）白血病、慢性髓性白血病、慢性淋巴细胞白血病、真性红细胞增多症、肥大细胞衍生的肿瘤、EBV-阳性和阴性PTLD、弥漫性大B细胞淋巴瘤DLBCL、浆母细胞淋巴瘤，结外NKT细胞淋巴瘤、鼻咽癌、与HHV8相关的原发性渗出性淋巴瘤、非霍奇金氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓发育不良综合征、毛细胞白血病和骨髓发育不良、中枢神经系统肿瘤CNS，如原发性CNS淋巴瘤、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、星形细胞瘤、成神经管细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑色素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤。在某些实施地方时中，肿瘤和癌症是转移性的，特别是表达PD-Ll的转移性肿瘤。在某些实施方式中，肿瘤是黑色素瘤或结肠癌。[0236]在某些实施方式中，与H-L1相关的病况和病症包括自身免疫性或炎性疾病，如系统性红斑狼疮SLE、肠粘膜炎症，与结肠炎相关的消耗性疾病、多发性硬化、病毒感染、类风湿性关节炎、骨关节炎、克罗恩病和炎性肠病、牛皮癣、系统性硬皮病、自身免疫性糖尿病等。在某些实施方式中，与PD-Ll相关的病况或病症包括传染病，如真菌感染、寄生虫原生动物感染或慢性病毒感染，例如球孢子菌病、组织胞浆菌病、甲真菌病、曲霉菌病、芽生菌病、白色念珠菌病、副球孢子菌病、微孢子虫病、棘阿米巴角膜炎、阿米巴病、蛔虫病、巴贝斯虫病、小袋纤毛虫病、贝利斯蛔虫病、南美锥虫病、华支睾吸虫病、锥蝇病、隐孢子虫病、裂头绦虫病、麦地那龙线虫病、包虫病、象皮病、蛲虫病、肝片吸虫病、姜片虫病、丝虫病、贾弟虫病、颚口线虫病、膜壳绦虫病、等孢球虫病、片山热、利什曼病、莱姆病、疟疾、后殖吸虫病、蝇蛆病、盘尾丝虫病、虱病、疥疮、血吸虫病、昏睡病、类圆线虫病、绦虫病、弓蛔虫病、弓形虫病、旋毛虫病、鞭虫病、锥虫病、蠕虫感染、乙肝病毒HBV感染、丙肝病毒HCV感染、疱瘆病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、HIV、巨细胞病毒、I型单纯疱瘆病毒、II型单纯疱瘆病毒、人乳头瘤病毒、腺病毒、I型人免疫缺陷病毒、II型人免疫缺陷病毒、与卡波西氏肉瘤相关的疱瘆病毒流行病、细环病毒Torqueteno病毒）、I型人T淋巴细胞病毒、II型人T淋巴细胞病毒、水痘带状疱瘆、JC病毒或BK病毒。在某些实施方式中，与F1D-Ll相关的病况包括纤维化疾病，如肾小球肾炎、神经瘢痕、皮肤瘢痕、肺部纤维化、肺纤维化、辐射诱发的纤维化、肝纤维化、骨髓纤维化。[0237]使用方法[0238]本公开内容还提供了使用抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段的方法。[0239]在一些实施方式中，本公开内容提供了治疗个体中与PD-Ll相关的病况的方法，所述方法包括向个体施用治疗有效量的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，个体已被鉴定为患有可能对I3D-Ll拮抗剂产生应答的疾病或病况。在某些实施方式中，本公开内容提供了预防、检测或诊断与PD-Ll相关的病况的方法，所述方法包括将本申请所述的PD-Ll抗体或其抗原结合片段与获取自疑似患有或患有与PD-Ll相关的病况，或处于与PD-Ll相关的病况的风险中的个体的生物样品接触，并确定与生物样品中的ro-Li结合的ro-Li抗体或其抗原结合片段的水平。[0240]对于治疗与ro-Ll相关的病况，个体被检测为ro-Ll表达阳性，或被检测为PD-Ll表达水平升高。可以使用各种方法来确定来自个体的测试生物样品中的PD-Ll存在情况或水平。例如，可以将测试生物样品暴露于抗-PD-Ll抗体或其抗原结合片段，其与PD-Ll蛋白结合并检测其表达。或者，还可以使用诸如qPCR、逆转录PCR、微阵列、SAGE、FISH等的方法在核酸表达水平对ro-Li进行检测。在一些实施方式中，测试样品来源于癌细胞或组织例如，来自器官的活检组织）、肿瘤浸润免疫细胞或体液例如，血液或血清）。在某些实施方式中，在测试生物样品中存在ro-Ll或其水平上调表明可能产生应答。在本申请中所使用的术语“上调”指与使用相同抗体检测的参照样品中PD-Ll蛋白水平相比，使用本申请所述的抗体或其抗原结合片段在测试样品中检测的PD-Ll蛋白水平的总的增加不少于10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%或更多。参照样品可以是从健康或无疾病的个体中获得的对照样品，或者是从测试样品来源的个体中获得的健康或无疾病的样品，或者是在治疗病况过程中的较早时间点从同一个体获得的样品。例如，参照样品可以是与测试样品（例如，肿瘤临近或在其附近的无病样品。[0241]本申请公开的抗体或抗原结合片段可单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如，本申请公开的抗体或抗原结合片段可以与第二疗法联合施用，如放疗、化疗、革G向疗法、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息疗法、用于治疗癌症的手术例如，肿瘤切除术）、用于化疗引起的并发症的一种或多种止吐药或其他治疗，或者用于治疗由ro-Li介导的癌症或任何医学病症的第二治疗剂，例如另一种抗体、治疗性多核苷酸、化疗剂、抗血管生成剂、细胞因子、其他细胞毒性剂、生长抑制剂。在某些这样的实施方式中，本发明公开的抗体和抗原结合片段与一种或多种其他的治疗剂联用时，可与所述的一种或多种治疗剂同时给药，在某些这样的实施方式中，所述的抗体和抗原结合片段和其他治疗剂可作为同一个药物组合物的一部分给药。但是，与其他治疗剂“联用”的抗体和抗原结合片段不需要与所述治疗剂同时给药或与该治疗剂在同一组合物中给药。本发明中“联用”的含义还包括在另一个治疗剂之前或之后给药的抗体和抗原结合片段，即使所述抗体或其抗原结合片段与第二种治疗剂通过不同给药方式给药。在可能的情况下，与本发明公开的抗体或其抗原结合片段联用的其他治疗剂可参照该其他治疗剂的产品说明书的方法用药，或参照外科医生的案头参考书2003Physicians’DeskReference，第57版；MedicalEconomicsCompany;ISBN:1563634457;第57版（2002年11月）），或参照其他本领域公知的方法。在某些实施方式中，与本申请提供的ro-Li抗体联合施用的抗血管生成剂是用于抗血管生成疗法的单克隆抗体，如贝伐单抗VEGF抗体）、頂C-ICll或DClOlVEGFR-2抗体）、mF4-31ClVEGFR-3抗体）和Vitaxin整合素ανβ3抗体）。[0242]在某些实施方式中，治疗剂可以诱导或激发针对癌症的免疫应答。例如，可以将肿瘤疫苗用于诱导对某种肿瘤或癌症的免疫应答。还可以将细胞因子疗法用于增强免疫系统的肿瘤抗原提呈。细胞因子疗法的实例包括但不限于干扰素如干扰素-a、和-γ，集落刺激因子如巨噬细胞-CSF、粒细胞巨噬细胞CSF和粒细胞-CSF，胰岛素生长因子（IGF-I，血管内皮生长因子VEGF，转化生长因子TGF，成纤维细胞生长因子FGF，白介素（如IL-I、11^-1〇、11-2、11^-3、11^-4、11^-5、11^-6、11^-7、11^-8、11^-9、11^-10、几-11和11^-12，肿瘤坏死因子如TNF-α和TNF-β或其组合。还可以使用使免疫抑制靶标失活的药剂，例如IL-I-拮抗剂IL-IA、VEGFR2拮抗剂例如，瓦他拉尼、舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼）、TGF-i3抑制剂、FGFR拮抗剂、血小板源生长因子受体PDGFR拮抗剂例如，伊马替尼、舒尼替尼、索拉非尼、帕唑帕尼）、表皮生长因子受体EGFR，ErbB拮抗剂例如，吉非替尼、拉帕替尼、卡奈替尼）、IL-10抑制剂、Fas配体抑制剂或其任意组合。另一组药剂包括活化对肿瘤或癌细胞的免疫应答的药剂，例如增强T细胞活化的药剂例如，T细胞共刺激分子如CTLA-4、ICOS和0X-40激动剂和增强树突细胞功能和抗原提呈的药剂。[0243]抗-PD-Ll抗体体内有效性的筛选和评估[0244]为了筛选和或评估PD-Ll抗体或其抗原结合片段的体内有效性例如，结合活性或结合亲和性），产生接种了表达人I3D-Ll蛋白的非人肿瘤细胞的非人动物。在某些实施方式中，非人肿瘤细胞是啮齿类例如，小鼠、大鼠或仓鼠等细胞。在某些实施方式中，非人肿瘤细胞是黑色素瘤细胞系（B16或小鼠结肠癌细胞系MC38。非人肿瘤细胞可以包含编码内源性非人PD-Ll基因区段失活的人H-L1蛋白的多核苷酸。靶基因的失活可以由位于内源性基因座的蛋白编码序列的基因破坏、突变、添加、基因沉默例如，RNAi基因反义）或基因缺失（例如，编码序列或包含翼侧区的编码序列的部分或全部缺失）引起，从而消除或最小化非人靶基因的表达，或者产生不与其配体结合的功能上失活截短的多肽。编码序列在5’和3’末端的翼侧区可以在约Ibp至约500bp的范围内，或者翼侧区可以大于500bp但是将不包括根据本公开内容的其他基因的失活。本申请中使用的“基因破坏”是指向天然存在的序列中加入一个或多个核苷酸或氨基酸。基因破坏可以是将标记物报告基因加入或插入蛋白编码序列。在某些实施方式中，失活是不可逆的。在某些实施方式中，失活导致在细胞中不具有可检测的靶基因或基因产物的活性。使用本领域中适宜的方法将靶基因失活，例如同源重组、RNA干扰RNAi或CRISPRCas9系统。在某些实施方式中，将编码人PD-Ll蛋白的人PD-Ll基因区段可操作地插入内源性非人PD-Ll基因座基因置换）。在某些实施方式中，将插入的编码人H-L1的多核苷酸整合在随机的、非特异性位置基因增强）。在又一个实施方式中，编码人PD-Ll的多核苷酸可以作为游离基因稳定地保持在细胞中，例如以独立的、游离DNA区段形式，并且游离DNA的复制独立于宿主细胞周期或者与宿主细胞周期同步。[0245]可以通过细胞表面表达的FACS分析或检测靶基因转录，识别靶基因完全失活的非人肿瘤细胞。可以通过本领域公知的任意适宜方法如同源重组和转基因方法经由如本公开内容所述的任意适宜表达载体如慢病毒载体将编码人ro-Li蛋白的多核苷酸引入肿瘤细胞。可以通过细胞表面表达的FACS分析或采用本领域的任意适宜方法检测靶基因转录，识别靶基因完全失活和或表达所引入的目的基因的肿瘤细胞。[0246]筛选或评估针对人PD-Ll的抗体或其抗原结合片段体内有效性的方法包括将包含编码人I3D-Ll蛋白的多核苷酸的肿瘤细胞接种至非人动物，将抗体与非人动物中的肿瘤细胞接触并确定肿瘤细胞的肿瘤负荷。本申请中使用的“肿瘤负荷”是个体中肿瘤细胞的量，其可以通过肿瘤体积、数量或重量确定。肿瘤细胞可以是实体肿瘤细胞或非实体肿瘤细胞如血液细胞）。肿瘤细胞可以是人肿瘤细胞或非人肿瘤细胞。在某些实施方式中，将肿瘤细胞接种至同源非人动物以产生同源肿瘤模型。在某些实施方式中，在接种至非人动物之前，将肿瘤细胞培养几代。在某些实施方式中，非人动物具有人免疫系统。在某些实施方式中，通过对给予PD-Ll抗体的非人动物中肿瘤体积的生长抑制与对照进行比较确定PD-Ll抗体或其抗原结合片段的体内有效性。[0247]以下实施例旨在更好地说明本发明，且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法，其整体或部分，都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料和方法不是为了限制本发明，而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应理解，本发明保护范围包括对本发明的方法作出的多种改动。发明人意在将这样的变动包括在本发明的范围内。[0248]实施例[0249]实施例l:ro_Ll蛋白的制备和表征[0250]人PD-L1CD274蛋白：在人293细胞HEK293中表达重组人ro-LlCD274蛋白（登记号_P_054862.1hro-Ll-his。简言之，将在C-末端具有6X组氨酸标签的来自Phel9-Arg238的人PD-Ll基因的编码区用于转染。使用组氨酸标签亲和柱纯化上清液。使用SDS-PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白。该蛋白购自ACROBiosystemsPD1-H5229。[0251]具有C-Fc标签的人ro-LlCD274:在人293细胞HEK293中表达具有C-Fc标签的重组人PD-L1CD274蛋白（登记号#即_054862.1hPD-Ll-Fc。简言之，将在C-末端融合了人IgGl的Fc片段的来自Phel9-Arg238的人PD-Ll基因的编码区用于转染。使用Fc标签亲和柱纯化上清液。使用SDS-PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白。该蛋白购自ACROBi〇systemsPD1-H5258。[0252]小鼠PD-L1CD274蛋白：将重组小鼠PD-L1CD274蛋白（mPD-Ll-hisPhel9-Arg238登记号#~?_068693在C-末端与6X组氨酸标签融合并在人293细胞HEK293中生产。使用His标签亲和柱纯化来自HEK293细胞的转染上清。使用SDS-PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白。该蛋白购自ACROBiosystemsPD1-M5220〇[0253]具有C-Fc标签的小鼠ro-LlCD274:将具有C-Fc标签的重组小鼠ro-LlCD274蛋白mPD-Ll-FcPhel9-Arg238登记号·Ρ_068693在C-末端与人IgGl的Fc片段融合，并且在人293细胞ΗΕΚ293中生产。使用Fc标签亲和柱纯化来自ΗΕΚ293细胞的转染上清。使用SDS-PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白。该蛋白购自ACROBiosystemsPD1-M5251。[0254]具有组氨酸标签的食蟹猴PD-L1CD274:将重组食蟹猴ro-LlCD274蛋白（cro-Ll-HisPhel9-Arg238登记号#F6VEW6在C-末端与多组氨酸标签融合，并且在人293细胞HEK293中生产。使用组氨酸标签亲和柱纯化来自HEK293细胞的转染上清。使用SDS-PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白。该蛋白购自ACROBiosystemsPD1-C52H4。[0255]具有C-Fc标签的食蟹猴ro-LlCD274:将带有C-FcTag的重组食蟹猴ro-LlCD274蛋白（cynoPD-Ll-FcPhel9-Arg238登记号#F6VEW6在C-末端与人IgGl的Fe片段融合，并且在人293细胞HEK293中生产。使用Fc标签亲和柱纯化来自HEK293细胞的转染上清。使用SDS-PAGE凝胶表征所得到的纯化蛋白。该蛋白购自ACROBiosystemsPD1-C5253。[0256]将上述H-L1蛋白用于以下实验。[0257]实施例2:抗体的产生[0258]1.抗原偶联和免疫[0259]为进行免疫，将重组hPD-Ll-Fc或mPD-Ll-Fc蛋白与Mabspace多种免疫增强肽偶联。简言之，将2-8倍摩尔过量的肽与Sulfo-SMCC磺基琥珀酰亚胺基4-[N-马来酰亚胺甲基]环己烷-1-羧酸酯，Pierce#22322_活化的hPD-Ll-Fc蛋白混合并在室温下孵育1小时。终止反应并使用SDS-PAGE凝胶对偶联蛋白进行分析和质量控制QC。[0260]使用完全弗氏佐剂Pierce按照1:1的比例分别对上述偶联的hPD-Ll-Fc和mPD-Ll-Fc蛋白进行乳化，然后通过皮下和腹腔注射至C57BL6小鼠。后续免疫使用CpG和Alum以保持蛋白的天然构象。至少每2周进行一次免疫并在第一次免疫后取小鼠血清，用于ELISA测定PD-Ll抗体滴度。为确定血清滴度，每只免疫小鼠取20μ1血清。将高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用lygml含小鼠或人ro-Ll-his的缓冲液包被，ΙΟΟμΙ孔，所述缓冲液由高pH包被缓冲液〇.16^Na2CO3，0.3^NaHCO3，pH9.8组成。将板在4°C下孵育过夜，然后在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%山羊血清+0.05%吐温20并在室温下孵育2小时。然后吸出封闭缓冲液，并将ΙΟΟμΙ在稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%山羊血清+0.01%吐温20中系列稀释的血清转移至ELISA板的各孔中，并在室温下孵育60分钟。然后使用上文所述的方法洗板3次。然后，将在稀释缓冲液中稀释的HRP偶联的山羊抗-小鼠Fc抗体Abeam溶液以100μ1孔加入板的各孔中。随后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，用洗涤缓冲液洗板3次250μ1孔）。最后，将TMB以100μ1孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nM处读板。[0261]2.融合[0262]在融合前4天，腹腔注射未偶联的hPD-Ll-Fc或mPD-Ll-Fc蛋白，对小鼠进行融合前加强免疫。在融合当天，在无菌条件下取出脾脏并将该器官制成单细胞悬液。裂解红细胞并用DMEMGibco洗涤脾细胞。将存活的、处于对数生长期的骨髓瘤细胞SP20以1:4的比例与小鼠脾细胞混合。然后，在与PEG融合前，洗涤细胞两次。融合后，用DMEM洗涤细胞并将其混悬于补充了10%FBS+HFCS+0PI+1XHAT的细胞生长培养基中。将该细胞悬液以200μ1每孔铺板至96孔细胞培养板中，并且在37°C，湿度10%的CO2培养箱中孵育过夜。细胞孵育7天后，吸走孔中的培养基并换成新鲜的生长培养基。在更换培养基2-3天后开始筛选杂交瘤上清。[0263]实施例2:抗体筛选[0264]I.通过ELISA测定筛选产生H-L1结合剂[0265]在高结合透明聚苯乙稀96孔板Nunc用含0.5ygmlhPD-Ll-his或mPD-Ll-his的高pH包被缓冲液包被100μ1孔并在4°C下孵育过夜。然后，在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温20并在室温下孵育2小时。将ΙΟΟμΙ杂交瘤上清转移至ELISA板的各孔中并在室温下孵育60分钟。然后使用上文所述的方法洗板3次。然后，将在封闭缓冲液中稀释的HRP偶联的山羊抗-小鼠Fc抗体Abeam溶液以ΙΟΟμΙ孔加入板的各孔中。将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后使用洗涤缓冲液洗板3次250μ1孔）。最后，将TMB以100μ1孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450ηΜ处读板。随后将来自ELISA阳性杂交瘤孔的细胞在细胞培养基中扩增用于进一步的表征研究。[0266]2.在ELISA中评估杂交瘤上清抑制Η-1与PD-Ll结合的阻断活性[0267]在高结合透明聚苯乙稀96孔板Nunc用含2ygml的hPD-Ll-FcAcrobiosystems，目录号#PD卜H5258的高pH包被缓冲液包被（ΙΟΟμΙ孔并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温20并在室温下孵育2小时。将ΙΟΟμΙ杂交瘤上清转移至ELISA板的各孔中并在室温下孵育60分钟。然后使用上文所述的方法洗板3次。将80μ1lygmlhPD-l-hisACR0Biosystems，目录号#PD1-H5221加入含缓冲液的各孔中。然后向孔板的各个孔中加入在封闭缓冲液中稀释的Anti-his-HRPl:4000稀释，CWBIO，目录号#CW0285ΙΟΟμΙ孔）。将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后使用洗涤缓冲液洗板3次（250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nM处读板。随后将来自ELISA阳性杂交瘤孔的细胞在细胞培养基中扩增用于进一步的表征研究参见图1A-C。[0268]3.通过FAcs评估杂交瘤上清抑制ro-i与肿瘤细胞上的ro-Li结合的阻断活性[0269]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将具有封闭缓冲液的杂交瘤上清（1〇〇μ1管加入相应管中并在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后以ΙΟΟμΙ管加入3ygml生物素化的hPD-l-Fc-N297AACRObiosystems，并且在4°C下孵育1小时。用I3BS洗涤3次后，将封闭缓冲液中1:200的链霉亲和素-PEEBiosciences加入每个管中（ΙΟΟμΙ管）。将细胞在4°C下孵育1小时，然后用PBS洗涤两次，随后将各样品的细胞重悬于150μ1PBS中。然后将细胞转移至FACS管，并且使用流式细胞仪ACEABioscienceNovocyte检测抗体与细胞的结合。[0270]4·通过ELISA筛选pH依赖性I3D-Ll的结合[0271]在高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用含0.5ygml的hPD-Ll-hisΙΟΟμΙ孔）的高pH包被缓冲液包被，并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温20并在室温下孵育2小时。将ΙΟΟμΙ杂交瘤上清转移至ELISA板的各孔中，并且在ρΗ7.4或ρΗ6.0条件下室温孵育60分钟。然后使用上文所述的方法用ρΗ7.4或ρΗ6.0的缓冲液洗板3次。然后，将在ρH7.4的封闭缓冲液中稀释的HRP偶联的山羊抗-小鼠Fc抗体Abcam溶液以100μ1孔加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后用pH7.4或pH6.0洗涤缓冲液洗板3次200μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450ηΜ处读板。随后将来自ELISA阳性杂交瘤孔的细胞在细胞培养基中扩增，用于进一步的表征研究。显示了克隆23Α11图2Α和克隆23F11图2Β的结果。[0272]实施例3:阳性杂交瘤克隆的亚克隆和小规模抗体生产[0273]1.阳性杂交瘤克隆的亚克隆[0274]选择来自具有所需结合性质和阻断活性的ELISA阳性杂交瘤孔的细胞，并且用有限稀释，将每个上述细胞在96孔板中铺板。将这些细胞培养7天。一旦达到足够的细胞量，从每个孔收集上清并重新筛选抗原结合能力参见实施例2中的筛选）。[0275]从每块96孔板中识别具有最高抗原结合活性的克隆，并且用有限稀释进一步扩增至每孔含200μ1杂交瘤生长培养基的96孔板中。7天后，检测96孔板中细胞的抗原结合。进行两次以上的亚克隆。多于90个孔显示出阳性结合信号时，确定具有最高抗原结合活性的两个克隆并转移至含培养基的24孔板中，使其再生长2天。待24孔板细胞铺满孔底，将细胞转移至6孔板。培养5天后，将一部分细胞冻存。将其余细胞转移至培养瓶中并进行扩增。待培养瓶细胞长满，将一半细胞冻存每个克隆3管），作为另外的备份。将另一半在含培养基的培养瓶中进一步扩增用于抗体生产。使用标准方法确定同种型。[0276]2.小规模抗体生产[0277]将杂交瘤细胞接种至转瓶中，并且用200-300ml杂交瘤培养基（Invitrogen培养14天。按照如下所述从杂交瘤细胞培养物中纯化ro-Ll单克隆抗体mAb。全部纯化过程在室温下进行。用同一个纯化方案和亲和层析法纯化各种mAb。[0278]将宿主细胞培养液CCF离心除去细胞碎片。然后将CCF上清过滤，稀释，之后上样到柱式蛋白G层析介质蛋白G高性能柱Bio-Rad上并进行平衡。[0279]上样后，洗涤蛋白G柱直至流出物在280nm下的吸光度回到基线。然后使用pH2.5的甘氨酸将PD-LlmAb从柱中洗脱，并立即通过每ml洗脱体积加入50μ1IMTris碱储存液对其进行中和。监测洗脱液在280nm处的吸光度，并且收集含蛋白的馏分，以制备蛋白A混合物。[0280]纯化后，通过使用10,OOOMW⑶膜（PierceSlide-A-Lyzer或透析管）透析将PD-LlmAb在PBS中制剂。制剂后，将I3D-LlmAb过滤除菌。[0281]实施例4:纯化抗体与H-L1结合的分析[0282]在高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用高pH包被缓冲液包被0.5ygml的hPD-Ll-hisΙΟΟμΙ孔并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温20并在室温下孵育2小时。然后加入用稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.01%吐温-20系列稀释的纯化抗体并在室温下孵育1小时。然后使用上文所述的方法洗板3次。将稀释缓冲液中的HRP偶联的山羊抗-小鼠Fc抗体Abeam溶液以ΙΟΟμΙ孔加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗板3次（250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2S〇4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nM处读板参见图3。[0283]实施例5:评估纯化抗体抑制ro-i与ro-Ll结合的阻断活性[0284]1.在ELISA中的评估[0285]将高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用由0.5ygmlhPD-Ll-Fc组成的包被溶液包被（1〇〇μ1孔并在4°c下孵育过夜。然后，在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液ros+o.1%吐温20姐8111洗涤一次。每孔加入20^1封闭缓冲液屮83+1%83六+1%正常山羊血清+0.05%吐温-20并在室温下孵育2小时。然后加入用稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.01%吐温-20系列稀释（由lOygml稀释至0.0006ygml的抗体，并且在室温下孵育1小时。然后使用上文所述的方法洗板3次。加入lygml生物素化的hPD-l-Fc-N297AAcrobiosystems并在室温下孵育1小时。洗板3次后，将在稀释缓冲液中稀释的HRP偶联的中性亲和素抗体Pierce溶液以100μ1孔加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后使用洗涤缓冲液洗板3次250μ1孔）。最后，将TMB以100μ1孔加入各孔中并使用0.64ΜH2S〇4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450ηΜ处读板参见图4ΑC3BM-GT是美国专利号8217849中公开的基准抗体MPDL-3280A。[0286]2.通过FACS在肿瘤细胞上的评估[0287]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后使用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将在封闭缓冲液中稀释的抗体ΐ〇〇μ1管加入相应管中使其终浓度为i〇ygml，并且在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后加入3ygml生物素化的hPD-l-Fc-N297AAcrobiosystems100μ1管并在4°C下孵育1小时。用I3BS洗涤3次后，将封闭缓冲液中1:200的链霉亲和素-PEEBiosciences加入每个管中（100μ1管）。将细胞在4°C下孵育1小时，然后用I3BS洗涤两次，随后将各样品的细胞重悬于150μ1PBS中。然后将细胞转移至FACS管，并且使用流式细胞仪ACEABioscienceNovocyte检测hPD-1-Fc与细胞的结合参见图4Β。[0288]实施例6:纯化H-L1抗体的剂量依赖性应答[0289]1.通过FACS测得的纯化H-L1抗体与HCC827结合的剂量依赖性应答[0290]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后使用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将在封闭缓冲液中系列稀释的从杂交瘤上清中纯化的I3D-Ll抗体ΙΟΟμΙ管加入相应管中并在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后加入封闭缓冲液中的二抗1:400稀释抗-mlgGH+L-PE，CellsignalingΙΟΟμΙ管）。将细胞在4°C下孵育1小时，然后使用PBS洗涤两次，随后将各样品的细胞重悬于150μ1PBS中。然后将细胞转移至FACS管，并且使用流式细胞仪BDAccuriC6检测抗体与细胞的结合参见图5Α。[0291]2.通过FACS测得的纯化PD-Ll抗体在HCC827上阻断hPD-Ι与hPD-Ll结合的剂量依赖性活性[0292]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后使用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将用封闭缓冲液系列稀释的从杂交瘤上清中纯化的H-L1抗体（ΙΟΟμΙ管加入相应管中并在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后加入3ygml生物素化的hPD-1-N297AΙΟΟμΙ管）并在4°C下孵育1小时。用I3BS洗涤3次后，将在封闭缓冲液中以1:200稀释的抗体家兔抗-hIgG-PE，SantaCruzΙΟΟμΙ管加入每个管中。将细胞在4°C下孵育1小时，然后用I3BS洗涤两次，随后将各样品的细胞重悬于150μ1PBS中。然后将细胞转移至FACS管，并且使用流式细胞仪BDAccuriC6检测hPD-1-hFc与细胞的结合参见图5B。[0293]实施例7:杂交瘤抗体的克隆和测序[0294]通过称为5’RACEcDNA末端的快速扩增）的聚合酶链式反应PCR扩增技术获得小鼠抗-人F1D-Ll抗体轻链和重链可变区的序列。使用TrizolInvitrogen分离来自生产4B623八1123?11220926?521?111864抗体的杂交瘤细胞的总尺祖并使用利用01丨8〇01'12-18引物（Invitrogen的Superscript第一链合成系统（Invitrogen合成cDNA。通过使用针对重链可变区的MuIgGVH3’-2和MuIg-5’前导引物和针对轻链可变区的MuIgKVL3’-1和MuIg-5”前导引物N0VAGEN的PCR，克隆小鼠IgG基因的可变区。将所得到的各抗体条带克隆到TOPOTA克隆载体中并使用ABIDNA测序仪PerkinElmer将来自10个以上克隆的DNA进行测序和测定。使用VectorNTIAdvance10软件（Invitrogen确定一致的序列。[0295]嵌合抗体的产生:在测序分析和确认后，将每个上文所述基因的可变区克隆进入重组表达载体，例如分别将轻链可变区（VL的序列克隆进入pCP-hlgGl和将重链可变区VH的序列克隆进入pCP-hlgGl，用于抗体生产和纯化。[0296]实施例8:重组嵌合抗体的表达和纯化[0297]通过下述方法对上述产生的重组嵌合抗体蛋白进行表达和纯化:用终浓度为0.5μgml的等量重链载体和轻链载体DNA以及I.OygmlPEI聚乙稀亚胺-线形，Polyscience对以IxlO6个细胞ml在含10%普朗尼克PluronicF-68的Freestyle293表达培养基中培养的HEK293E细胞进行转染。DNA与PEI之比为1:2。在OptimalMEM中形成DNA和PEI复合物的时间应为在室温下15分钟。在5%CO2、37°C和125rpm振荡速度的条件下，在培养瓶中培养转染细胞。在转染22至26小时后加入1%蛋白胨培养基。在第6天收集条件培养基并以3，OOOrpm将上清离心30分钟。然后将澄清的条件培养基上样至蛋白A柱；G.E.Healthcare，用PBS加上0.1%triton-ΧΙΟΟ洗涤，并且最后用pH3.5的含0.IM甘氨酸的溶液洗脱结合的IgG。将洗脱的抗体蛋白透析至PBS并在-80°C下保存。为除去内毒素，通过HitrapDEAE琼脂糖F.F柱从而进一步处理纯化的蛋白，并且使用尺寸排阻色谱（Superdex2005150GL，G.E.Healthcare对所得到的抗体进行分析以确定纯度水平。[0298]实施例9:纯化的PD-Ll抗体与食蟹猴和啮齿动物PD-Ll蛋白的交叉反应性以及对hPD-Ll和hPD-L2的结合选择性[0299]1.与食蟹猴I3D-Ll蛋白的跨物种结合[0300]将高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用高pH包被缓冲液包被0.5ygml的人或食蟹猴cynoro-Ll-hisΙΟΟμΙ孔并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温-20并在室温下孵育2小时。然后加入用稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.01%吐温-20系列稀释的抗体，并且在室温下孵育1小时。然后使用上文所述的方法洗板3次。然后以ΙΟΟμΙ孔，将稀释缓冲液中的针对小鼠杂交瘤抗体的HRP缀合的山羊抗-小鼠Fc抗体Abeam溶液，或者针对4Β6嵌合抗体的山羊抗-人IgGFc-HRPAbeam加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗板3次（250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64MH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nM处读板（参见图6A至6E。[0301]嵌合抗体4B6-C与其亲本抗体4B6具有相似的结合亲和性。如图6A所示，4B6与人和猴抗原的结合亲和性与4B6-C相似，以及如图6E所示，4B6-C在小鼠中的结合亲和性与4B6类似。[0302]2.与小鼠PD-Ll蛋白的跨物种结合[0303]将高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用高pH包被缓冲液包被lygml的小鼠PD-Ll-hisΙΟΟμΙ孔并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温-20并在室温下孵育2小时。然后加入20ygml稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.01%吐温-20中的纯化的杂交瘤小鼠抗体并在室温下孵育1小时。然后使用洗涤缓冲液250μ1孔洗板3次。然后将稀释缓冲液中的HRP缀合的山羊抗-小鼠Fc抗体Abeam溶液（ΙΟΟμΙ孔加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗板3次250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nM处读板参见图6F。[0304]3.与hPD_L2蛋白的跨家族结合[0305]与上文所述用于跨物种结合的方法类似，方法通过ELISA评估纯化抗体（4B6、23A11、26F5、23F11和22C9与人PD-L2蛋白的结合。简言之，将高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用高pH包被缓冲液（0·16%Na2C03+0·3^NaHCO3，pH9·8包被0·5ygml的人I3D-Ll-FcAcrobiosystems，目录号ΡΌ1-Η5258或lygmlhFO-I^-FcAcrobiosystems，目录号PD2-H5251ΙΟΟμΙ孔）并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Amresco洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温-20并在室温下孵育2小时。然后加入ΙΟΟμΙ用稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.01%吐温-20稀释的2ygml纯化的PD-Ll抗体，并且在室温下孵育1小时。然后用洗涤缓冲液洗板3次。然后将稀释缓冲液中的HRP缀合的山羊抗-小鼠IgG抗体（1:20000,Abeam溶液（ΙΟΟμΙ孔加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗板3次250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中作用15分钟并使用〇.16ML硫酸50μ1孔终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450ηΜ处读板参见图6G〇[0306]如图6G中所示，所有检测的抗体都能够与hPD-Ll结合，但不与hPD-L2结合。[0307]实施例10:纯化的抗-PD-Ll抗体与肿瘤细胞上的PD-Ll结合的表征:FACS结合测定HCC827细胞）[0308]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将用封闭缓冲液系列稀释的生物素化的PD-Ll抗体ΙΟΟμΙ管加入相应管中并在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后加入封闭缓冲液中的二抗或1:200稀释的家兔抗-人IgG-PESantaCruzΙΟΟμΙ管）。将细胞在4°C下孵育1小时，然后用I3BS洗涤两次，随后将各样品的细胞重悬于150μ1PBS中。然后将细胞转移至FACS管，并且使用流式细胞仪ACEABioscienceNovocyte检测抗体与细胞的结合参见图7。带“C”的抗体表示嵌合抗体，抗体“4B6-H3L3”是指如实施例15中产生的具有重链Η3和轻链L3的组合的人源化4Β6。[0309]实施例11:评估纯化的抗-PD-L1抗体抑制PD-1与肿瘤细胞上的H-L1结合的阻断活性[0310]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后使用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将用封闭缓冲液系列稀释的I3D-Ll抗体（ΙΟΟμΙ管）（参见图8加入相应管中并在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后加入3ygml生物素化的hPD-l-N297A100yl管）并在4°C下孵育1小时。用PBS洗涤3次后，用封闭缓冲液1:200稀释的链霉亲和素-PEeBioscienceΙΟΟμΙ管加入每个管中。将细胞在4°C下孵育1小时，然后用PBS洗涤两次，随后将每个样品的细胞重悬于150ylPBS中。然后将细胞转移至FACS管并用流式细胞仪ACEABioscienceNovocyte检测hPD_l_N297A与细胞的结合。[0311]如图8中所示，FACS结果表明抗-I3D-Ll抗体显示出抑制hPD-Ι与肿瘤细胞HCC827上的hPD-Ll结合的浓度依赖性的活性。[0312]实施例12:通过竞争ELISA对选定的抗-PD-Ll抗体进行表位分组（Epitopebinning[0313]在高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc上包被0.5ygmlhPD-Ll-FcΙΟΟμΙ孔并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次，随后向每个孔中加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温-20。将板在室温下孵育2小时。然后加入在稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.01%吐温-20中以20ygml系列稀释的竞争性抗体4B6、23A11、23F11、22C9和21F11，并且将板在室温下孵育1小时。然后使用洗涤缓冲液洗板3次。加入产生80%最大结合信号的不同浓度的生物素化的抗-PD-L1抗体例如，18G4、23A11、4B6，并且在室温下孵育1小时。洗板3次后，将在稀释缓冲液中稀释的HRP缀合的中性亲和素抗体Pierce溶液加入板的各孔中，ΙΟΟμΙ孔。随后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后用洗涤缓冲液洗板3次250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2S〇4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nM处读板参见图9A至图9C。[0314]实施例13:重组嵌合抗体pH依赖性结合的表征[0315]在高结合透明聚苯乙烯96孔板用高pH包被缓冲液包被0.5ygml的hPD-Ll-hisAcrobiosystemsΙΟΟμΙ孔并在4°C下孵育过夜。然后将包被的板在自动洗板仪上用PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。随后，每孔加入200μ1封闭缓冲液，并将板在室温下孵育2小时。吸出封闭缓冲液后，加入在pH7.4的稀释缓冲液中系列稀释的嵌合抗体，并且将板在室温下孵育40分钟。然后，用pH7.4或5.5的洗涤缓冲液250μ1孔洗板1次，再加入ΙΟΟμΙρΗ7.4或ρΗ5.5的抗体稀释缓冲液，并且在室温下继续孵育2小时。随后，用250μ1洗涤缓冲液洗板3次每次洗涤振摇10秒），然后将在pH7.4稀释缓冲液中以1:20000稀释的HRP缀合的山羊抗-人Fc抗体Abeam溶液加入板的每个孔中，ΙΟΟμΙ孔，并且在室温下孵育1小时。之后，用250μ1洗涤缓冲液洗板3次每次洗涤振摇10秒）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2S〇4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450ηΜ处读板参见图10A-F。[0316]如图10Α至10F中所示，嵌合抗体23F11、23A11和22C9图10Α至10C显示出pH依赖性地与hPD-Ll结合（例如，在pH7.4下具有比在pH5.5下更高的结合），而嵌合抗体21F11、4B6、26F5图10D至10F未显示出pH依赖性地与hPD-Ll结合在pH5.5pH7.4下的结合亲和性相似）。[0317]实施例14:对抗-PD-Ll抗体的体内评估[0318]使用经改良的同源小鼠移植肿瘤模型评估上述获得的抗-PD-Ll抗体的体内活性。通过皮下注射接种小鼠肿瘤细胞，该肿瘤细胞的小鼠PD-Ll基因已被人PD-Ll基因取代，包括小鼠结肠癌细胞系MC38和黑色素瘤细胞系B16。每周3次腹腔（IP注射3mgkg、10mgkg和或30mgkg抗-人PD-Ll抗体，或者每周1次以1、3或10mgkg的剂量静脉注射抗-人PD-Ll抗体。将参照PD-Ll抗体BM-GT即如美国专利号8217149Genentech中公开的YW243.55.S70或MPDL3280A和BM-ME即在美国专利号US8779108中的2.14H90P作为阳性对照。当载剂组的肿瘤达到IOOOmm3的体积时，评估抗体对肿瘤生长的作用。如下所述每周两次测量肿瘤体积和体重，根据与载剂组相比的肿瘤生长抑制TGI情况计算抗体对肿瘤生长的作用。[0319]1.表达人ro-Ll的小鼠肿瘤细胞系的产生[0320]使用我们最新开发的高效CRISPRCas9系统敲除小鼠肿瘤细胞系（分别为B16和MC38，均购自ATCC中的内源性⑶274H-Ll。简言之，设计靶向小鼠⑶274H-Ll基因第一编码外显子的sgRNA，通过hit-and-runCRISPRCas9+sgRNA构建体转染细胞并且选择敲除细胞。通过对在稳态或干扰素γ刺激条件下在细胞表面的表达CD274PD-L1的情况进行FACS分析，识别完全敲除内源性⑶274H-Ll的细胞，随后通过对靶基因组区域TA克隆和测序进行验证。为产生人⑶274H-Ll取代细胞系，将人⑶274PD-LlcDNA编码序列克隆进入FG12衍生的慢病毒载体。然后，用表达人CD274PD-L1的慢病毒感染敲除了小鼠CD274TO-Ll的细胞，并且通过FACS分析确证人⑶274PD-L1在已建立细胞系中高水平且稳定的表达。该工程化的B16和MC38细胞分别命名为B16-hPD-LlKI和MC38-hro-LlKI。[0321]2.PD-Ll抗体在B16人-PD-Ll敲入肿瘤模型中的抗肿瘤活性[0322]将B16细胞工程化，以用人PD-Ll取代小鼠PD-Ll基因，并将其命名为B16-hPD-L1KI。在研究之前，将B16-hPD-LlKI细胞进行5代以内的传代培养，然后接种至小鼠。向10只雌性SPF级C57BL6小鼠中的每一只皮下注射2XIO6个细胞0.2mL。在注射肿瘤细胞一天后注射第一剂（3mpk或IOmpk抗体（例如，BM-GT、4B6-C和23A11。每周两次，使用卡尺INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸。根据在第29天测得的数值计算肿瘤生长抑制TGI%。使用PrismGraphPad分析结果并以平均值土S.E.M表示。通过T-检验进行两组之间的比较，如果P〈〇.05则认为差异具有显著性参见表1。[0323]表1:检测PD-Ll抗体在治疗B16hPDLl同源小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性的研究设计[0324][0325]3.PD-Ll抗体在MC38人-PD-Ll敲入KI肿瘤模型中的抗肿瘤活性[0326]将工程化以用人TO-Ll取代小鼠I3D-Ll基因的MC-38细胞命名为MC38-hro-LlKI。在37°C、含5%C02的培养箱中，用含10%热灭活胎牛血清ExCellBiology、100Uml青霉素和100ygml链霉素Hyclone的RPMI1640培养基ThermoFisher以单层培养物形式体外维持MC38hPDLl-KI肿瘤细胞。通过胰酶-EDTA处理Hyclone，每周两次对肿瘤细胞进行常规传代培养。收获指数生长期的细胞并计数，用于肿瘤接种。通过在右侧肋腹部皮下注射，向每只雌性SPF级C57BL6小鼠接种2XIO6个细胞。接种约10天后，选择40只肿瘤体积约IOOmm3的小鼠并随机分成5组参见表2中的方案）。然后用I3BS或IOmgkg体重的纯化的来自抗体杂交瘤的小鼠抗体4B6、23A11、23F11、26F5中的每种腹腔注射到小鼠体内。从首次注射开始，每周注射3次，持续4周。在研究结束时通过吸入CO2处死小鼠。每周两次，使用卡尺INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示体积:V=O.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。使用PrismGraphPad分析结果并以平均值土S.E.M表示。通过T-检验进行两组之间的比较，如果P*〈0.05和**〈0.01则认为差异具有显著性参见表3〇[0327]表2:检测PD-Ll抗体在治疗MC38hHLl同源小鼠肿瘤模型中的抗肿瘤活性的研究设计[0329]表3:肿瘤体积[0330][0331]注释:a·平均值土SEM，*P〈0·05，**P〈0·01[0332]如表3和图IIA-IIC所示，在研究结束时，对照组的平均肿瘤体积是起始点时体积的6.7倍。在经抗体486、23六11、26?5和23?11处理的小鼠中，分别有48、68、78和78只小鼠无可检测的肿瘤，因此可以认为是完全响应。在4B6处理组中，28只小鼠具有70%的肿瘤缩小（参见图11B。这些数据表明这些抗体是已建立肿瘤的非常有效的生长抑制剂，并且具有在大多数小鼠中清除肿瘤的能力。[0333]4.PH依赖性H-L1抗体在MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中的抗肿瘤活性[0334]为评估pH依赖性抗体在体内肿瘤抑制中是否具有优势，我们对一种pH依赖性抗体23F11与一种非pH依赖性结合抗体4B6-C的活性进行了比较参见图12A和12B。这些抗体具有较强的中和活性，并且还在高剂量下抑制肿瘤。为揭示PH依赖性抗体的潜在优势，我们在低剂量下腹腔注射lmgkg对抗体进行了检测。简言之，通过在右侧肋腹部皮下注射，向每只雌性SPF级C57BL6小鼠接种2XIO6个细胞（即MC38-hro-LlKI。接种约10天后，选择40只肿瘤体积约200mm3的小鼠并随机分成5组。然后，用PBS或lmgkg体重的在PBS中制剂的纯化的抗体4B6-嵌合（4B6-C、23F11、参照抗体BM-GT在美国专利号US8217149中也称为YW243·55·S70或MPDL3280A和BM-ME在美国专利号US8779108中也称为2·14H90PT腹腔注射到小鼠体内。从首次注射开始，每周注射3次，持续3周。在研究结束时通过吸入CO2处死小鼠。每周两次，使用卡尺（INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示计算体积:V=0.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。使用PrismGraphPad分析结果并以平均值土S.E.M表示。通过T-检验进行两组之间的比较，如果P〈0.05则认为差异具有显著性。[0335]图12A和12B中的数据表明具有pH依赖性结合性质的抗体比不具有pH依赖性结合性质的抗体更有效地抑制肿瘤生长。与PBS处理组相比，用lmgkg剂量的抗体23F11处理使得8只小鼠中的3只中的肿瘤完全消除，以及8只小鼠中的1只中的肿瘤体积缩小超过70%。用非PH依赖性结合抗体4B6-C处理不会导致肿瘤体积显著缩小，并且每只小鼠的肿瘤均大于起始点时的肿瘤体积。因此，具有pH依赖性结合的抗体能够在低于非pH依赖性结合抗体的浓度下起到抑制肿瘤生长的作用。[0336]同样在MC38人-PD-LlKI肿瘤模型中检测了静脉注射抗体18G4渗见图12C和12D和22C9参见图12E和12F的肿瘤生长抑制作用。简言之，如前所述将MC38hPD-Ll肿瘤细胞接种至C57BL6小鼠并让其生长6天。此时，选择平均肿瘤体积约120_3的小鼠并随机分成8组，每组8只小鼠。在第0天将1或3mgkg纯化自杂交瘤培养物中的纯化抗体18G4和22C9等体积地通过静脉注射到每只小鼠并跟进至第25天。在研究结束时通过吸入CO2处死小鼠。每周两次，使用卡尺INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示计算体积:V=O.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径（参见表4和图12C-12F。如果肿瘤体积缩小至小于处理开始时肿瘤体积的50%，但是未低于可测量尺寸，则记录为部分肿瘤消退PR，或者如果肿瘤负荷变得难以察觉，则记录为完全肿瘤消退（CR参见表5。使用PrismGraphPad分析图12C-12F中的结果并以平均值土S.E.M表示。通过T-检验进行两组之间的比较，如果P〈〇.05则认为差异具有显著性。数据表明在相同条件下1或3mgkg剂量的18G4参见表4和5，以及图12C和12D和22C9参见表4和5，以及图12E和12F在抑制肿瘤生长方面非常有效。[0337]表4:MC38hPD-Ll同源肿瘤模型中18G4和22C9的肿瘤生长抑制[0339]注释:CR:完全消退;PR:部分消退;ORR:客观缓解率[0340]表5:第25天的肿瘤消退情况[0342]注释：*ρ〈0·05;平均值土SD，n=8[0343]5.嵌合pH依赖性H-L1抗体在MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中的抗肿瘤活性[0344]为进一步验证具有pH依赖性抗原结合性质的抗体与不具有pH依赖性结合的抗体相比能够更好地在体内抑制肿瘤生长，并且能够消除Fc结构域的潜在影响，我们重新检测了用与参照抗体（即BM-GT相同的IgG同种型（即人IgG1在HEK293细胞中产生的嵌合抗体即23A11-C和23F11-C。[0345]简言之，小鼠接种MC38hPD-LlKI细胞后，当肿瘤体积为IOOmm3时开始通过腹腔注射lmgkg的抗体治疗，每周3次通过腹腔注射给予抗体。使用PrismGraphPad分析结果并以平均值土S.E.M表示。通过T-检验进行两组测试vs载剂之间的比较，如果P〈0.05则认为差异具有显著性。[0346]如图13A和13B所示，在MC38人-PD-Ll小鼠模型中，注射了Impk嵌合pH-依赖性抗体S卩23A11-C和23F11-C的肿瘤体积小于注射了Impk参照抗体S卩BM-GT的肿瘤体积。[0347]实施例15:人源化抗体的产生和表征[0348]1.人源化抗体的产生、表达和纯化[0349]使用小鼠抗体4B6、23A11和23F11可变结构域的序列鉴定与鼠源框架具有最高同源性的种系序列。使用计算机建模设计具有CDR移植和回复突变的人源化变体。[0350]4B6[0351]分别将针对轻链的人种系框架序列VK1D-13和针对重链的人种系框架序列VH1-2用于⑶R移植。[0352]通过向种系序列（SEQIDNO:87直接移植3个⑶R，以及分别针对重链HC变体3移植回复突变K12V、T28V、V68A、R72V、T74K、S77RSEQIDN0:65和针对HC变体4移植回复突变T28V、R72V、S77RSEQIDN0:67获得HC变体3和4参见图14A。[0353]4B6HC的种系序列：[0354]VH1-24B6-种系，SEQIDN0:87:[0355]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR[0356]VHl-2变体34B6-Hzd-HC-V3，SEQIDN0:65:[0357]QVQLVQSGAEVVKPGASVKISCKASGYVFTDYYMNWVKQAPGQGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFQGRATVTVDKSTRTAYMELSRLRSDDTAVYYCVKWGDGPFAYWGQGTLVTVSS[0358]VH1-2变体44B6-HC-V4，SEQIDN0:67:[0359]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYVFTDYYMNWVRQAPGQGLEWIGDINPNNGGTSYNQKFQGRVTVTVDTSIRTAYMELSRLRSDDTAVYYCVKWGDGPFAYWGQGTLVTVSS[0360]通过向种系序列（SEQIDNO:88直接移植3个⑶R以及分别针对轻链LC变体3移植回复突变L4M、P8Q、L78M、Y87FSEQIDN0:66和针对LC变体4移植回复突变L4M、Y87FSEQIDN0:68获得LC变体3和4参见图14B。[0361]4B6LC的种系序列：[0362]VK1D-134B6LC种系，SEQIDN0:88[0363]DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGISSALAWYQQKPGKAPKLLIYDASSLESGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQFNNYP[0364]VK1D-13变体34B6-Hzd-LC-V3，SEQIDN0:66[0365]DIQMTQSQSSLSASVGDRVTITCQASQNVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNRYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSMQPEDIATYFCQQYSNYPTFGSGTKLGIK[0366]VK1D-13变体44B6-LC-V4，SEQIDN0:68[0367]DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQNVGAAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASNLYTGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDIATYFCQQYSNYPTFGSGTKLGIK[0368]23A11[0369]分别将针对重链的人种系框架序列VH1-2和针对轻链的人种系框架序列VK7-3用于⑶R移植。[0370]通过向种系序列（SEQIDNO:89直接移植3个⑶R以及分别针对HC变体3移植回复突变V20L、M48I、V68A、M70L、R72V、T75K、R87TSEQIDN0:71和针对HC变体5移植回复突变M48I、M70L、R72VSEQIDN0:189，SEQIDN0:69中第1个氨基酸转变成Q获得HC变体3和5参见图15A。[0371]23A11HC的种系序列：[0372]VH1-223A11-HC-种系，SEQIDNO:89:[0373]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHffVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR[0374]VH1-2变体323A11-HC-V3，SEQIDN0:61:[0375]QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTTYWIHWVKQRPGQGLEfflGMIQPNSGGTKYNDQFKNRATLTVDKSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYffGQGTTLSISS[0376]VH1-2变体523A11-HC-V5，SEQIDN0:189:[0377]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTTYWIHWVRQAPGQGLEfflGMIQPNSGGTKYNDQFKNRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYffGQGTTLSISS[0378]通过向种系序列（SEQIDNO:90直接移植3个⑶R以及分别针对LC变体3移植回复突变P15V、P47S、Q54R、V62I、G72R、N89T、L93HSEQIDN0:72和针对LC变体5移植回复突变P15V、P47A、Q54R、V62I、G72R、N89T、L93QSEQIDN0:70获得轻链变体3和5参见图15B。[0379]23A11LC的种系序列[0380]VK7-323All-LC-种系，SEQIDN0:90:[0381]DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSELGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCLQSKNFP[0382]VK7-3变体323A11-LC-V3，SEQIDN0:72:[0383]DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQSPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCHQSNDDPYTFGGGTKLETK[0384]VK7-3变体523All-LC-V5，SEQIDN0:70:[0385]DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQAPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCQQSNDDPYTFGGGTKLETK[0386]23F11[0387]分别将针对重链的人种系框架序列VH1-2和针对轻链的人种系框架序列VK7-3用于⑶R移植。[0388]通过向种系序列（SEQIDNO:91直接移植3个⑶R以及分别针对重链HC变体4移植回复突变V20L、M48I、R67K、V68A、M70L、R72V、T74K、R87TSEQIDN0:75和针对HC变体6移植回复突变M48I、R67K、V68A、M70L、R72VSEQIDN0:77获得重链变体4和6参见图16A〇[0389]23F11HC的种系序列：[0390]VH1-223F11种系HC，SEQIDN0:91:[0391]VQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHffVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR[0392]VH1-2变体423F11-HC-V4，SEQIDN0:75:[0393]QVQLVQSGAEVKKPGASVKLSCKASGYIFTTYWMHWVKQRPGQGLEWIGMIQPNSGGTKYNEKFKKKATLTVDKSISTAYMELSRLTSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYWGQGSTLTVSS[0394]VH1-2变体623F11-HC-V6，SEQIDN0:77:[0395]QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTTYWMHWVRQAPGQGLEWIGMIQPNSGGTKYNEKFKKKATLTVDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCARGAGTVDYFDYWGQGSTLTVSS[0396]通过向种系序列（SEQIDNO:92直接移植3个⑶R以及分别针对LC变体4移植回复突变P15V、Q54R、V62I、N89T、L93QSEQIDN0:76和针对LC变体6移植回复突变P15V、Q54R、V62I、N89T、L93HSEQIDN0:78获得轻链变体4和6参见图16B。[0397]23F11LC的种系序列[0398]VK7-323Fll种系LC，SEQIDN0:92:[0399]DIVLTQSPASLAVSPGQRATITCRASESVSELGINLIHWYQQKPGQPPKLLIYQASNKDTGVPARFSGSGSGTDFTLTINPVEANDTANYYCLQSKNFP[0400]VK7-3变体423F11-LC-V4，SEQIDN0:76:[0401]DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCQQSTEDPYTFGGGTKLEIK[0402]VK7-3变体623F11-LC-V6，SEQIDN0:78:[0403]DIVLTQSPASLAVSVGQRATITCRASESVDIYGNSFMHWYQQKPGQPPKLLIYRASNLESGIPARFSGSGSRTDFTLTINPVEANDTATYYCHQSTEDPYTFGGGTKLEIK[0404]如本领域所熟知的，合成上述重链和轻链cDNA，并且与在Fe区中具有N297A突变根据Kabat的EU索引对本申请所述的重链残基编号（参见Kabat等，"ProteinsofImmunologicalInterest",USDept.ofHealthHumanServices1983的人IgGl的恒定区融合，以降低或最小化Fe区的效应功能。合成选定抗体的重链和轻链可变区基因并克隆进入表达载体，使用Promega的PureYield™PlasmidMaxiprepSystem进行大规模DNA制备。根据生产厂商的方案使用Invitrogen的ExpiFectamine™293试剂进行转染。在细胞活力约为50%时收获上清液。将蛋白A小珠与澄清的上清液在4°C下振摇孵育2小时，然后过柱。用PBS洗涤柱子内的蛋白A小珠，并使用IOOmM甘氨酸缓冲液pH3.0洗脱抗体，将其在PBS缓冲液（137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HP〇4,2mM腿2?〇4印117.4中4°：下透析过夜。最后，使用Pierce高性能内毒素脱除树脂（Invitrogen，目录号：88271除去内毒素。通过SDS-PAGE和SEC-HPLC对纯化抗体进行表征。[0405]2.通过ELISA测定人源化抗体与hPD-Ll的结合[0406]在高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用高pH包被缓冲液包被0.5ygml的人PD-Ll-hisAcrobiosystems，目录号PD1-H5229100μ1孔并在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温-20，并将板在室温下孵育2小时。然后，加入用稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.01%吐温-20系列稀释的人源化抗体在293细胞中产生并在室温下孵育1小时。之后，使用洗涤缓冲液洗板3次。随后，将稀释缓冲液中HRP缀合的山羊抗-人Fc抗体Abeam加入板的各孔中，100μ1孔。然后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，而后用pH7.4的洗涤缓冲液洗板3次，200μ1孔。最后，将TMB以100μΐ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450ηΜ处读板参见图17Α和17Β。[0407]3.通过ELISA测定hPD-Ι与hPD-Ll结合的阻断[0408]在高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc上包被lygmlhPD-Ll-Fc100μ1孔在4°C下孵育过夜。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次。每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温-20，并将板在室温下孵育2小时。然后，加入使用稀释缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.Ol%吐温-20系列稀释的抗体（即在293细胞中产生的人源化486、23?11、23六11和亦是在293细胞中产生的参照抗体BM-GT和BM-ME并在室温下孵育1小时。然后，使用上文所述的方法洗板3次。加入lygml生物素化的hPD-l-N297AAcrobiosystem并在室温下孵育1小时。洗板3次后，将在稀释缓冲液中以1:5000稀释的HRP缀合的中性亲和素抗体Pierce溶液加入板的各孔中，ΙΟΟμΙ孔。随后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，然后使用洗涤缓冲液洗板3次250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2S〇4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nM处读板（参见图18A至18D。[0409]图18中的数据表明一些人源化抗体与其他抗体相比在抑制人PD-Ll与人PD-I结合方面具有显著更高的效力。[0410]4.通过FACS测定hPD-Ll抗体与HCC827上的hPD-Ll的结合[0411]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将用封闭缓冲液系列稀释的人源化PD-Ll抗体在293细胞中产生）（ΙΟΟμΙ管）加入相应管中并在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后加入封闭缓冲液中的二抗1:200稀释的家兔抗-人IgG-PEΙΟΟμΙ管）。将细胞在4°C下孵育1小时，然后用PBS洗涤两次，随后将每个样品的细胞重悬于150μ1PBS中。然后将细胞转移至FACS管并用流式细胞仪ACEABioscienceNovocyte检测抗体与细胞的结合参见图19。[0412]5.通过FACS测定hPD-Ι与HCC827上的hPD-Ll结合的阻断[0413]收集经IFN-γ刺激500Uml刺激2天）的对数期HCC827细胞并在封闭缓冲液5%BSA+roS中重悬。每管加入2X105个细胞，然后用I3BS洗涤一次（1500rpm，5分钟，室温）。将用封闭缓冲液系列稀释的人源化PD-Ll抗体对于下述实验中的小规模生产，将在293细胞中表达的抗体称为“旧”抗体，将在CHO细胞中产生的抗体称为“新”抗体。即4B6-H3L4、4B6-H4L3、23A11-H3L5293和23F11H4L4293是在293细胞中产生的；23A11-H3L5CH0和23F11H4L4CH0是在CHO细胞中产生的）（ΙΟΟμΙ管加入相应管中并在4°C下孵育1小时。然后用ImlPBS洗涤细胞两次，随后加入3ygml生物素化的hPD-l-N297A100yl管并在4°C下孵育1小时。用PBS洗涤3次后，向各管中加入封闭缓冲液中1:200稀释的链霉亲和素-PE100μΐ管）。将细胞在4°C下孵育1小时，然后用PBS洗涤两次，随后将每个样品的细胞重悬于150μΐPBS中。然后将细胞转移至FACS管并用流式细胞仪ACEABioscienceNovocyte检测hH-l-N297A与细胞的结合参见图20Α和20Β。[0414]实施例16:在混合淋巴细胞反应MLR中评估纯化的人源化抗体刺激T细胞活化的能力[0415]为评估抗-PD-Ll抗体减轻PD-1PD-L1介导的T细胞活化的抑制的能力，我们进行了混合淋巴细胞反应MLR测定。在第一项实验中，从新鲜人血液的PBMC中分离粘附性外周血单核细胞，得到树突细胞DC。将PBMC以2X106ml的密度铺板于无血清培养基的6孔板中。2小时后，弃去悬浮细胞并用10ngmlGM-CSF和30ngmlIL-4处理粘附性细胞。每3天更换一次培养基，并在第6天加入20ngmlTNFa使DC细胞成熟。在第7天时，使用抗-CDlIc-PEBiolegend和抗-HLA-DR-APCBiolegend通过FACS检测DC的表型。使用CD4+T细胞富集试剂盒StemCellInc.从另一供体的新鲜血液中分离⑶4+T细胞。在用丝裂霉素C处理DC10ygml处理2小时后，以DC与CD4+T细胞比例为1:10的比例加入DC和CD4+T细胞和PD-Ll抗体200μ1孔），并且在37°C、5%C02条件下的孵箱中孵育5天。然后，使用IL-2du〇-setRD和IFN-γ检测试剂盒Peprotech检测上清液中的IL-2和IFN-γ参见图21A和21B。通过CellTiter-Glo发光细胞活力测定试剂盒Promega测量T细胞的增殖情况。[0416]在第二项实验中，收获外周血并在加入1:1体积的Ficoll溶液后分离PBMC，随后离心30分钟。将PBMC用于使用包被了⑶14的磁珠和⑶4阴性磁珠分离单核细胞和T细胞。通过在存在500UmlIL-4RD和250UmlGM-CSFRD条件下培养7天将上述获得的单核细胞分群，随后加入l〇〇ngmlTNFaRD并继续培养3天。对上述获得的DC细胞计数并且每孔1〇〇μ1体积中的10，〇〇〇个DC细胞与50μ1体积中的100，OOO个T细胞混合，然后加入50μ1体积的测试抗体或对照IgG，在额外加入或不加入人H-L1的条件下终浓度lygml双复孔培养5天。收获上清液并使用ELISARD对IL-2和IFNy的浓度定量参见图21C和21D。[0417]实施例17:通过Biacore评估选定的人源化抗-PD-Ll抗体的结合亲和性[0418]通过注射1:1新制的50mMN-羟基琥珀酰亚胺NHS:200mM1-乙基-3-3-二甲基氨基丙基_碳二亚胺EDC10μ1分钟注射7分钟），来活化每个流动池中的CM5传感器芯片。然后将用IOmM乙酸钠缓冲液稀释的浓度为lOygml的抗-人Fc抗体GEHealthcare以1〇μ1分钟流速注射至活化的芯片上HBS-EP运行缓冲液：IOmMHEPES，150mMNaCl，3.4mMEDTA，0.005%表面活性剂P20，pH7.4。通过注射lM乙醇胺（10μl分钟注射7分钟），来封闭剩余的活性偶联位点。每个流动池的固化水平为〜9000RU。在FC2中用抗-人FcIgGGEHealthcare来捕获抗体，信号水平在200〜300RU。将FCl作为参照池。在捕获抗体后以不同浓度注射抗原。抗体结合抗原的结合时间为180秒。表面再生条件为以10μ1分钟注射GlypHl.5120秒。用BiacoreXlOO评估软件2.0版Biacore计算捕获抗体的信号减去未捕获抗体的信号。[0419]表6:与抗原结合的抗体的亲和性参数[0421]已知人ro-1hro-Ll之间的相互作用较弱，并且具有约7500+-2200nM的KdN=6，ChengX等，Structureandinteractionsofthehumanprogrammedcelldeathlreceptor，JBiolChem.2013;28817:11771-85。因此，如表6中所示，我们的抗体与hPD-Li结合的亲和性比现有技术中的ro-i高100倍。[0422]实施例18:对选定H-L1中和人源化抗体的pH依赖性结合的评估[0423]在高结合透明聚苯乙烯96孔板用高pH包被缓冲液包被0.5ygml的ro-Ll-his100μΐ孔并在4°C下孵育过夜。然后将包被的板在自动洗板仪上用ros+o.1%吐温20Sigma洗涤一次。随后，每孔加入200μ1封闭缓冲液，并将板在室温下孵育2小时。吸出封闭缓冲液后，加入在pH7.4中的稀释缓冲液中系列稀释的抗体（即由CHO或293细胞产生的23八11!131^5、23?11!1礼4，并且将板在室温下孵育40分钟。然后，用?!17.4的洗涤缓冲液250μΐ孔洗涤一次，之后加入PH7.4或pH5.5的洗涤缓冲液（ΙΟΟμΙ孔），并且在室温下振荡孵育2小时。随后，使用pH7.4的洗涤缓冲液洗板3次，然后向板的各孔中加入用pH7.4的稀释缓冲液稀释的HRP缀合的山羊抗-人Fc抗体Abeam溶液（ΙΟΟμΙ孔）。在将板在室温下孵育60分钟后，用?!17.4的洗涤缓冲液洗板3次20^1孔）。最后，将了1^以10^1孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450ηΜ处读板（参见图22Α至22Ε。[0424]在较大pH范围内对pH依赖性hPD-Ll结合的表征[0425]在不同pH值（如pH4、pH4.5、pH5.0、pH5.5、pH6.0、pH7.4下进一步测定了pH依赖性结合亲和性。以与上文所述的方法类似的方式通过ELISA进行测量。在高结合透明聚苯乙烯96孔板用高pH包被缓冲液包被0.5ygml的hPD-Ll-his100yl孔并在4°C下孵育过夜。然后将包被的板在自动洗板仪上用TOS+0.1%吐温20Amresco洗涤3次，每次振荡IOs。随后，每孔加入200μ1封闭缓冲液（1%BSASolarbio+1%正常山羊血清Solarbio+0.05%吐温20Amresco，之后将板在室温下孵育2小时，并且如上所述洗板3次。吸出封闭缓冲液后，加入ΙΟΟμΙ在pH7.4的稀释缓冲液（I%BSASolarbio+1%正常山羊血清（Solarbio+〇.〇1%吐温2〇0111代83〇中系列稀释的抗体（即由293细胞产生的23411!131^5、23?11!1礼4和22C9-C，并且将板在室温下孵育40分钟。然后，使用pH7.4、pH6.0、pH5.5、pH5.0、pH4.5或pH4·0的洗涤缓冲液洗板一次（250μ1孔），之后加入pH7·4或pH5·5的洗涤缓冲液（ΙΟΟμΙ孔），并且在室温下继续振荡孵育2小时。随后，使用pH7.4的洗涤缓冲液洗板3次，然后向板的各孔中加入用pH7.4的稀释缓冲液稀释的山羊抗-hlgGHRP抗体（1:20000，Abeam溶液ΙΟΟμΙ孔）。在将板在室温下孵育60分钟后，用pH7.4的洗涤缓冲液洗涤3次250μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中作用15分钟并使用0.16ML硫酸终止反应50μ1孔）。在ThermoMultiscanFC上在450nm处读板参见图23A-23F。测量重复进行三次。[0426]与在pH7.4下相比，每种抗体在低pH下的结合信号更低。在特定抗体浓度下，pH越低，结合信号越低。在pH5下，三种检测抗体在高浓度下例如，0.1、0.3或Uigml的结合信号小于其在pH7.4下信号的50%;在pH5.5下，三种检测抗体的信号小于其在pH7.4下信号的75%。[0427]实施例18:通过丙氨酸扫描对选定抗-PD-Ll进行表位分组binning[0428]1.突变人H-L1重组蛋白的产生[0429]在体外合成编码胞外人PD-Ll氨基酸19-238和人IgGl的Fc片段的cDNASEQIDN0:107为氨基酸序列，且SEQIDN0:108为相应的DNA序列）。通过如下所述的重叠PCR，使用如表7中所示的引物Dr.OligoBLP-192，Biolytic扩增在如下所列的指定位置具有单个氨基酸改变的人PD-Ll变体。用分别针对5’端和3’端的HindIII和BamHI的限制性内切酶消化所得到的片段。然后根据生产厂商的说明，使用Syno组装混合试剂Synbio，通过同源重组的方法将PCR产物克隆进入pcDNA3.1+载体。使用QIAGEN质粒Mega试剂盒QIAGEN对质粒进行纯化。[0430]氨基酸序列（SEQIDNO:107:[0434]用上文产生的野生型PD-Ll质粒SEQIDNO:107和108作为模板，使用大型引物产生整合序列的两个区段（表7，并且通过同源重组完成连接。然后，将产物克隆进入pcDNA3.1+载体，在通过测序单个阳性集落以识别变体后，证实成功产生了PD-Ll突变。PCR程序和条件如下所示：[0435]步骤1:产生变体的两个大型片段[0437]表7:变体突变的引物序列[0441]注释:AR-反向引物，BF-正向引物[0442]由另一公司Genewiz中国苏州）构建另外20个变体。进行与SynbioTech类似的方法合成ro-Ll变体。并且，在表8中描述了所使用的针对突变位点的大型引物。[0443]表8:变体突变引物序列[0447]注释:AR-反向引物，BF-正向引物[0448]随后，将突变体和野生型PD-Ll的这些质粒转染进入293TATCC®CRL3216细胞系。首先，在60mm平皿中接种5XIO6个293T细胞，以确保初始转染率为60%〜80%。然后在400μ1IXHBS中稀释IOygDNA，孵育约5分钟。向上述混合物中加入10μ125kDa线性PEI转染试剂溶解在IXHBS中，lmgml储存液），以确保DNAPEI比为1:2.5。然后，将混合物逐滴加入293T的平皿中。约6-8小时后，更换培养基，替换成完全DMEM。72小时后，分别用0.22μπι滤器收集细胞培养基上清，然后在_80°C条件下保存备用。[0449]2.通过ELISA测定PD-Ll抗体的结合[0450]按照如下所述通过ELISA将上清液用于检测H-L1抗体的结合。[0451]2.1对于小鼠抗体：[0452]在高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用由高pH缓冲液包被0.5ygml的抗-人Fc抗体Abeam在室温下孵育一小时（ΙΟΟμΙ孔）。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次，随后每孔加入200μ1封闭缓冲液PBS+1%BSA+1%正常山羊血清+0.05%吐温20。将板在4°C下孵育过夜。然后用洗涤缓冲液洗板一次，并且向每孔中加入160μ1上述DMEM培养上清液含有不同突变的人PD-Ll-Fc蛋白或500ngml野生型人ro-Ll-Fc蛋白），在室温下孵育1小时。随后，使用上文所述的方法洗板3次。加入0.5ygml小鼠抗-PD-Ll抗体并在室温下孵育1小时。使用pH7.4洗涤缓冲液洗板3次后200μ1孔），随后将在稀释缓冲液中稀释的HRP缀合的小鼠IgG抗体溶液（1:20000,PierceΙΟΟμΙ孔）加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，再用ρΗ7.4洗涤缓冲液冲洗3次200μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2S〇4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nm处读板参见图24。[M53]2.2对于具有人Fc的抗体嵌合或人源化抗体）：[0454]在高结合透明聚苯乙烯96孔板Nunc用高pH缓冲液包被0.5ygml抗-人Fc小鼠抗体或能够与其他PD-Ll抗体配对的抗-hPD-Ll抗体溶液，在室温下包被一小时（ΙΟΟμΙ孔）。然后将板在自动洗板仪上使用洗涤缓冲液PBS+0.1%吐温20Sigma洗涤一次，随后每孔加入20^1封闭缓冲液师3+1%83六+1%正常山羊血清+0.05%吐温20。将板在4°：下孵育过夜。然后用洗涤缓冲液洗板一次，并且向每孔中加入160μ1上述DMEM培养上清液含有不同突变的人PD-Ll-Fc蛋白或500ngml野生型人PD-Ll-Fc蛋白），在室温下孵育1小时。随后，使用上文所述的方法洗板3次。加入0.5ygml如上产生的生物素化的人源化抗-PD-Ll抗体（23Fll-H4L4-bio和23All-H3L5-bio或ro-Ι蛋白并在室温下孵育1小时。使用pH7.4洗涤缓冲液洗板3次后200μ1孔），随后将在稀释缓冲液中稀释的HRP缀合的抗-小鼠Fe抗体Abeam或HRP缀合的中性亲和素（1:5000,Pierce溶液（ΙΟΟμΙ孔加入板的各孔中。之后，将ELISA板在室温下孵育60分钟，再用ρΗ7.4洗涤缓冲液洗板3次（200μ1孔）。最后，将TMB以ΙΟΟμΙ孔加入各孔中并使用0.64ΜH2SO4终止反应。在ThermoMultiscanFC上在450nm处读板参见图24。[0455]表9总结了在ELISA测定中每个针对人H-L1的所检测抗体所需的hPD-L1上的关键残基。标记了人ro-Li蛋白上导致结合信号与野生型蛋白相比显著降低的氨基酸残基突变。[0456]表9:每种抗体所需hPD-Ll上的关键残基汇总[0457][0459]表9中的数据表明具有pH依赖性结合性质的抗体利用了很多下述氨基酸来与人PD-Ll的结合。[0460]R125和S80对于PD-I与这两种类型的PD-Ll抗体例如，pH依赖性和非-pH依赖性）的结合是重要的，其中此前没有报道过S80对于本申请提供的ro-Ll抗体结合的重要性。[0461]与非-pH依赖性结合抗体（包括参照抗体，如BM-ME相比，E58和R113对于22C9、23A11、23F11及其人源化版本更加重要，其中E58是我们对抗体22C9、23A11、23F11进行分析后发现的新位点并且未在现有技术中被揭示，因为其对于ro-ι与ro-Ll的结合并不重要。[0462]M115和K124对于22C9是独特的，但是已知这两个残基对于PD-I与PD-Ll的结合是重要的。[0463]N63和Y81对于23F11及其人源化23F11和人源化23A11而非23A11是独特的，但是其对于ro-i与ro-Li的结合并不重要，其对于参照抗体与hPD-Li的结合也不重要，因此是新位点。[0464]164对于23F11及其人源化版本是独特的，并且现有技术中并不知晓其对于Η-1与PD-Ll的结合是否重要。[0465]K62对于23A11的人源化版本是独特的，并且现有技术中并不知晓其对于PD-I与PD-Ll的结合是否重要。[0466]Yl23对于4B6和参照抗体是最关键的，但是对于包括pH依赖性抗体在内的其他抗体不太关键其对于另一种pH依赖性结合抗体22C9也是重要的）。[0467]Y56对于21F11是独特的，并且现有技术中并不知晓其对于PD-I与PD-Ll的结合是否重要。[0468]已报道抗-PD-Ll抗体中R113和R125突变为A将导致其与人PD-Ll的结合能力的丧失（参见美国专利号8779108，并且如LinDY等，ProcNatlAcadSciUSA.2008年2月26日；1058:3〇ιι-6中所述，已知其对于ro-i与I3D-Ll的结合是重要的。[0469]实施例19:用于体内研究的抗-PD-Ll抗体的大规模生产[0470]使用在CHO-Kl细胞中的瞬时表达生产抗体。使用蛋白A亲和柱纯化所生产的抗体，并且在脱盐后，以5mgml将抗体在I3BS中制剂，其内毒素水平〈3单位mg。使用SDS-PAGE凝胶和SEC-HPLC表征所得抗体的纯度。[0471]使用CHO-Kl细胞的重组抗体的瞬时表达和纯化[0472]合成选定抗体的重链和轻链可变区基因并将其克隆进入表达载体。将所得到的表达构建体用于转染适于在无血清培养基中生长的CHO-Kl细胞。在IOLApplikon生物反应器中生长10天后，收获培养基并使用超滤器除去细胞和细胞碎片。然后，超滤浓缩澄清的上清液并将其上样至预制的蛋白A人IgG或G-琼脂糖小鼠IgG柱。在UV监测器监测下用平衡缓冲液冲洗至基线后，用〇.IM柠檬酸pH3.5洗脱柱，立即用I.OMTris-HCl缓冲液pH8.0中和洗脱得到的抗体，并且通过两次缓冲液交换将其在2-8°C下用PBSpH7.2，Invitrogen透析过夜。将纯化的抗体通过0.22μηι无菌注射器滤器过滤，分装后在-80°C或更低温度下保存。[0473]实施例20:抗-PD-Ll人源化抗体的体内评估[0474]如实施例14中所述评估人源化抗-PD-Ll抗体的体内活性。[0475]1.在MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中人源化H-L1抗体的抗肿瘤活性[0476]如实施例14中所述在MC38人-PD-Ll敲入肿瘤模型中检测人源化PD-Ll抗体4B6-H3L3-N297A的抗肿瘤活性，结果如表10和图25中所示（显示了使用I3BS、BM-GT和4B6-H3L3-N297A治疗的结果）。[0477]表10:PD-Ll抗体对MC38hPD_Ll同源小鼠肿瘤模型的抗肿瘤活性的研究设计[0479]2.腹腔注射人源化抗体对MC38hPD_LlKI肿瘤生长的抑制[0480]本研究旨在评估以lmgkg、3mgkg或10mgkg剂量腹腔注射人源化抗-PD-Ll抗体抑制肿瘤生长的作用。简言之，与此前一样在C57BL6小鼠中接种2Xl〇WMC38hPD-Ll^瘤细胞并使其生长6天。此时，选择平均肿瘤体积SO-IOOmm3的小鼠并将其随机分组，每组8只小鼠。从第6天开始，每周3次，以lmgkg、3mgkg或10mgkgBM-GT或23F11-H4L4lmgkg将各测试抗体等体积地通过腹腔注射给予每只小鼠。在研究结束时（第25天通过CO2吸入处死小鼠。每周两次，使用卡尺INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示计算体积:V=0.5aXb2,其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。如果肿瘤体积缩小至小于处理开始时肿瘤体积的50%，但是未低于可测量尺寸，则记录为部分肿瘤消退PR，或者如果肿瘤负荷变得难以察觉，则记录为完全肿瘤消退（CR参见表11。使用PrismGraphPad分析结果并以平均值土S.E.M表示。通过T-检验进行两组之间的比较，如果P〈0.05则认为差异具有显著性。图26E显示了在给予不同抗体BM-GT、BM-ME、23A11-H3L5和23F11-H4L4的每只小鼠中测得的肿瘤体积。RTV表示与在同一小鼠中第1天测得的肿瘤体积相比的相对肿瘤体积，TV表示在最后一天即研究的第25天测得的肿瘤体积。[0481]表11:在第25天测得的肿瘤消退情况[0484]注释:与载剂比较，*ρ〈0·05;#Ρ〈0·01·[0485]PR部分消退）：肿瘤体积缩小至小于处理开始时肿瘤体积的50%，但不低于可测量尺寸[0486]CR完全消退）：肿瘤负荷已变得难以察觉[0487]3.静脉注射人源化H-L1抗体对MC38HPD-L1KI肿瘤生长的抑制情况[0488]本研究旨在评估静脉注射人源化抗体时其抑制肿瘤生长的作用，以预计如何将其用于患者。简言之，与此前一样在C57BL6小鼠中接种MC38hro-Ll肿瘤细胞并使其生长10天。此时，选择平均肿瘤体积180-220mm3的小鼠并将其随机分组，每组12只小鼠。在第0天和第15天以lmgkg将各测试抗体等体积地通过静脉注射给予每只小鼠。通过吸入CO2处死小鼠。每周两次，使用卡尺（INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示计算体积:V=0.5aXb2,其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。如果肿瘤体积缩小至小于处理开始时肿瘤体积的50%，但是未低于可测量尺寸，则记录为部分肿瘤消退PR，或者如果肿瘤负荷变得难以察觉，则记录为完全肿瘤消退CR参见表12。使用PrismGraphPad分析结果并以平均值±S.E.M表示。通过T-检验进行两组之间的比较，如果P〈0.05则认为差异具有显著性。[0489]图29中的数据表明，与其他剂量相比，lmgkg的23A11-H3L5和23F11-H4L4在相同条件下更有效地抑制肿瘤生长。图27A表明与载剂对照相比，lmgkg的23F11-H4L4或23A11-H3L5分别产生91%和82%的肿瘤生长抑制，而lmgkg的参照抗体产生41.6%的肿瘤生长抑制。图29A表明lmgkg23F11-H4L4或23A11-H3L5抑制MC38hro-Ll敲入肿瘤生长的水平与10mgkgBM-GT相似，并且在相同条件下其显示出无统计学显著差异的肿瘤抑制活性。因此，以23F11-H4L4和23A11-H3L5示例的抗体的体内活性是参照抗体BM-GT也称为MPDL-3280A的约10倍，BM-GT不以pH依赖的方式与抗原结合参见图29A和29B。[0490]表12:在第26天测得的肿瘤消退情况[0492]#相对于载剂p值〈0.01;相对于载剂p值〈0.005[0493]PR:部分响应，与初始时间点相比，肿瘤体积缩小50%[0494]CR:完全响应，与初始时间点相比，肿瘤体积缩小100%[0495]在研究终点时每只小鼠肿瘤尺寸的变化用瀑布图显示，并且以与初始时间点相比的肿瘤尺寸变化表示（参见图28A至28D。肿瘤尺寸增加超过100%的小鼠以100%表示，月中瘤尺寸增加小于100%或与初始时间点相比减小的小鼠以确切变化的百分比表示。[0496]上述结果表明在lmgkg剂量下23F11-H4L4和23A11-H3L5与参照抗体BM-GT相比显著更强地抑制肿瘤生长的作用（参见图27和图28。此外，lmgkg23A11-H3L5和23F11-H4L4抑制肿瘤生长的能力与l〇mgkgBM-GT相当（参见图29A和29B。而且，与剂量为lmgkg时相比，剂量为l〇mgkg时23A11-H3L5或23H11-H4L4的肿瘤生长抑制活性没有进一步增加，但是在这种情况下BM-GT的活性显著增加。因此，具有pH依赖性抗原结合的抗体可能是能够在非常低的剂量下抑制肿瘤生长的新类抗体。[0497]4.肿瘤再攻毒研究[0498]为了了解用H-L1抗体静脉注射治疗后肿瘤完全清除的小鼠是否能够持续免疫应答和控制新肿瘤出现，我们在小鼠的一个亚组中使用新的肿瘤细胞对小鼠进行再攻毒挑战，所述亚组的小鼠在给予lmgkg23A11-H3L5或23F11-H4L4时，到第10-35实现完全响应。然后，在接种后第35天向这些小鼠注射2XIO6个新肿瘤细胞只。新输注的肿瘤细胞能够在输注后的前5至10天生长，但是随后肿瘤尺寸开始缩小，并且到第50天时（再攻毒后15天），小鼠均测量不到肿瘤。这表明，尽管此时并不存在抗体，但这些小鼠已对相同的肿瘤细胞产生了记忆，并且可以持久应答，产生肿瘤抑制效应参见图30。[0499]实施例21:选定的依赖性中和抗体的肿瘤渗透作用评估[0500]抗体需要渗透到肿瘤中才能发挥其作用。为评估pH依赖性抗体是否在渗透进入肿瘤方面具有优势以及其在肿瘤中的停留时间是否具有差异，我们进行了体内成像研究。[0501]简言之，采用近红外荧光标记染料CF750,目录号99952,批号：12M0413，BI0TIUM标记测试抗体BM-GT和23F11-H4L4:在I3BS中将抗体稀释为0.lmgml，然后以1:9的比例将0.8ml的各抗体溶液用移液管移入装有已预热的10X反应缓冲液的管中，使得抗体溶液含有终浓度为IX的反应缓冲液。通过用移液管上下吹打几次将溶液混合后，将各管中的全部溶液转移至含CF染料的管中，涡旋混合几秒并避光孵育30分钟。然后，将约0.2ml的抗体-染料溶液静脉注射至每只小鼠。[0502]MC38hPD-Ll同源肿瘤模型[0503]将2106个]\^38砂0-1^1细胞皮下植入8周龄0578176小鼠中，选择12只小鼠并随机分成4组。当肿瘤生长至约220_3时，向小鼠静脉注射0.2ml抗体-染料溶液。[0504]在给药后1小时、4小时、24小时、48小时、96小时、第7天、第11天、第15天、第18天和第21天的时间点，麻醉后用IVISLuminaII对每只小鼠的肿瘤部位成像。简言之，在各时间点，在IVIS成像前用50mgkg戊巴比妥钠对每只小鼠进行麻醉。当动物停止移动时，将动物置入观察箱中（肿瘤侧朝上并关闭箱门，然后使用活体成像软件对每只小鼠成像。[0505]显示了BM-GT和人源化23F11即23F11-H4L4的辐射信号的实例（参见图31A。对每个时间点每只小鼠的平均福射信号进行定量并用GraphPadprism分析，如图3IB中所示。结果表明肿瘤中抗体23F11-H4L4与参照抗体相比具有显著更高的辐射信号，因此与参照抗体相比有更多抗体停留在肿瘤中。随着时间的推移在肿瘤中的抗体越来越多，用23F11-H4L4处理的三只小鼠中的两只肿瘤明显缩小，而用BM-GT处理的小鼠均未出现肿瘤明显缩小参见图31C。因此，具有pH依赖性性质的抗体23F11-H4L4可能具有独特的优势并且在抑制肿瘤生长方面更加有效。图31B图例中的2-1、2-2、2-3、4-1、4-2和4-3分别表示第2组和第4组中的1、2或3号小鼠。[0506]实施例22:选定的人源化抗-PD-Ll抗体与其他肿瘤调节剂的联合疗法[0507]为了评估检验点抑制剂抗-PD-Ll抗体和抗-VEGFR2抗体抗血管生成联用是否能够更好地控制肿瘤生长，用20mgkg对小鼠VEGFR2具有中和活性的抗体DC101，或者亚最佳剂量0.3mgkg的H-L1抗体23A11-嵌合，或二者联合治疗hPD-LlMC38肿瘤。简言之，与此前一样在C57BL6小鼠中接种2\106个此381^0-1^1肿瘤细胞并使其生长3天。此时，对小鼠进行随机分组，每组8只小鼠。从第3天开始，连续3周每周3次，以0.3mgkg23A11-嵌合或20mgkgDClOl或二者联合，将各测试抗体通过腹腔注射给予每只小鼠。在研究结束时通过吸入CO2处死小鼠。每周两次，使用卡尺（INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示计算体积:V=0.5aXb2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。使用PrismGraphPad分析结果并以平均值土S.E.M表示。通过T-检验进行两组之间的比较，如果P0.05则认为差异具有显著性。数据表明联合治疗在抑制肿瘤细胞生长方面更加有效参见图32A至图32C。[0508]为进一步证明联合疗法比单一疗法更有效，我们在肿瘤体积约ISOmm3时开始治疗。我们在对人源化PD-Ll或VEGFR2抗体DClO1不太敏感的小鼠品系中成对给予lmgkg或3mgkg这两种抗体。所述治疗每周通过静脉注射给予一次，持续2-3周。数据表明这两种治疗联用在抑制肿瘤生长方面比单独的抗体显著地更为有效参见图32D和32E。[0509]因此，我们证实了人源化PD-Ll抗体与血管生成抑制剂（如VEGFR2抗体联用可能是用于治疗己建立的肿瘤的生长或新形成肿瘤的发展的有效方法。[0510]实施例23:PD-Ll抗体的热稳定性[0511]利用毛细管细胞差示扫描量热法DSC通过检测在升温过程中样品和对照的热量差异评估蛋白的热稳定性。特别地，其用于测量热转变中点Tm，其指示蛋白在液体中的相对稳定性。用缓冲液（20mMHis-His-HCl，5%蔗糖，pH=6.0将抗体23F11-H4L4或23A11-H3L5在CHO细胞中产生稀释至lmgml并加入DSC96孔板。用MicroCalVP-DSC毛细管细胞微型量热仪GE对样品进行检测，温度范围为10〜110°C，扫描速率为200°C小时，并且用MicroCalVP毛细管DSC自动分析软件对结果进行分析。毛细管细胞DSC检测结果如下表13以及图33A和33B中所示。[0512]如表13所示，23F11-H4L4抗体显示显著升高的Tm值（即Tm2,其表示Fab片段的Tm，而Tml表示CH2片段的Tm。[0513]表13[0515]实施例24:通过E58对抗-PD-Ll抗体的表位分组[0516]使用如实施例18中所述的基于ELISA的结合测定，分析E58残基对于本申请提供的抗-PD-Ll抗体结合的重要性。生产野生型抗-PD-Ll蛋白或具有E58A的突变体，在同一块板上测定抗体与两种蛋白的相对结合，结果如下表14中所示：[0517]表14[0518][0519]数据表明残基E58对于23F11和23F11-H4L4是关键的，当人PD-Ll中的该残基突变为丙氨酸时，结合降低90%以上。类似地，23A11-H3L5和22C9的结合也降至WTPD-Ll蛋白结合的信号的8.3%和17.2%。另一方面，当E58突变为Ala时，BM-GT或BM-ME的结合降至野生型I3D-Ll结合信号的51%或69.8%。类似地，23A11、26F5和4B6的结合也降至野生型I3D-Ll蛋白的51.7%、60.6%和69.6%。最不同的是，当E58突变为Ala时，18G4与I3D-Ll的结合完全没有降低。因此，不同抗体与TO-Ll蛋白的结合对于E58的需求是不同的，其对于23F11、23F11-H4L4和22C9是关键残基。[0520]还注意到18G4是一种表位结合性质与本申请公开的其他抗-PD-Ll抗体有非常大区别的抗体，在通过丙氨酸扫描分析的39个不同氨基酸中其仅需要S80的结合。该抗体在体内抑制肿瘤生长方面也是非常有效的。[0521]实施例25:人源化H-L1抗体的内化[0522]为评估23F11-H4L4来源于CHO细胞是否能够被内化，我们进行了下述实验。首先用pH敏感性染料pHAb胺活性染料Sigma，G9845标记山羊抗-人Fc二抗。这种染料在中性pH下无荧光，但是在酸性pH下具有很强的荧光。当用这种染料标记的抗体内化进入胞内的内涵体pH6.0-6.5和溶酶体4.5-5.5时，能够检测到较强的荧光信号。用含10%胎牛血清Hyclone的RPMI-1640培养基培养MC38-hPD-Ll细胞MabSpace。离心收集对数期生长细胞并以2XIO4孔的密度50μ1孔将细胞接种至96孔板中，使细胞贴壁过夜。然后，将2ygml用pHAb胺活性染料标记的山羊-抗-人FeJacksonImmunoResearch，目录号109-005-098加入每个孔中（25μ1孔），随后向每个孔中加入系列稀释的23F11-H4L4或hlgGl25μ1孔）。将抗体与细胞在37°C下孵育6小时或24小时。孵育结束后，除去培养基并向每个孔中加入ΙΟΟμΙPBS。使用VarioskanFlashThermoScientific通过读取Ex532nmEm560nm下的光谱确定培养板各孔中抗体的信号。图35中的数据表明，在6或24小时后，细胞中的荧光信号以浓度依赖性的方式显著增加。这些结果表明23F11-H4L4在与MC38hPD-Ll细胞表面上的hPD-Ll结合后能够有效内化参见图35。[0523]实施例26:人源化H-L1抗体与活化的T细胞的体外结合[0524]使用Ficoll-Paque密度梯度离心从白细胞分离试剂盒（leukapheresispack中分离外周血单核细胞并将其重悬于加入了2%FBS的PBS中。用培养基将细胞稀释至密度为0.5XIO7个细胞ml，然后将其加入用抗-人CD3抗体0KT3，ebioscience，目录号16-0037lygml，Iml孔包被的培养板中。将抗-人⑶28BD，目录号555725加入各孔中，然后将细胞在37°C下在含有加入了10%FBS的RPMI1640的6孔板中培养3天。随后，收集细胞并置入含FACS缓冲液PBS+5%BSA的96孔圆底培养板中。离心并弃去上清后，加入系列稀释的23F11-H4L4抗体，或者作为阴性对照的具有N297A突变的hlgGl。将培养板在4°C下孵育1小时，然后使用PBS洗涤细胞3次。之后，将2.5μ1孔小鼠抗人CD3-Alexa488BD，目录号557705和5μ1孔抗人IgG-APCBiolegend，目录号409306加入每个孔中并将板在4°C下孵育一小时，洗板3次后用流式细胞仪BeckmanCytoflex进行分析。[0525]图36A和36B中的数据表明23F11-H4L4能够以剂量依赖性的方式与活化的T细胞上表达的ro-Li结合，而其与未活化的τ细胞几乎不结合。[0526]实施例27:PD-L1抗体在接种MC38hro-Ll细胞的hPD-Ι敲入小鼠模型中的体内有效性研究[0527]在此前的实验中（例如，实施例14和20，同源小鼠中的ro-Ι蛋白是小鼠来源的，并且免疫抑制由hPD-Ll与小鼠ro-i的结合所介导。为了进一步评估如果将小鼠ro-i换成hPD-1在人类患者中存在的情况），MC38hPD-Ll同源模型中的抗体治疗是否存在差异，我们将MC38hPD-Ll肿瘤细胞植入PD-I敲入小鼠中。特别地，在37°C下，含5%⑶2的培养箱中，将MC38hPD-Ll肿瘤细胞作为单层培养物用含10%热灭活胎牛血清ExCellBiologyUOOUml青霉素和100ygml链霉素Hyclone的RPMI1640培养基ThermoFisher中进行体外培养。通过胰酶-EDTA处理Hyclone，每周两次对肿瘤细胞进行常规传代培养。收获指数生长期生长的细胞并计数，以通过FACS分析确认hPD-Ll表达和肿瘤接种。将每只5-6周龄的PD-I敲入雌性小鼠（C57BL6_PdcdtmlhFOCDl，BeijingBiocytogenCo.,Ltd在右侧肋腹部皮下接种在〇.ImlPBS中经确认具有PD-Ll表达的MC38hPD-Ll肿瘤细胞2XIO6用于形成肿瘤。在接种大约7天后，当肿瘤尺寸达到约IOOmm3时开始治疗。每组由10只荷瘤小鼠组成参见图37A。吸取200μ1浓度为3mgml的储存液并用1.8ml制剂缓冲液组氨酸20mM，蔗糖250mM，聚山梨醇酯800.02%，pH6.0±0.2稀释得到0.3mgml的工作溶液，从而制备待测物（S卩23F11-H4L4，并且将其通过静脉注射到小鼠体内。每周两次，使用卡尺INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示计算体积:V=O.5aXb2,其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。如果肿瘤体积缩小至小于治疗开始时肿瘤体积的50%，但是未低于可测量尺寸，则记录为部分肿瘤消退PR，或者如果肿瘤负荷变得难以察觉，则记录为完全肿瘤消退CR。每个治疗组中的肿瘤尺寸示于表15以及图37B和37C中。这些数据表明，用抗体23F11-H4L4治疗导致了显著的肿瘤生长抑制，在经治疗的10只小鼠中有5只小鼠肿瘤消除或完全抗体响应，而用生理盐水处理的小鼠均有肿瘤生长且在任何小鼠中均无肿瘤消退。[0528]表15:在第31天的肿瘤生长抑制TGI率[0531]为进一步比较体内肿瘤生长抑制的相对有效性，我们进行了另一项实验。类似地，将每只5-6周龄的ro-Ι敲入雌性小鼠（C57BL6-PdcdtmlhroCDl,BeijingBiocytogenCo.，Ltd在右侧肋腹部皮下接种在0.ImlPBS中经确认具有H-L1表达的MC38hro-Ll肿瘤细胞2XIO6用于形成肿瘤。在接种大约7天后，当肿瘤尺寸达到约IOOmm3时开始治疗。每组由8只荷瘤小鼠组成。吸取0.128ml、0.384ml和1.28ml浓度为3mgml的储存液并并分别用3·712、3·456和2·58ml无菌PBSHyclone，目录号SH30256·01稀释得到0·lmgml、0·3mgml或lmgml的工作溶液，从而制备待测物，并且将其每周两次通过腹腔注射到每只小鼠体内，以达到给药剂量l、3、10mgkg。类似地，吸取1.280mL3mgmlCHO细胞来源的BM-GT加入到2.560mLPBS中，或者吸取0.662ml5.8mgml储存液加入到3.178ml无菌PBS中，从而制备BM-GTMABSPACE，在CHO细胞中产生）和具有N297A突变的对照IgGCrownBio，来自CHO细胞的AB160160，并通过每周两次向每只小鼠腹腔注射200μ1最终的稀释溶液，以达到每周两次以10mgkg通过腹腔注射给药。每周两次，使用卡尺（INSIZE在两个维度上测量肿瘤尺寸，并且使用下述公式以mm3表示计算体积:V=0.5aXb2,其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。如果肿瘤体积缩小至小于治疗开始时肿瘤体积的50%，但是未低于可测量尺寸，则记录为部分肿瘤消退PR，或者如果肿瘤负荷变得难以察觉，则记录为完全肿瘤消退CR参见表16和图38A-38C。[0532]表16:在hPD-Ι小鼠的MC38hPD-Ll同源肿瘤模型中的肿瘤生长抑制率N=8，第27天）[0533][0534]与对照IgG组相比p〈0·01;与BM-GT组相比p〈0·05[0535]来自上述实验的数据表明，在接种了表达人PD-Ll的MC38肿瘤细胞的PD-I敲入小鼠中：I23F11-H4L4显示出高效的、剂量依赖性的肿瘤生长抑制活性，在1、3和10mgkg下的总响应屮1?+〇?率分别为12.5%、62.5%和100%参见图38厶）；2311^1^的23卩11-!1礼4至少与10mgkg的BM-GT—样有效参见图38B和38C;3以3mgkg通过腹腔注射或静脉注射给药的23F11-H4L4在实现完全肿瘤消退方面显示出相似的活性50%渗见图37A-37B和38A-38C;410mgkg剂量下的23F11-H4L4与10mgkg的BM-GT相比，不仅在总体肿瘤尺寸缩小方面，而且在达到完全肿瘤消退的小鼠数量方面68对38，均显著更加有效参见图38C。因此，pH依赖性抗原结合和相关的再循环特性以及肿瘤中更长的药物停留时间可以更好的控制肿瘤和使肿瘤消退，尤其是在BM-GT的最大有效剂量下。[0536]实施例28:受体占据和小鼠药代动力学药效学[0537]为测量在单次静脉注射抗体后，在MC38hro_Ll肿瘤中抗体与靶蛋白人H-L1结合的持续时间，在抗体注射后取不同时间点的肿瘤，制备成单细胞并用FACS检测可用靶蛋白结合位点的量。特别地，在37°C下，含5%C02的空气环境中，将MC38hPD-Ll肿瘤细胞作为单层培养物在补充了10%热灭活胎牛血清仿式6118丨〇1呢7、1001]1111青霉素和10^81111链霉素Hyclone的RPMI1640培养基ThermoFisher中进行体外培养。通过胰酶-EDTA处理Hyclone，每周两次对肿瘤细胞进行常规继代培养。收获指数生长期生长的细胞并计数，以通过FACS分析确认hPD-Ll表达和肿瘤接种。将每只5-6周龄的雌性C57BL6小鼠在右侧肋腹部皮下接种在〇.ImlPBS中经确认具有PD-Ll表达的MC38hPD-Ll肿瘤细胞2XIO6用于形成肿瘤。接种12天后，当肿瘤尺寸达到约200-300mm3时开始治疗，给予3mpk剂量的23F11-H4L4参见表17。施用后的第2天、第7天和第14天收集肿瘤用于受体占据评估。收获肿瘤并将其切成小块，然后以lOml0.5g组织的浓度加入ACCUMAX™细胞分离液STEMCELL，目录号07921。之后将肿瘤团块悬液在室温下轻柔振摇1-2小时，并且在孵育过程中反复上下吹打以进一步使细胞分离。在孵育结束时，使细胞悬液通过40mi尼龙筛。然后，用冷PBS洗涤细胞3次并在1500rpm下离心5分钟。随后，用l-2mlPBS将收集得到的细胞重悬，计数细胞总数。此后，将50μ1细胞悬液约1000000个细胞加入96孔板的各孔中。用FACS缓冲液含I%BSA的I3BS洗涤细胞两次。然后用2ygml23F11-H4L4抗体或I3BS或同种型对照孵育细胞。将混合物在2-8°C下或在冰上避光孵育至少30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞3次，之后在1500rpm下离心5分钟。加入抗-人IgGFC-FITC二抗，并且在2-8°C下避光孵育30分钟，随后用FACS缓冲液洗涤细胞3次。最后，将细胞重悬于0.5mlFACS缓冲液中并使用流式细胞仪进行分析。使用流式细胞仪数据分析软件Cytoflex和GraphPadPrism计算与同种型匹配对照抗体染色细胞相比的I3D-Ll阳性细胞百分比和平均荧光强度MFI。将在体外用饱和量的同种型对照111861-附97厶0〇¥1181〇，八8160160以检测23卩11-!1礼4与？〇-1^1的体内结合或23?11-H4L4或BM-GT以检测可用的PD-Ll结合位点）预孵育细胞之中的相对平均荧光强度RMFI变化比，用于估算受体占据R0。将数值针对适当的同种型对照hIgGl-N297A归一化。数据渗见表18表明单次注射3mgkg的23F11-H4L4能够导致持续至少7天的肿瘤H-L1占据。另一方面，3mgkg的BM-GT显示出大于2天但小于7天的肿瘤F1D-Ll占据，尽管其初始占据率更高，这表明23F11-H4L4的pH依赖性PD-Ll结合的性质能够使抗体在肿瘤中停留更长时间并且与肿瘤细胞上的I3D-Ll结合。[0538]表17:研究设计[0539][0540]注释:给药体积:根据体重校正的给药体积。IV:静脉注射[0541]表18:受体占据结果[0542][0543]实施例29:肿瘤浸润结果[0544]当肿瘤达到200-300mm3时，正常同源C57BL6小鼠中具有MC38hPD-Ll肿瘤生长的3只小鼠接受单次静脉注射10mgkg23F11-H4L4的处理。施用抗体后的第7天收集肿瘤用于肿瘤浸润和肿瘤浸润淋巴细胞TIL分析。特别地，根据生产厂商的说明书使用OptimalCuttingTemperatureO.C.T.TissueTek制备肿瘤块。制备6μηι厚的组织切片，用甲醇固定组织切片，随后用I3BS洗涤，然后用0.2%TritonX-IOO透化5分钟。之后，用PBS洗涤切片并使用封闭缓冲液含3.0%BSA的IXPBS在室温下封闭30-60分钟，随后用PBS-T洗涤切片3次，每次5分钟。然后，将在PBS中稀释的AlexaFluor488山羊-抗人IgGH+L二抗Thermo,目录号A11013,用于检测23F11-H4L4、AlexaFluorK594抗-小鼠CD31抗体Biolegend，目录号102520,用于检测脉管系统）和AlexaFluors594抗-小鼠CD8a抗体Biolegend，目录号100758,用于检测⑶8T细胞施用于切片上，并使其在4°C下避光孵育过夜。弃去二抗并用PBS-T洗涤切片3次每次5分钟）后，用DAPI对盖有盖玻片的切片进行复染，并在4°C下避光保存。使用荧光显微镜NikonNi-U分析23F11-H4L4和TIL与对照冰冻组织切片相比的位置和分布。[0545]在以IOmpk给药后第7天的冰冻MC38hro-LlCDx肿瘤切片上23F11-H4L4浸润和TIL的代表性图像如图40中所示。[0546]虽然用参考特定实施方式其中的一些是优选实施方式特别示出和描述了本公开内容，但是本领域技术人员应当理解的是，在形式和细节上对本申请进行各种改变是没有脱离本申请公开的主旨和范围。

权利要求：1.一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体包含重链HCDRl、H⑶R2和HCDR3以及轻链LCDRl、LCDR2和LCDR3序列，其中所述HCDRl序列是TYWX1HSEQIDNO:1或与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述HCDR2序列是MIQPNSGGTKYNX2X3FKX4SEQIDN0:2或与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述HCDR3序列是GAGTVDYFDYSEQIDN0:3或与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述IXDRl序列是RASESVDIYGNSFMHSEQIDN0:4或与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述LCDR2序列是RASNLESSEQIDNO:5或与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述IXDR3序列是X5QSX6X7DPYTSEQIDN0:6或与其具有至少80%序列同一性的同源序列；其中Xi是I或M;X2是D或E;X3是Q或K;X4是N或K;X5是Q或H;X6是N或T;X7是D或E。2.如权利要求2所述的抗体，其中Xi是I;X2是D;X3是Q;X4是Ν;Χδ是Q;X6是Ν;Χγ是D。3.如权利要求2所述的抗体，其中Xi是M;X2是E;X3是K;X4是K;X5是Q;X6是T;X7是E。4.一种分离的I3D-Ll抗体，所述抗体包含1、2、3、4、5或6个⑶R，所述⑶R选自SEQIDNO:7-12或与其具有至少80%序列同一性的同源序列。5.如权利要求1-4中任意一项所述的抗体，所述抗体包含重链框架序列HFRl、HFR2、HFR3和HFR4以及轻链框架序列LFRl、LFR2、LFR3和LFR4，其中重链可变区的序列如下式所示:HFR1-HCDR1-HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4，并且轻链可变区的序列如下式所示：LFRl-LCDRl-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。6.如权利要求5所述的抗体，其中所述HFRl序列是XaiVQLXa2QXa3GAEXa4Xa5KPGASVKXa6SCKASGYXa7FTSEQIDN0:13;所述HFR2序列是WVXa8QXa9PGQGLEWIGSEQIDNO:14;所述HFR3序列是XaioXaiiTLTVDXai2SXai3Xai4TAXai5MXai6LSXai7LXai8SXai9DXa2〇AVXa33YCARSEQIDNO：15；所述HFR4序列是WGXa34GXa2ITXa35Xa22Xa23SSSEQIDNO:16;所述LFRl序列是Xa36lVXa37TXa24Xa38PXa25Xa39LXa26VSXa27GXa4〇RXa4iTIXa28CSEQIDNO:17；所述LFR2序列是WYQQKPGQXa29PKLUYSEQIDNO:18;所述LFR3序列是GXa42PXa43RFXa44GSGXa45Xa46RTDFTXa47TIXa48Xa49VXa5〇AXa3〇DXa3iAXa5iYXa52CSEQIDNO：19；所述LFR4序列是FGXa53GTKLEXa32KSEQIDNO:20;其中乂1是〇或L;Xa2是Q或V;Xa3是S或P;Xa4是L或V;乂5是¥或K;Xa6是L或V;Xa7是T、S或I;Xa8是W、K或R;Xa9是R或A;Xa1O是R、K或T;Xan是V或A;乂312是1或T;乂313是5或I;Xa14是S或T;父15是丫或5;父316是〇或E;Xa17是S、G或1?;父318是1'或R;Xa19是E或D;Xa2Q是S或1';父321是1'或S;Xa22是S或T;Xa23是V或I;Xa24是Q或H;Xa25是A、K或V;Xa26是A、S或T;Xa27是L、A或V;Xa28是S或T;Xa29是S、P或A;Xa3Q是D、E、N或或T;Xa32是L、T或I;Xa33是F或Y;Xa34是T或Q;Xa35是V或L;Xa36是D或S;Xa37是M或L;Xa38是T或S;Xa39是F或S;Xa4〇是D或Q;Xa4i是V或A;Xa42是V或I;Xa43是D或A;Xa44是T或S;Xa45是Y或S;Xa46是G或R;Xa47是F或L;Xa48是S或N;Xa49是T或P;Xaso是Q或E;Xasi是V或T;Xa52是F或Y;Xas3是A或G07·如权利要求6所述的抗体，其中Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是L;Xa7是I;Xas是K;Xa9是R;Xaio是R或K;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是T或S;Xa22是T或S;Xa23是I或V;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是A或P;Xa3〇是Q;Xa3i是T;Xa32是T或I;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xas2是Y;Xas3是G08·如权利要求6所述的抗体，其中Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是L;Xa7是I;Xas是K;Xa9是R;Xaio是R;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是T;Xa22是S;Xa23是I;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是A;Xa3〇是Q;Xa3i是T;Xa32是T;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xas2是Y;Xas3是G。9·如权利要求6所述的抗体，其中Xai是Q;Xa2是V;Xa3是S;Xa4是V;Xas是K;Xa6是L;Xa7是I;Xas是K;Xa9是R;Xaio是K;Xaii是A;Xai2是K;Xai3是I;Xai4是S;Xais是Y;Xai6是E;Xai7是R;Xais是T;Xai9是D;Xa2〇是T;Xa2i是S;Xa22是T;Xa23是V;Xa24是Q;Xa25是A;Xa26是A;Xa27是V;Xa28是T;Xa29是P;Xa3〇是Q;Xa3i是T;Xa32是I;Xa33是Y;Xa34是Q;Xa35是L;Xa36是D;Xa37是L;Xa38是S;Xa39是S;Xa4〇是Q;Xa4i是A;Xa42是I;Xa43是A;Xa44是S;Xa45是S;Xa46是R;Xa47是L;Xa48是N;Xa49是P;Xaso是E;Xasi是T;Xas2是Y;Xas3是G。10.如权利要求1-3和5-9中任意一项所述的抗体，所述抗体包含如SEQIDNO:61中所示的重链可变区和如SEQIDNO:62中所示的轻链可变区。11.如权利要求1-3和5-9中任意一项所述的抗体，所述抗体包含如SEQIDNO:63中所示的重链可变区和如SEQIDN0:64中所示的轻链可变区。12.如权利要求4-9中任意一项所述的抗体，所述抗体包含如SEQIDNO:21中所示的重链可变区或其人源化形式。13.如权利要求4-9和12中任意一项所述的抗体，所述抗体包含如SEQIDNO:22中所示的轻链可变区或其人源化形式。14.一种分离的FiD-Ll抗体，所述抗体通过实验测定在酸性pH下与FiD-Ll结合，以及通过所述实验测定在中性PH下与PD-Ll结合，其中所述在酸性pH下与PD-Ll结合显著低于所述在中性pH下与ro-Li结合。15.如权利要求14所述的抗体，其中所述在酸性pH下与PD-Ll结合不超过所述在中性pH下与ro-Ll结合的80%。16.如权利要求14或15所述的抗体，其中所述中性pH是7.4,以及所述酸性pH是6.0、5·5、5·0、4·5或4.0〇17.如权利要求14-16中任意一项所述的抗体，其中所述酸性pH是ρΗ6.0、ρΗ5.5或pH5.0，以及所述中性pH是ρΗ7.4。18.如权利要求14-17中任意一项所述的抗体，其中所述测定检测经由ELISA、FACS、表面等离子体共振、GSTpulldown、表位标签、免疫沉淀、Far-Western、焚光共振能量转移、时间分辨荧光免疫测定TR-FIA、放射免疫测定RIA、酶免疫测定、乳胶凝集、Western印迹、免疫组织化学或其任意组合，测定结合或阻断活性。19.一种分离的PD-Ll抗体，所述抗体与前述任意一项权利要求所述的抗体结合至相同表位或与前述任意一项权利要求所述的抗体竞争性结合。20.如权利要求19所述的抗体，其中所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个：E58、K62、N63、I64、S8^PY81。21.如权利要求19或20所述的抗体，其中所述表位还包含下述H-L1的氨基酸残基的至少一个:R113、M115、Y123、K124*R125。22.如权利要求19-21中任意一项所述的抗体，其中所述表位包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、R113、M115、Y123*K124;2E58、S80、R113*R125。23.如权利要求19-22中任意一项所述的抗体，其中所述表位还包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的至少一个:K62、N63、I64、Y80PD122。24.如权利要求19-23中任意一项所述的抗体，其中所述表位包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、N63、I64、S80、Y81、R113*R125;2E58、S80、R113、M115、D122、Y123、K124和R125;3E58、K62、N63、S80、Y81、R113*R125;4E58、N63、I64、S80、Y81、R113、K124和R125。25.—种治疗个体中与PD-L1相关的病况的方法，所述方法包括向所述个体施用如权利要求1-24中任意一项所述的ro-Li抗体，从而治疗所述病况。26.如权利要求25所述的方法，其中所述抗体以不超过参照剂量50%的剂量施用，其中将参照抗体达到相当的体内疗效时的剂量确定为参照剂量，其中所述参照抗体在酸性PH和中性pH下均显示出与PD-Ll相似的结合，并且其中所述参照抗体和所述抗体在中性pH下具有与H-L1相似的结合。27.如权利要求25或26所述的方法，其中所述抗体以低于参照给药频率的给药频率施用，其中将参照抗体达到相当的体内疗效时的给药频率确定为参照给药频率，其中所述参照抗体在酸性PH和中性pH下均显示出与PD-Ll相似的结合，并且其中所述参照抗体和所述抗体在中性pH下具有与I3D-Ll相似的结合。28.如权利要求25-27中任意一项所述的方法，其中所述抗体在靶器官中具有比参照体内半衰期更长的体内半衰期，其中所述参照体内半衰期通过参照抗体确定，其中所述参照抗体在酸性PH和中性pH下均显示出与PD-Ll相似的结合，并且其中所述参照抗体和所述抗体在中性pH下具有与H-L1相似的结合。29.如权利要求28所述的方法，其中所述靶器官包括血清、肾、肺、胰腺、肝、胆囊、膀胱、皮肤、食管、卵巢、乳房、结肠、直肠、胃、脾或脑中的一个或多个。30.—种分离的PD-Ll抗体，所述抗体包含重链HCDR1’、HCDR2’和HCDR3’以及轻链LCDR1’、LCDR2’和LCDR3’序列，其中所述HCDR1’序列选自下组:DYYMNSEQIDN0:23、SEQIDN0:29、35、41以及与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述HCDR2’序列选自下组：DINPNNGGTSYNX’iKFX’2GSEQIDN0:24、SEQIDN0:30、36、42以及与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述HCDR3’序列选自下组：VKW⑶GPFAYSEQIDN0:25、SEQIDN0:31、37、43以及与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述LCDRl’序列选自下组:X’3ASQNVGAAVASEQIDNO:26、SEQIDNO:32、38、44以及与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述LCDR2’序列选自下组：SASNX’4X’5TSEQIDNO:27、SEQIDNO:33、39、45以及与其具有至少80%序列同一性的同源序列；所述LCDR3’序列选自下组：QQYSNYPTSEQIDNO:28、SEQIDN0:34、40、46以及与其具有至少80%序列同一性的同源序列；其中X’1是H或Q;X’2是K或Q;X’3是K或Q;X’4是R或L;X’5是¥或E。31.如权利要求30所述的抗体，其中X’：是⑴乂’2是Q;X’3是Q;X’4是R;和X’5是Y。32.如权利要求30-31中任意一项所述的抗体，包含如SEQIDNO:65中所示的重链可变区和如SEQIDNO:66中所示的轻链可变区。33.如权利要求30所述的抗体，包含1所述重链HCDR1’是SEQIDN0:29、HCDR2’是SEQIDN0:30和HCDR3’是SEQIDN0:31；2所述重链HCDRl’是SEQIDNO:35、HCDR2’是SEQIDNO:36和HCDR3’是SEQIDNO:37;或者3所述重链HCDR1’是SEQIDNO:41、HCDR2’是SEQIDNO:42和HCDR3’是SEQIDNO:43〇34.如权利要求30或33所述的抗体，包含1所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:32、LCDR2’是SEQIDN0:33和LCDR3’是SEQIDN0:34;2所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:38、LCDR2’是SEQIDN0:39和LCDR3’是SEQIDN0:40;或者3所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:44、LCDR2’是SEQIDN0:45和LCDR3’是SEQIDN0:46〇35.如权利要求30和33-34中任意一项所述的抗体，其中1所述重链HCDR1’是SEQIDN0:29、HCDR2’是SEQIDN0:30和HCDR3’是SEQIDN0:31，所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:32、LCDR2’是SEQIDN0:33和LCDR3’是SEQIDN0:34;2所述重链HCDR1’是SEQIDN0:35、HCDR2’是SEQIDN0:36和HCDR3’是SEQIDN0:37,所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:38、LCDR2’是SEQIDN0:39和LCDR3’是SEQIDN0:40;或者3所述重链HCDR1’是SEQIDN0:41、HCDR2’是SEQIDN0:42和HCDR3’是SEQIDNO:43，所述轻链LCDR1’是SEQIDN0:44、LCDR2’是SEQIDN0:45和LCDR3’是SEQIDN0:46。36.如权利要求30和33-35中任意一项所述的抗体，包含选自下组的重链可变区：SEQIDNO:55、57和59。37.如权利要求30和33-36中任意一项所述的抗体，包含选自下组的轻链可变区：SEQIDNO:56、58和60。38.如权利要求30和33-37中任意一项所述的抗体，包含SEQIDNO:55所示的重链可变区或其人源化形式，以及SEQIDN0:56所示的轻链可变区或其人源化形式。39.如权利要求30和33-37中任意一项所述的抗体，包含SEQIDN0:57所示的重链可变区或其人源化形式，以及SEQIDNO:58所示的轻链可变区或其人源化形式。40.如权利要求30和33-37中任意一项所述的抗体，包含SEQIDNO:59所示的重链可变区或其人源化形式，以及SEQIDN0:60所示的轻链可变区或其人源化形式。41.一种分离的I3D-Ll抗体，所述抗体与如权利要求30-40中任意一项所述的抗体结合至相同表位或与如权利要求30-40中任意一项所述的抗体竞争性结合。42.如权利要求41所述的抗体，其中所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个:E58和S80。43.如权利要求41或42所述的抗体，其中所述表位还包含下述H-L1的氨基酸残基的至少一个:Y56、R113、D122、Y123*R125。44.如权利要求41-43中任意一项所述的抗体，其中所述表位包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、R113、D122、Y123*R125;2Y56、E58*R113;3E58、R113*R125。45.如权利要求41-44中任意一项所述的抗体，其中所述表位还包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的至少一个:S80和D122。46.如权利要求41-45中任意一项所述的抗体，其中所述表位包含下述I3D-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、S80、R113、D122、Y123*R125;2E58、S80、R113*R125。47.—种分离的PD-Ll抗体，所述抗体具有高于76摄氏度的热转变中点（Tm，所述热转变中点通过差示扫描量热法测定。48.如权利要求47所述的抗体，其中所述热转变中点高于90摄氏度。49.如权利要求1-24和30-48中任意一项所述的抗体，其中所述抗体是双特异性抗体、人源化抗体、嵌合抗体、单克隆抗体、重组抗体、标记的抗体、二价抗体或抗独特型抗体。50.如权利要求1-24和30-49中任意一项所述的抗体，其中所述抗体是选自下组的抗原结合片段:胳盤源化单结构域抗体、双功能抗体diabody、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、dsFv2、dsFv_dsFv’、Fv片段、Fab、Fab’、Fab’）2、ds双功能抗体、纳米抗体、结构域抗体、分离的CDR和二价结构域抗体。51.—种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-24和30-50中任意一项所述的抗体。52.—种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1-24和30-50中任意一项所述的抗体。53.—种载体，所述载体包含如权利要求52所述的多核苷酸。54.—种分离的宿主细胞，所述宿主细胞包含如权利要求53所述的载体。55.如权利要求54所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞产生由所述多核苷酸编码的所述抗体。56.—种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1-24和30-50中任意一项所述的抗体或如权利要求51所述的药物组合物。57.—种生产PD-Ll抗体的方法，所述方法包括在表达所述多核苷酸的条件下培养如权利要求54或权利要求55所述的宿主细胞。58.—种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1-24和30-50中任意一项所述的PD-Ll抗体和第二治疗剂。59.如权利要求58所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂是在放疗、化疗、靶向疗法、基因疗法、免疫疗法、激素疗法、血管生成抑制、姑息治疗、外科手术或其组合中使用的药剂。60.如权利要求59所述的药物组合物，其中所述第二治疗剂是VEGFR2抗体。61.—种治疗个体中与PD-Ll相关的病况的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如权利要求30-50中任意一项所述的抗体。62.—种治疗个体中与PD-L1相关的病况的方法，所述方法包括向所述个体施用治疗有效量的如权利要求59-61中任意一项所述的药物组合物。63.—种分离的非人肿瘤细胞，所述肿瘤细胞包含编码人ro-Li蛋白的多核苷酸。64.—种生产非人肿瘤细胞的方法，所述肿瘤细胞包含编码人PD-Ll蛋白的多核苷酸，所述方法包括引入编码所述人I3D-Ll的多核苷酸。65.如权利要求64所述的方法，所述方法还包括使内源性非人H-L1基因失活。66.—种筛选或评估针对人PD-Ll的抗体的体内效力的方法，所述方法包括将包含编码人I3D-Ll蛋白的多核苷酸的非人肿瘤细胞接种进非人动物，将所述抗体与所述非人动物中的所述非人肿瘤细胞接触，并且确定所述非人肿瘤细胞的肿瘤负荷。67.—种分离的PD-Ll抗体，其中所述抗体与表位结合或竞争性地与所述表位结合，所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的组合的一种：IE58和S80;2E58和Rl13;3E58和D122;4E58和R125。68.如权利要求67所述的抗体，其中所述表位还包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个:Y56和Y123。69.如权利要求67或68所述的抗体，其中所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、R113、M115、Y123*K124;2E58、S80、R113*R125;3E58、R113、D122、Y123*R125;4Y56、E58*R113;5E58、R113*R125。70.如权利要求67-69中任意一项所述的抗体，其中所述表位还包含下述PD-Ll的氨基酸残基的至少一个:K62、N63、I64和Y81。71.如权利要求67-70中任意一项所述的抗体，其中所述表位包含下述PD-Ll的氨基酸残基的组合的一种：1E58、N63、I64、S80、Y81、R113*R125;2E58、S80、R113、M115、D122、Y123、K124和R125;3E58、K62、N63、S80、Y81、R113*R125;4E58、N63、I64、S80、Y81、R113、K124和R125;5E58、S80、R113、D122、Y123*R125。72.—种分离的H-L1抗体，其中所述抗体与由PD-Ll的氨基酸残基S80组成的表位结合或竞争性地与所述表位结合。73.—种分离的H-L1抗体，所述抗体具有至少7天的持续的H-L1受体占据期。74.—种分离的PD-Ll抗体，所述抗体以约0.03ygml的EC5q值与活化的人T细胞结合，所述EC5q值通过ELISA测定。

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