申请/专利权人：浙江大学

申请日：2017-07-13

公开（公告）日：2020-10-23

公开（公告）号：CN107267395B

主分类号：C12N1/12(20060101)

分类号：C12N1/12(20060101);C12P3/00(20060101);C12R1/89(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.23#授权;2017.11.17#实质审查的生效;2017.10.20#公开

摘要：本发明公开了一种微藻培养基及培养微藻生产氢气的方法。所述微藻培养基包括基础培养基和添加剂，所述添加剂为DMSO，DMSO的添加量按体积比为0.1％～2％。所述方法包括以下步骤：1构建微藻的聚集体；2将微藻的聚集体重悬于所述的微藻培养基中，在光照条件下培养，生产氢气。本发明微藻培养基通过在普通培养基中添加一定量的DMSO，在使用该微藻培养基培养微藻生产氢气时，细胞呼吸作用增强，使得聚集体内部更多层的细胞处于无氧环境并参与产氢，所以氢酶活性提高，产氢量和产氢速率也得到了有效提高。

主权项：1.一种培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）构建微藻的聚集体；（2）将微藻的聚集体重悬于微藻培养基中，在光照条件下培养，生产氢气，所述微藻为蛋白核小球藻（Chlorellapyrenoidesa），所述微藻培养基由基础培养基和添加剂组成，所述添加剂为DMSO，DMSO的添加量按体积比为0.1%~2%。

全文数据：_种微藻培养基及培养微藻生产氢气^的方法技术领域[0001]本发明涉及生物工程与技术领域，特别是涉及一种微藻培养基及培养微藻生产氢气的方法。背景技术[0002]氢气因其无污染、可再生和高能量转化效率，被认为是一种理想的化石能源替代物。目前，最主要的氢气制备方法是石油裂解、光催化分解或电解水和生物制氢。其中生物制氢，尤其是光合产氢，是环境友好的，其主要能量来源为太阳能，而其他的产氢方法会消耗巨大的能量。在自然界中，光合微藻可以通过光合系统二将水光解产生氧气和光合电子，然后电子被传递给氢酶催化产生氢气。特别是已经商业化的绿藻，其铁铁氢酶有相对高的太阳能转化效率（12%-14%，但是氢酶在有氧环境中会受到明显抑制（E.Eroglu，A.MelisBioresourceTechnology10220118403-8413。[0003]所以目前对于藻类产氢研究的主要方向为如何除氧或在有氧条件下保持氢酶活性。通惰性气体除氧成本太高，因此科学家们想通过筛选突变株和基因改造的方法提高氢酶的耐受性，然而方法较复杂，进展缓慢。[0004]Melis等人发现了缺硫培养的方法，在缺硫条件下氢化酶快速表达，可以产生3-5天的氢。但是这种方法会抑制光合系统二的活性，逐渐终止氢气的生产（TKAntal，etal.Thedependenceofalgal!^productiononPhotosystemIIand〇2consumptionactivitiesinsulfur-deprivedChlamydomonasreinhardtiicells,[J].Biochim.Biophys.Acta,2003,1607:153-160.〇[0005]本发明人所在课题组曾通过生物矿化的方法构建了小球藻聚集体，形成了空间上功能分化的单位，首次实现了在自然有氧条件下的可持续光合产氢，但是这种方法也存在着产氢量和产氢速率较低的问题。（W·Xiong，X·Zhao，G·Zhu，C·Shao，Y·Li，W·Ma，X·Xu，R.Tang1AngewandteChemie2015,127,12129-12133.发明内容[0006]本发明针对现有技术中通过构建小球藻聚集体以持续产氢的方法存在的产氢量和产氢速率较低的问题，提供了一种提高产氢量及产氢速率的微藻培养基以及利用该微藻培养基培养微藻生产氢气的方法。[0007]一种微藻培养基，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂为DMSO，DMSO的添加量按体积比为0.1%〜2%。[0008]微藻细胞形成一定尺寸的聚集体后，由于微环境的改变，在空间上将出现功能的分化。在聚集体外层的细胞，依然可以进行光合作用放出氧气，而在聚集体内层的细胞，由于外层细胞阻挡了部分光照，使得内层细胞光合作用减弱，越在内层光合作用越弱，但是细胞的呼吸作用却不会因为光照的改变而有太多变化，因而当聚集体的尺寸达到一定大小时，在聚集体的内层细胞会达到呼吸耗氧和光合放氧的动态平衡，这时便可维持聚集体内层的厌氧环境，在厌氧环境中氢酶可以表达，并能保持活性，在有光合电子同时存在的条件下，即可催化2H++2eT4H2反应的进行生成氢气。[0009]通过低浓度DMSO的加入，细胞呼吸作用增强，使得聚集体内部更多层细胞处于无氧环境并参与了产氢，所以氢酶活性提高，产氢量和产氢速率也得到了提高。经实验发现，当DMSO浓度在一定的范围内时，微藻聚集体产氢量先随DMSO浓度增加而增加，达到一个高点后，产氢量又随DMSO浓度增加而逐渐降低，甚至，当DMSO浓度过高时，产氢量却相较没有添加DMSO的情况下还要低，推测的原因是由于过量的DMSO对小球藻细胞产生了毒性。[0010]优选的，DMSO的添加量按体积比为0.3%〜1%。[0011]更优选的，DMSO的添加量按体积比为0.5%。[0012]优选的，所述基础培养基为TAP培养基。一般常用的用于培养微藻的培养基还有SE培养基、BGll培养基等。[0013]本发明又提供了所述的微藻培养基在培养微藻生产氢气中的应用。[0014]本发明还提供了一种培养微藻生产氢气的方法，包括以下步骤：[0015]1构建微藻的聚集体；[0016]2将微藻的聚集体重悬于所述的微藻培养基中，在光照条件下培养，生产氢气。[0017]优选的，所述微藻为绿藻。在自然界中，光合微生物，尤其是绿藻可以利用光合系统和氢酶将水光解为氢气和氧气。目前研究较多的单细胞绿藻主要有纤维藻Ankistrodesmussp·、莱茵衣藻（Chlamydomonassp·、小球藻（Chlorellasp·、概藻Scenedesmussp·和月牙藻（Selenastrumdibraianum等。[0018]更优选的，所述微藻为蛋白核小球藻Chlorellapyrenoidesa。蛋白核小球藻属于绿藻门小球藻属。在自然条件下，小球藻是单细胞分散的，直径大约在3〜4微米。目前蛋白核小球藻已经商业化，在实际应用中更容易获得。[0019]优选的，微藻的聚集体的直径为50〜150μηι。[0020]优选的，所述光照条件为100〜SOOyEnf2iT1光照强度。[0021]优选的，构建微藻的聚集体的方法包括以下步骤：[0022]1将微藻细胞培养至对数生长期，且细胞密度不小于IXIO8ceIlsAiL;[0023]2将带氨基的阳离子聚电解质以0.5〜2gL的量加入微藻细胞溶液中进行表面改性；[0024]3收集微藻细胞，与2〜IOmM娃酸溶液混合，搅拌至微藻的聚集体形成。[0025]由于微藻个体微小，且细胞表面多带负电荷，因而其个体在培养液中可以均匀地分散悬浮，形成稳定的分散体系。通过向微藻溶液中加入带有氨基阳离子聚电解质，使微藻细胞表面带有电荷和诱导硅酸矿化的活性位点。硅酸溶液在氨基的催化作用下会发生聚合反应生产二氧化硅，聚硅酸是用中和法即由硅酸钠在加酸条件下水解、聚合反应到一定程度的中间产物。聚硅酸带负电荷，属阴离子型无机高分子物质，通过吸附架桥使微藻聚集。[0026]更优选的，带氨基的阳离子聚电解质为聚二甲基二烯丙基氯化铵，且以lgL的量加入微藻细胞溶液中。此浓度既能保证有足够多的阳离子聚电解质吸附到微藻细胞表面，又不会因浓度太高对微藻细胞产生生物毒性。[0027]更优选的，步骤⑶中搅拌时间为0.5〜Ih。[0028]本发明微藻培养基通过在普通培养基中添加一定量的DMS0,在使用该微藻培养基培养微藻生产氢气时，细胞呼吸作用增强，使得聚集体内部更多层的细胞处于无氧环境并参与产氢，所以氢酶活性提高，产氢量和产氢速率也得到了有效提高。附图说明[0029]图1为实施例1中小球藻聚集体的尺寸，其中A为对照组光学显微镜图，B为实验组光学显微镜图，C为粒径分析图。[0030]图2为实施例1中小球藻聚集体产氢量随时间变化曲线图。[0031]图3为实施例1中小球藻聚集体最大呼吸耗氧速率比较图。[0032]图4为实施例2中不同浓度DMSO条件下小球藻聚集体最大产氢量结果比较图。具体实施方式[0033]TAP培养基：配方参见文献Gorman，D·S·，andR·P·Levine1965Proc·Natl·Acad·Sci·USA54，1665-1669，具体成分如下：[0034]母液ITAP盐）：NH4Cl15.0gMuSal-TH^O4.0[0035]CaCI2GH2O2,0g加H2O至IL[0036]母液2磷酸缓冲液）：[0037]K2HPO428.8g[0038]KH2PO414.4g[0039]加H2O至IOOmL[0040]母液3微量元素）：[0041]EDTA二钠50gZnS0.4-7H2〇22gHiBOi11_4gMnCl2-4H2〇5.06gΓο01-·6Η-01.61g[0042]CuS〇4-5H;iO1.57gNH4ilMcO24--IHrOI.IOgFcS0_i-7H，04.99g加H2O至IL[0043]TAP培养基使用时：2.42gTris，25mL母液I，0.375mL母液2，ImL母液31mL乙酸glacialaceticacid，加H2O至IL0[0044]实施例1[0045]将小球藻细胞培养至对数期细胞密度IXIO8ceIlsAiL，加入lgL阳离子聚电解质聚二甲基二烯丙基氯化铵PDADMAC对藻细胞进行表面改性，使表面原为负电的藻细胞带正电。再将离心清洗收集后的藻液均匀混合于5mM的硅酸钠溶液，搅拌30min使微藻聚集体形成。然后清洗并用TAP培养基重悬，分装到体积为60mL密封管中，每管30mL藻液，以上作为对照组。再向以上30mL藻液中加入DMSO,使其终浓度为0.5%体积比），作为实验组。两组分别在1ΟΟμΕHf2iT1光照下照射48小时。[0046]1将聚集的小球藻和加入DMSO后的小球藻聚集体置于光学显微镜下观察，并用粒度分析仪进行粒度统计分析。结果如图1所示，实验组和对照组小球藻的聚集体的直径均约IOOym0[0047]2分别于不同时间测定密封管顶空氢气的积累量。结果如图2所示，实验组和对照组小球藻的聚集体在光照的36h内，密封管中氢气含量都随时间呈线性增长，说明聚集的小球藻在持续产氢，且加入〇.5%DMS0的实验组产氢量在每一时间点都为对照组的1.5倍左右。[0048]3分别测定实验组与对照组的呼吸耗氧速率。结果如图3所示，加入0.5%DMS0的实验组的最大呼吸耗氧速率为对照组的2倍左右，说明加入DMSO对小球藻聚集体呼吸有促进作用，使聚集体中参与产氢的细胞变多，提高了产氢速率，进而产氢提高。[0049]实施例2[0050]将小球藻细胞培养至对数期（细胞密度1\108^11811^，加入41^阳离子ToADMAC对藻细胞进行表面改性，使表面原为负电的藻细胞带正电。再将离心清洗收集后的藻液均勾混合于5mM的娃酸钠溶液，搅拌30min使微藻聚集体形成。然后清洗并用TAP培养基重悬，分装到体积为60mL密封管中，每管30mL藻液，以上作为对照组。再向以上30mL藻液中加入DMSO，使其终浓度分别为0.1%、0.3%、0.5%、1%、2%、3%、5%体积比），作为实验组。分别在1〇〇μΕHf2iT1光照下照射48小时，测定密封管顶空氢气积累量。每个浓度重复5遍。[0051]结果如图4及表1所示，加入浓度为0.1%、0.3%、0.5%、1%和2%的DMSO后，小球藻最大产氢量均有所提高，且加入浓度为〇.5%的DMSO时产氢量提高最大，提高50%以上；但是过量加入DMSO反而对提高产氢量没有任何帮助，反而会降低产量（加入3%、5%DMSO组），可能是由于过量的DMSO对小球藻细胞产生了毒性。[0052]表1[0053]

权利要求：1.一种微藻培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加剂，所述添加剂为DMSO，DMSO的添加量按体积比为〇.1%〜2%。2.如权利要求1所述的微藻培养基，其特征在于，DMSO的添加量按体积比为0.3%〜1%〇3.如权利要求2所述的微藻培养基，其特征在于，DMSO的添加量按体积比为0.5%。4.如权利要求1所述的微藻培养基，其特征在于，所述基础培养基为TAP培养基。5.如权利要求1〜4任一所述的微藻培养基在培养微藻生产氢气中的应用。6.—种培养微藻生产氢气的方法，其特征在于，包括以下步骤：1构建微藻的聚集体；2将微藻的聚集体重悬于如权利要求1〜4任一所述的微藻培养基中，在光照条件下培养,生产氢气。7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述微藻为绿藻。8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微藻为蛋白核小球藻。9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，构建微藻的聚集体的方法包括以下步骤：⑴将微藻细胞培养至对数生长期，且细胞密度不小于IX108cellSmL;⑵将带氨基的阳离子聚电解质以0.5〜2gL的量加入微藻细胞溶液中进行表面改性；⑶收集微藻细胞，与2〜IOmM娃酸溶液混合，搅拌至微藻的聚集体形成。10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，带氨基的阳离子聚电解质为聚二甲基二烯丙基氯化铵，且以lgL的量加入微藻细胞溶液中。

百度查询： 浙江大学 一种微藻培养基及培养微藻生产氢气的方法

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