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【发明授权】木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法_武汉轻工大学_201710934710.5 

申请/专利权人:武汉轻工大学

申请日:2017-09-30

公开(公告)日:2020-10-23

公开(公告)号:CN107699584B

主分类号:C12N15/56(20060101)

分类号:C12N15/56(20060101);C12N9/24(20060101);C12N15/81(20060101);C12N15/66(20060101);C12N1/19(20060101);A23K20/189(20160101);A23K10/14(20160101);C12R1/84(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.10.23#授权;2018.03.16#实质审查的生效;2018.02.16#公开

摘要:本发明公开一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法,其中,所述木聚糖酶基因Xynsyn2用于编码木聚糖酶,所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2,采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子,降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性,消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点,从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量,提高了木聚糖酶的酶活力。

主权项:1.一种木聚糖酶基因Xynsyn2,用于编码木聚糖酶,其特征在于,所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示,所述木聚糖酶基因Xynsyn2编码出的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

全文数据:木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法技术领域[0001]本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法。背景技术[0002]现有的饲料一般以玉米、小麦、麸皮或稻谷等作为主要原料,其中含有较多的非淀粉性多糖包括阿拉伯木聚糖、葡聚糖、果胶以及纤维素等),但是由于非反刍类动物体内缺少降解纤维素的酶,使其无法消化半纤维素而容易形成糜状积食,影响动物肠道微生物的种群类型,从而影响对饲料的吸收。在饲料中添加合适的木聚糖酶可以破碎植物细胞壁并水解半纤维素,从而达到降低食糜粘度的目的,提高饲料的利用率。[0003]在工业生产中制备饲料的过程中,其工艺温度较高,因此需要木聚糖酶在高温条件下仍具有活性。但是现有的木聚糖酶的制备方法,一种是通过PCR技术从相关产木聚糖酶的微生物中扩增出木聚糖基因,连接到表达载体中,再导入相关表达宿主来表达木聚糖酶,制备出来的木聚糖酶的最适温度比较低、最适pH偏中性且蛋白的表达量小,工业应用限制较大;另一种是从自然界产木聚糖酶的微生物中筛选菌株,然后对菌株进行改良或者对发酵工艺尽心优化,制备出来的木聚糖酶的酶活和表达量均不高、且最适温度较低,在工业生产中容易失活。[0004]毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统,具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟、表达水平高以及目的蛋白分离纯化简便等优点,是异源蛋白中工业化生产的理想宿主。然而,由于受到毕赤酵母对异源基因密码子使用^好性、mRNA二级结构的复杂性、基因中富含AT或GC区段、蛋白酶切割位点以及基因在宿主中的丰度等因素影响,异源基因在毕赤酵母中难以获得高效表达。发明内容[0005]本发明的主要目的是提出一种木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法,旨在提尚木聚糖酶基因在木聚糖酶中的表达量。[0006]为实现上述目的,本发明提出一种木聚糖酶基因Xynsyn2,用于编码木聚糖酶°,所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。°’[0007]本发明还提出一种木聚糖酶,所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDN〇.2所示。[0008]本发明还提出一种重组表达载体,包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2[0009]优选地,所述木聚糖酶基因XynSyn2的拷贝数为多个。°[0010]本发明还提出一种重组表达菌株,包括如上述的木聚糖酶基因Xyn[0011]优选地,所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。°[0012]本发明还提出一种如上述的重组表达载体的制备方法,包括如下步骤.[0013]将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间pUC57获得pUC-Xynsyn2载体;[0014]将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;[0015]将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得PA0815-Xynsyn2重组表达载体。[0016]本发明还提出一种如上述的重组表达菌株的制备方法,包括如下步骤:[0017]将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体PUC57,获得pUC-Xynsyn2载体;[0018]将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;[0019]将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得PA0815-Xynsyn2重组表达载体;[0020]将pA〇815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株。[0021]本发明还提出一种木聚糖酶的制备方法,包括如下步骤:[0022]将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体puC57,获得pUC-Xynsyn2载体;[0023]将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;[0024]将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得PA0815-Xynsyn2重组表达载体;[0025]将pA0815_Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株;[0026]培养重组表达菌株,从培养物中获得木聚糖酶。[0027]本发明还提出一种制备饲料的方法,包括步骤:在糖化过程的蛋白质休止期或发酵过程中添加如权利要求2所述的木聚糖酶。[0028]本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2,采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子,降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性,消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点,从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量。附图说明[0029]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他相关的附图。[0030]图1为本发明实施例1中pA0815表达载体和pA0815_Xynsyn2重组表达载体的图谱;[0031]图2为本发明实施例1中木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝的pA0815_Xynsyn2重组表达载体的双酶切检验结果图;[0032]图3为本发明实施例2中木聚糖基因Xynsyn2两拷贝的pA0815-Xynsyn2重组表达载体的图谱;[0033]图4为本发明实施例2中木聚糖酶基因Xynsynkyn单拷贝和两拷贝的重组表达菌株发酵上清液的SDS-PAGE测试结果;[0034]图5为本发明实施例3中发酵上清液的酶活随时间的变化曲线;[0035]图6为本发明实施例3中发酵上清液的SDS-PAGE测试结果;[0036]图7为本发明实施例4中木聚糖酶水解木聚糖的薄层层析测试结果。具体实施方式[0037]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。[0038]本发明提出一种木聚糖酶基因Xynsyn2,用于编码木聚糖酶,所述木聚糖酶基因Xynsyn2的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。[0039]本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2,采用了毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子,降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性,消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点,从而显著提高了人工合成的木聚糖酶基因Xynsyn2在毕赤酵母细胞中的表达量。[0040]本发明还提出一种木聚糖酶,所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。[0041]本发明中根据已有的木聚糖酶基因(来源于海栖热胞菌Thermotogamaritima序列进行人工设计,设计出一条全新的木聚糖酶基因序列,并通过人工合成的方法获得所述木聚糖酶基因片段,其碱基序列如SEQIDN0:1所不,命名为Xynsyn2,所述木聚糖酶基因Xynsyn2编码出的木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。根据毕赤酵母对基因的偏好性,对木聚糖酶基因序列进行了人工优化,采用毕赤酵母中的高频密码子替换原有的低频密码子,降低了mRNA的自由能及其mRNA二级结构的复杂性,并消除了基因中富含AT或GC的区域以及木聚糖酶中的蛋白酶作用位点,使通过人工合成获得的木聚糖酶基因XynSyn2,有效地提高了木聚糖酶基因XynSyn2中含量较高氨基酸密码子的使用频率,同时还有利于木聚糖酶表达量的提高,实现了高效的异源表达。[0042]本发明还提出一种重组表达载体,包括如上述的木聚糖酶基因xynsyn2。[0043]通过人工合成的方法获得木聚糖酶基因Xynsyn2后,需要通过载体将目的基因导入宿主细胞,使目的基因随着宿主细胞的繁殖而复制,从而获得大量的目的基因。[0044]重组表达载体Expressionvectors就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件如启动子、RBS、终止子等),使目的基因能够表达的载体,其中,所述启动子的类型可以是强表达型启动子、组织特异性启动或诱导型启动子,在实际中,可根据实际情况选择相应的启动子来进行驱动表达。在本发明中,所述重组表达载体的启动子为甲醇诱导型启动子,且启动子位于所述木聚糖酶基因的上游,用以驱动所述木聚糖酶基因表达。在甲醇诱导型启动子的诱导下,所述甲醇诱导型启动子驱动上述木聚糖酶基因转录表达出所述木聚糖酶,具体地,在本发明的一些实施例中,所述甲醇诱导型启动子(A0X的序列为:GACTGGTTCCAATTGACAAGC0[0045]可选地,所述木聚糖酶基因XynSyn2的拷贝数为多个。[0046]通过增加基因的拷贝数,可增加上述木聚糖酶基因Xynsyn2的表达量,进一步提高木聚糖酶的表达量。当然,载体上的每个木聚糖酶基因Xynsyn2均具有独立的启动子驱动表达。更优选地,在本发明的一些实施例中,所述木聚糖酶基因的拷贝数为两个或三个。[0047]本发明还提出一种重组表达菌株,包括如上述的木聚糖酶基因Xynsyn2。[0048]将上述的重组表达载体导入宿主细胞中获得重组表达菌株,目的基因即可随着宿主细胞的繁殖而复制。通常来说,所述宿主细胞可以是大肠杆菌,也可以是酵母等细胞,或者是其他类型的细胞例如动物细胞等。[0049]优选地,所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。[0050]毕赤酵母真核表达系统是目前广泛使用的真核生物表达系统,具有生物安全性好、遗传元件稳定、高密度发酵工艺成熟、表达水平高以及目的蛋白分离纯化简便等优点,是异源蛋白中工业化生产的理想宿主。同时,本发明提供的木聚糖酶基因Xynsyn2经过密码子优化,采用了适用于毕赤酵母进行转录翻译表达出木聚糖酶的高频密码子,因此,以毕赤酵母作为宿主细胞,提高了木聚糖酶基因XynSyn2在毕赤酵母细胞中的表达量。[0051]本发明还提出一种如上述的重组表达载体的制备方法,包括如下步骤:[0052]步骤S11、将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体pUC57,获得pUC-Xynsyn2载体;[0053]先在合成的木聚糖酶基因Xynsyn2两端加上酶切位点EcoRI,经EcoRI酶切后,连接至同样经EcoRI酶切后的中间载体pUC57上,即可获得pUC-Xynsyn2载体。[0054]步骤S12、将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;[0055]可选地,步骤S10和步骤S20中的酶切体系均为:30uL的载体、2uL的EcoRI、10uL的10XBuffer、ddH20补齐至200yL,37°C条件下、酶切2h左右。[0056]步骤Sl3、将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得pA0815-Xynsyn2重组表达载体;[0057]可选地,连接体系为:1此的T4buffer、luL的T4DNA连接酶、5•5此的Xynsyn2基因片段、2.5UL的pA0815片段、ddH20补齐至10uL;在16°C条件下连接8-10h后,转入大肠杆菌中,筛选阳性克隆,提取质粒,即得到具有单拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2的重组质粒PA0815-Xynsyn2重组表达载体,其结构如图1所示,Xynsyn2基因由A0X1甲醇诱导型启动子驱动,由A0X1TT终止子终止表达。[0058]本发明还提出一种如上述的重组表达菌株的制备方法,包括如下步骤:[0059]步骤S21、将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体pUC57,获得pUC-Xynsyn2载体;[0060]先在合成的木聚糖酶基因Xynsyn2两端加上酶切位点EcoRI,经EcoRI酶切后,连接至同样经EcoRI酶切后的中间载体pUC57上,即可获得pUC-Xynsyn2载体。[0061]步骤S22、将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;[0062]可选地,步骤S21和步骤S22中的酶切体系均为:30uL的载体、2此的EcoR1、10此的10乂81^『61'、1仙2〇补齐至200此,37°3条件下、酶切211左右。[0063]步骤S23、将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得pA0815-Xynsyn2重组表达载体;[0064]可选地,连接体系为:luL的T4buffer、luL的T4DNA连接酶、5.5uL的Xynsyn2基因片段、2.5UL的pA0815片段、ddH20补齐至10UL;在16°C条件下连接8-10h后,转入大肠杆菌中,筛选阳性克隆,提取质粒,即得到具有单拷贝木聚糖酶基因XynSyn2的重组质粒PA0815-Xynsyn2重组表达载体,其结构如图1所示,Xynsyn2基因由A0X1甲醇诱导型启动子驱动,由A0X1TT终止子终止表达。[0065]步骤S24、将pA0815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株。[0066]可选地,通过电转仪将pA0815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中,所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115,当然,在本发明其他实施例中,也可选用其他毕赤酵母菌株。[0067]本发明还提出一种木聚糖酶的制备方法,包括如下步骤:[0068]步骤S31、将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体PUC57,获得pUC-Xynsyn2载体;[0069]先在合成的木聚糖酶基因Xynsyn2两端加上酶切位点EcoRI,经EcoRI酶切后,连接至同样经EcoRI酶切后的中间载体pUC57上,即可获得pUC-Xynsyn2载体。[0070]步骤S32、将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;[0071]可选地,步骤S31和步骤S32中的酶切体系均为:30uL的载体、2uL的EcoRI、10uL的10XBuffer、ddH20补齐至200uL,37°C条件下、酶切2h左右。[0072]步骤S33、将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得pA0815_Xynsyn2重组表达载体;[0073]可选地,连接体系为:luL的T4buffer、luL的T4DNA连接酶、5.5UL的Xynsyn2基因片段、2.5此的pA0815片段、ddH20补齐至10uL;在16°C条件下连接8-10h后,转入大肠杆菌中,筛选阳性克隆,提取质粒,即得到具有单拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2的重组质粒PAO8I5-Xynsyn2重组表达载体,其结构如图1所示,Xynsyn2基因由A0X1甲醇诱导型启动子驱动,由A0X1TT终止子终止表达。[0074]步骤S34、将pA0815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株;[0075]可选地,通过电转仪将pA0815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株。在本发明的一些实施例中,所述毕赤酵母为巴斯德毕赤酵母GS115,当然,在本发明其他实施例中,也可选用其他毕赤酵母菌株。[0076]步骤S35、培养重组表达菌株,从培养物中获得木聚糖酶。[0077]通过发酵培养重组表达菌株,从发酵上清液中提纯获得木聚糖酶。当然,在本发明其他实施例中,也可以不经过提纯处理,直接将发酵上清液视为木聚糖酶产物。具体地,本发明提供的木聚糖酶基因XynSyn2表达出的木聚糖酶的最适pH值为5.8〜6_2优选为6_0、最适温度为60〜70°C优选为6TC,在此环境条件下,所述木聚糖酶具有正常的生物活性,能够高效地促进木聚糖水解。[0078]本发明还提出一种制备饲料的方法,包括步骤:在糖化过程的蛋白质休止期或发酵过程中添加如权利要求2所述的木聚糖酶。[0079]木聚糖酶基因Xynsyn2编码木聚糖酶,通过人工合成木聚糖酶基因Xynsyn2,然后将木聚糖酶基因Xynsyn2导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株,再对重组表达菌株进行发酵培养,即可制得木聚糖酶,将制备的木聚糖酶应用到饲料的制备中,可以将饲料的非淀粉多糖分解成较小聚合度的低聚木糖,从而改善饲料性能,消除或降低非淀粉多糖在动物肠胃中因粘度较大而引起的抗营养作用,同时它可以破坏植物细胞壁的结构,提高内源性消化酶的活性,提高饲料养分的利用。[0080]以下结合具体实施例和附图对本发明的技术方案作进一步详细说明,应当理解,以下实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。[0081]实施例1[0082]木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝重组表达菌株的构建[0083]1在DNA2.0软件的辅助下设计木聚糖酶基因Xynsyn2序列,通过人工合成的方法获得木聚糖酶基因Xynsyn2片段。[0084]2在合成的Xynsyn2基因两端加上酶切位点EcoRI,经EcoRI酶切后,连接至经EcoRI酶切后的中间载体PUC57载体苏州金唯智生物科技有限公司)上,得到puc-Xynsyn2载体;其中,酶切体系为:30uL的载体、2uL的EcoRI、10uL的10XBuffer、ddH20补齐至200uL,37°C条件下、酶切2h。[0085]⑶将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体购自美国InVitrogen公司,其图谱如图1所示分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因XynSyn2片段和PA0815片段;其中,酶切体系为:3〇此的载体、2此的EcoRI、10yL的10父81^61'、1仙2〇补齐至200此,37。〇条件下、酶切2h。[0086]⑷将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和PA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得pA0815-Xynsyn2重组表达载体;其中,连接体系为:1此的T4buffer、1此的T4DNA连接酶、5_5yL的Xynsyn2基因片段、2.5yL的pA0815片段、ddH20补齐至10此;在16。:条件下连接10h后,取5wL连接体系与大肠杆菌DH5a混匀后于冰上放置15min,然后于42。:反应lmin,再置于冰上2min,最后涂布于筛选平板上筛选阳性克隆,提取质粒,即得到具有木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝的pAOSl5-Xynsyn2重组表达载体,其结构如图1所示,木聚糖酶基因Xynsyn2由A0X1甲醇诱导型启动子驱动,由A0QTT终止子终止表达。[0087]5利用电转仪将单拷贝PA0815-Xynsyn2重组表达载体转化入巴斯德毕赤酵母GS115美国Invitrogen公司)中,然后在YPD酵母浸出粉胨葡萄糖培养基平板上筛选得到阳性转化子,经PCR聚合酶链式反应验证为正确的阳性转化子,即获得单拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株。其中,电转化方法为:取1〇此的单拷贝PA0815-Xynsyn2重组表达载体与90uL的巴斯德毕赤酵母GS115混匀后于冰上放置5min,然后用电转化仪电击(电压1500V,加入YfD培养基含葡萄糖20gL、酵母粉l〇gL、蛋白胨20gL,于28°C孵育2h后涂布于平板上。[0088]提取PA0815-XynSyn2单拷贝的重组表达载体中的质粒载体,进行双酶切验证BglII和BamHI,结果如图2所示(图中:M为DL5000DNAMarker,1泳道为没有酶切的PA0815-Xynsyn2重组表达载体;2泳道为单酶切后的PA0815-Xynsyn2重组表达载体;3泳道为双酶切后的pA0815-XynSyn2重组表达载体)。由图3可知,在l〇〇〇bp位置有条带,说明木聚糖酶基因Xynsyn2成功连接至PA0815-Xynsyn2重组表达载体上。[0089]实施例2[0090]木聚糖酶基因XynSyn2多拷贝重组表达菌株的构建[0091]1将实施例1获得的PA0815-Xynsyn2单拷贝重组表达载体用BglII和BamHI双酶切后,胶回收大片段,得到PA0815-Xynsyn2片段,其中,酶切体系为:30uL的pA0815-Xynsyn2重组表达载体、l.5yL的BamHI、1.5yL的BglII、20uL的lOXBufferK、20uL的BSA、2〇wL的TritonX-100、ddH20补齐至200yL,37°C条件下,酶切4h。[OO92]⑵用BamHI单酶切新的PA0815-Xynsyn2单拷贝重组表达载体后胶回收,将其与步骤⑴得到的pA0815-Xynsyn2片段用T4DNA连接酶连接,得到具有两拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组质粒的PA0815-Xynsyn2重组表达载体,其结构如图3所示;将两拷贝PA0815-XynSyn2重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母GS115宿主细胞中,筛选阳性克隆子,获得两拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株。[0093]根据本实施例提供的步骤2,以此类推即可获得具有多拷贝(包括三拷贝、四拷贝等木聚糖酶基因Xynsyn2的pA0815-Xynsyn2重组表达载体,再将多拷贝pA0815-Xynsyn2重组表达载体导入巴斯德毕赤酵母GS115宿主细胞中,筛选阳性克隆子,获得多拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株。[0094]3木聚糖酶含量测试:摇瓶发酵培养上述步骤获得的木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝和两拷贝重组表达菌株,提取上清液,进行SDS-PAGE十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳测试,结果如图4所示(图中:1-1、1-2、1-3、1-4和1-5为木聚糖酶基因Xynsyn2单拷贝的重组表达菌株;2-1、2-2、2-3、2-4为木聚糖酶基因\7!1^112两拷贝的重组表达菌株),从图4可以看出,两拷贝PA0815-XynSyn2重组表达菌株的发酵上清液中的木聚糖酶含量较高,说明两拷贝pA0815-Xynsyn2重组表达载体的木聚糖酶的表达量较高。[0095]⑷DNS法测定木聚糖酶酶活:[0096]a、取0.5mL稀释100倍的上清液上述步骤3中获得),加入到0.5mL的木聚糖溶液(1%和lmL的醋酸钠-醋酸缓冲液pH值为5.0的混合液中,于50°C水浴反应lOmin,用2mL的DNS3,5-二硝基水杨酸终止反应,然后置于沸水浴中5min,冷却至室温后用蒸馏水定容至25mL,混合均匀后测试520nm处的吸光度;[0097]b、配制浓度为lmgmL的木聚糖标准溶液,准确量取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mL的木聚糖标准溶液,用蒸馏水定容至2mL,再加入2mL的DNS,置于沸水浴中5min,冷却至室温后测试520nm处的吸光度,绘制木聚糖标准曲线;[0098]c、根据酶活公式计算出木聚糖酶酶活,其中,每分钟水解棉籽糖形成lum〇l葡萄糖所需的酶量为1个酶活力单位U。酶活UmL计算公式为:U=rXDfX1000150.14t,其中,Df为上清液稀释倍数;r为根据0D52q吸光度值,从木聚糖标准曲线上读取的与标准木聚糖溶液相对应的浓度ugmL得到的葡萄糖的摩尔浓度wnolmL为酶解反应时间min〇[0099]计算结果为:单拷贝重组表达菌株的上清液稀释100倍酶活为96UmL;两拷贝重组表达菌株的上清液稀释1〇〇倍的酶活为200UmL,其中,两拷贝重组表达菌株的酶活比单拷贝提高了52.30%。[0100]在现有技术中,通过人工合成优化来自于嗜热裂孢菌的木聚糖酶基因xylllM,发酵表达后的最高酶活为l〇5_3UmL;以及通过克隆来源于海栖热袍MSB8菌的木聚糖酶基因XylB,并在P•pastoris毕赤酵母中表达,其木聚糖酶最大酶活为5〇umL。由上述计算结果可知,通过本发明实施例制备的木聚糖酶两拷贝)相比于现有技术中制备的木聚糖酶,其酶活得到了显著的提升。[0101]实施例3[0102]木聚糖酶的发酵生产[0103]⑴将实施例2中的两拷贝木聚糖酶基因Xynsyn2重组表达菌株400mL种子液接种至含发酵培养基的发酵罐体积为10L中进行发酵培养,其中,发酵培养基包括:350g的KlfePOUg的CaSOUOg的NH42S〇4、5〇g的MgS〇4、120g的K2S〇4以及560g的甘油,然后加入蒸馏水定容至7L。[0104]2发酵培养各阶段的条件控制如下:[0105]a、生物量积累阶段:罐温为28t:,pH值为6.0,转速为400rpm,通气量3.5Lmin,持续20h;[0106]b、营养流加阶段:步骤a之后,流加甘油和葡萄糖的混合溶液(葡萄糖1〇8+甘油l〇g,发酵参数不变,持续2h;[0107]c、饥饿阶段:步骤b之后,开始流加甲醇并逐渐降低转速和通气量,在2h内使甲醇含量达到0.5%,温度降低至25°C此阶段为酵母适应甲醇碳源阶段),甲醇流速为4.0mLLh,流加时间为24h;[010S]d、甲醇流加第二阶段:酵母适应甲醇后,溶氧开始下降,调节转速和通气量使溶氧维持在30%,温度为25°C,pH值为5•5,甲醇流速为4•OmLLh,流加时间为48h;[0109]e、甲醇流加第三阶段:减少甲醇流速至2.5mLLh,使溶氧维持在20%。24h后结束发酵,得到含木聚糖酶的发酵上清液。[0110]3将发酵上清液提纯后,即可得到木聚糖酶。[0111]⑷木聚糖酶产量测试:在发酵过程中,取不同的时间点(0h、24h、48h、72h、96h和12〇h的f酵上清液,通过上述DNS法测试酶活,结果如图5所示,并进行SDS-PAGE测试,结果如图6所示。由图5和图呵知,48h之前,木聚糖酶表达量很低,这是由于此时酵母处于营养生长阶段,还没有进入甲醇诱导阶段,故木聚糖酶表达量较低;营养生长阶段的酶活比较低且变化趋势也较小,进入诱导阶段后酶活开始急剧上升,在发酵后期酶活逐渐趋于稳定。在发酵时间达到120h时,木聚糖酶的产量最高,此时,发酵上清液稀释倍数为100倍时酶活为200UmL,10L发酵液上清稀释1〇〇倍测得酶活达到3〇〇〇umL。[0112]5木聚糖酶最适应用条件测试:[0113]a、最适温度测试:将水浴温度在55〜95°C之间,每隔5°C设定为一个温度反应区间,通过上述DNS法测试木聚糖酶酶活,以测得的最高酶活值设定为100%,计算其他各温度反应区间的相对比酶活,计算结果表明,本实施例提供的木聚糖酶的最适温度范围为60〜70°C优选为60°C。[0114]b、最适pH值测试:将缓冲液的PH值在3〜10之间,每隔1个pH单位设定为一个反应区间,通过上述DNS法测试木聚糖酶酶活,以测得的最高酶活值设定为100%,计算其他各反应区间的相对比酶活,其中,pH值为3、7和8时,缓冲液选用50mmo1的柠檬酸-Na2HP〇4缓冲液,pH值为4、5和6时,缓冲液选用50mm〇l的NaAC-HAC缓冲液,pH值为9和10时,缓冲液选用50mmol的甘氨酸-NaOH缓冲液。计算结果表明,本实施例提供的木聚糖酶的最适pH*58〜6.2优选为6.0。[0115]实施例4[0116]木聚糖酶水解木聚糖[0117]⑴水解木聚糖:取0.5mL实施例3制备的发酵上清液,加入到〇•5mL木聚糖溶液1%和lmL醋酸钠-醋酸缓冲液pH为6.0的混合溶液中,于6rc水浴反应5min。[°118]2薄层层析测试木聚糖水解效果:取上述步骤(1中的反应液(1〜2uL点于硅胶板上,吹干后放入有展开剂的展开缸中展层5〇min,再次吹干娃胶板,然后在娃胶板上均匀喷涂显色剂丨吹干后立即放入108。:的烘箱中烘干5min后取出,结果如图7所示,其中,图7A为本发明实施例4提供的木聚糖酶水解木聚糖的结果图,图?B为公开文献《产碱性木聚糖酶菌株的筛选及酶学性质》中木聚糖酶水解木聚糖的结果图。[0119]由可知,图713中,木聚糖经过木聚糖酶水解后仍然没有被完全水解,而图7A中,木聚糖水解前包括木聚糖和杂多糖,水解后只剩下木二糖以及少量的木糖,说明本发明实施例提供的木聚糖酶可以将木聚糖完全水解。[0120]综上所述,本发明根据毕赤酵母的偏好性对木聚糖基因进行优化设计后,将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2与pA0815表达载体连接后,转入毕赤酵母GSU5中表达,并结合多拷贝技术获得重组表达菌株,最后发酵培养重组表达菌株获得木聚糖酶,其摇瓶发酵的发酵上清液稀释100倍的酶活可达96UmL,其发酵罐培养的发酵上清液稀释1〇〇倍)的酶活可达3000UmL,制备工艺简单且产量高,而且提高了木聚糖酶酶活和表达量。此外,本发明提的制备木聚糖酶的方法,通过培养含上述木聚糖酶基因Xynsyn2的细胞,能够高效率、闻广量地生产出木聚糖酶,制备的木聚糖酶的最适温度为6〇«c,最适邱为6•〇,可以高效地水解木聚糖。[0121]=以上仅为本发明的优选实施例,并非因此限制本发明的专利范围,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包括在本发明的专利保护范围内。〃、

权利要求:1.一种木聚糖酶基因Xynsyn2,用于编码木聚糖酶,其特征在于,所述木聚糖酶基因XynSyn2的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。2.—种木聚糖酶,其特征在于,所述木聚糖酶的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。3.—种重组表达载体,其特征在于,包括如权利要求1所述的木聚糖酶基因Xynsyn2。4.如权利要求3所述的重组表达载体,其特征在于,所述木聚糖酶基因Xynsyn2的拷贝数为多个。5.—种重组表达菌株,其特征在于,包括如权利要求1所述的木聚糖酶基因XynSyn2。6.如权利要求5所述的重组表达菌株,其特征在于,所述重组表达菌株的宿主细胞为毕赤酵母。7.—种如权利要求3至4任意一项所述的重组表达载体的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体pUC57,获得pUC-Xynsyn2载体;将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;将木聚糖酶基因Xynsyn2片段和PA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得PA0815-Xynsyn2重组表达载体。8.—种如权利要求5至6任意一项所述的重组表达菌株的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将合成的木聚糖酶基因Xynsyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体pUC57,获得pUC-Xynsyn2载体;将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;将木聚糖酶基因XynSyn2片段和PA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得PA0815-Xynsyn2重组表达载体;将PA0815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株。9.一种如权利要求2所述的木聚糖酶的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将合成的木聚糖酶基因XynSyn2通过酶切位点EcoRI连接到中间载体PUC57,获得PUC-Xynsyn2载体;将pUC-Xynsyn2载体和pA0815载体分别用EcoRI酶切,电泳、胶回收木聚糖酶基因Xynsyn2片段和pA0815片段;将木聚糖酶基因XynSyn2片段和PA0815片段通过T4DNA连接酶连接,获得PA0815-Xynsyn2重组表达载体;将pA0815-Xynsyn2重组表达载体导入毕赤酵母宿主细胞中,获得重组表达菌株;培养重组表达菌株,从培养物中获得木聚糖酶。10.—种制备饲料的方法,其特征在于,包括步骤:在糖化过程的蛋白质休止期或发酵过程中添加如权利要求2所述的木聚糖酶。

百度查询: 武汉轻工大学 木聚糖酶基因、重组表达载体、重组表达菌株、木聚糖酶及其制备方法、及饲料的制备方法

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