申请/专利权人：江南大学;厦门欧米克生物科技有限公司

申请日：2017-09-22

公开（公告）日：2020-10-23

公开（公告）号：CN107699587B

主分类号：C12N15/70(20060101)

分类号：C12N15/70(20060101);C12N15/66(20060101);C12N15/53(20060101);C12N1/21(20060101);C12P17/04(20060101);C12R1/19(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.23#授权;2018.03.16#实质审查的生效;2018.02.16#公开

摘要：本发明涉及一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法，属于生物工程技术领域。本发明主要是在大肠杆菌中导入源于假单胞菌中的一种氧化酶基因。该重组菌能催化丙烯基苯类化合物合成胡椒醛，所生成的胡椒醛浓度可达到9.15gL。这种重组氧化酶合成胡椒醛的方法具有生产周期短，提取简单的特点，工业生产前景良好。

主权项：1.一种用重组大肠杆菌生物合成胡椒醛的方法，包括如下步骤：1）根据TAO氧化酶的基因序列以及pET-22b+质粒信息设计引物，以来自于假单胞菌Pseudomonas全基因组为模板扩增目标基因；设计的引物分别为：上游引物taoF：5’-CGCGAATTCGATGGAGGACATCATGCAAGGC-3’；下游引物taoD：5’-GCGGCGGCCGCTCAGTTAGTCCTCAAGTCGGAATTG-3’经PCR扩增获得SEQIDNO:1所示的TAO氧化酶基因；2）将步骤1）中的PCR扩增产物以及pET-22b+质粒采用快切酶EcoRⅠ、NotⅠ同时进行双酶切，并纯化回收；将酶切的PCR产物和pET-22b+使用T4连接酶15-20℃过夜连接，获得重组质粒pET-22b+-tao；3）将步骤2）中的重组质粒转入到E.coliBL21DE3，获得重组菌E.coliBL21DE3tao：将重组质粒加入至E.coliBL21DE3感受态中，冰下放置10-40min，并将其在40-45℃水浴中热击60-120s，冰中冷却1-5min，加入0.5-2mL的LB培养基，于30-40℃培养0.5-3h后涂布获得重组菌株E.coliBL21DE3tao；4）重组菌株合成胡椒醛：将步骤3）中的重组菌株E.coliBL21DE3tao培养生长到OD600为0.6~3时，以0.05~1.0mmolLIPTG在15~35℃下诱导培养2~10h，收集菌体；将重组菌悬于pH为7~9的缓冲液中，添加10~20gL黄樟油素，在温度30~35℃，转速80-220rpm下反应5~7h。

全文数据：

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