申请/专利权人：中国医学科学院生物医学工程研究所

申请日：2017-11-14

公开（公告）日：2020-10-23

公开（公告）号：CN107823184B

主分类号：A61K9/51(20060101)

分类号：A61K9/51(20060101);A61K47/32(20060101);A61K31/704(20060101);A61P35/00(20060101);C08F220/38(20060101);C08F220/28(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.23#授权;2018.04.17#实质审查的生效;2018.03.23#公开

摘要：本发明公开了一种氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体的制备方法与应用，其通过聚乙二醇PEG‑聚2‑2,4二硝基‑N‑乙基苯基磺酰胺甲基丙烯酸乙酯AMA‑DNBSEPEDE两亲性聚合物在水溶液中自组装得到。该聚合物纳米粒具有明确的核‑壳结构，通过相似相容原理负载疏水药物，其性质稳定、具有被动靶向递送功能。该聚合物纳米粒疏水链段含有强拉电子基团2,4‑二硝基‑苯磺酰胺结构，能够与巯基快速发生亲核取代反应产生仲胺基团，仲胺基团发生质子化导致纳米载体的组装稳定性发生扰动，从而实现氧化还原敏感诱导pH响应的药物释放。

主权项：1.一种氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体，其特征在于它是聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯-聚2-2,4二硝基-N-烷基苯基磺酰胺甲基丙烯酸酯两亲性聚合物，在水溶液中自组装得到，该两亲性聚合物具有如下结构通式： 其中，a，b，c，d为各自独立的整数，a=1-16，b=1-10,c=5-50，d=5-50；制备方法包括的步骤：1）以有机碱为缚酸剂，含有伯胺端基的甲基丙烯酸酯单体与2,4-二硝基苯磺酰氯在无水四氢呋喃中反应得到磺酰胺中间体；2）以偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦为催化剂，磺酰胺单体与醇单体发生光延反应，得到所述的目标单体：2-2,4二硝基-N-烷基苯基磺酰胺甲基丙烯酸酯；3）以2-2,4二硝基-N-烷基苯基磺酰胺甲基丙烯酸酯与聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯mPEGMA为单体，苯基-（2-羟乙基）硫代碳酸酯为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂，通过可逆加成链转移自由基聚合得到两亲性无规共聚物；其中，可通过调控单体与链转移剂的比例，控制聚合物的分子量；通过调整两种单体的投料比控制聚合物的亲疏水链段比例，进而调控纳米探针的组装；聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯和2-2,4二硝基-N-烷基苯基磺酰胺甲基丙烯酸酯的摩尔比为1:1-1:4。

全文数据：氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体的制备方法与应用技术领域[0001]本发明涉及一种氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体的制备方法与应用。背景技术[0002]近年来，纳米药物递送系统以其纳米级尺寸、良好的稳定性和药物负载能力等特性，促进药物在肿瘤部位富集，降低毒副作用，在癌症治疗方面具有很大的应用潜力。但是，多数临床使用的纳米药物并未获得突破性的治疗效果。纳米药物潜力与临床治疗效果的差距，表明载体设计与人体实际生理环境存在差异。纳米药物自静脉注射，到达肿瘤组织并在分子水平上发挥作用，需要历经体循环、肿瘤血管溢出、肿瘤组织富集和分布、细胞内吞、内涵体逃逸、细胞内分布和发挥效应等复杂过程，各阶段生理屏障都制约着纳米药物作用的有效发挥。例如，体循环过程中的体液稀释效应，网状内皮系统RES的清除作用，某些类型肿瘤高通透性和滞留（EPR效应不明显以及血管通透性分布不均一，纳米药物在肿瘤细胞内不能快速释放以保持有效的药物浓度，长期使用诱导多药耐药性MDR产生等。因此，需要针对这些递送屏障和肿瘤微环境特点，合理设计纳米载体的结构，提高肿瘤内药物递送效率。发明内容[0003]本发明的目的在于提供氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体的制备方法与应用。以活性可逆加成链转移自由基聚合方法，制备了结构和组成可控的两亲性聚合物，构建抗肿瘤药物靶向递送的纳米载体。本发明提高了纳米载体的递送效率，实现药物在肿瘤细胞内的定位可控释放，可以解决现有技术中纳米药物载体的体循环清除速率快、靶向性差、控释效果差等诸多问题。[0004]本发明提供的一种氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体为聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯-聚2-2，4二硝基-N-烷基苯基磺酰膨甲基丙烯酸酯两亲性聚合物，该聚合物结构和组成如下：[0005][0006]其中，a，b，c，d为各自独立的整数，a=l-16，b=l_10，c=5〜50，d=5〜50。[0007]本发明提供的氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体的制备方法包括如下步骤：[0008]1以有机碱为缚酸剂，含有伯胺端基的甲基丙烯酸酯单体与2,4_二硝基苯磺酰氯在无水四氢呋喃中反应得到磺酰胺中间体;含有伯胺端基的甲基丙烯酸酯单体与2,4_二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1:3,优选1:1.5。[0009]步骤1中所述的有机碱是三乙胺、三丙胺、二异丙基乙胺、吡啶、N-甲基吗啉等。[0010]2以偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦为催化剂，磺酰胺单体与醇单体发生光延反应，得到所述的目标单体:2-2,4二硝基-N-烷基苯基磺酰膨甲基丙烯酸酯;其中3=1-16，b=l-lLa，b为各自独立的整数。[0011][0012]磺酰胺单体与醇单体的摩尔比为1:1-1:5,优选1:2.所述的醇单体为乙醇、丙醇、正丁醇、正戊醇、正戌醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇。[0013]3以2-2,4二硝基-N-烧基）苯基磺酰膨甲基丙烯酸酯与聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯mPEGMA为单体，苯基-2-羟乙基硫代碳酸酯为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂，通过可逆加成链转移自由基聚合得到两亲性无规共聚物。其中，可通过调控单体与链转移剂的比例，控制聚合物的分子量;通过调整两种单体的投料比控制聚合物的亲疏水链段比例，进而调控纳米探针的组装。[0014]聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯mPEGMA和2-2,4二硝基-N-烷基）苯基磺酰胺）甲基丙烯酸酯的摩尔比为1:1-1:4。[0015]本发明提供了一种氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体应用于制备纳米药物体系，该纳米药物体系是氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体负载疏水性药物，所述的疏水性药物选自于阿霉素DOX、紫杉醇PTX、多西他赛TXT、喜树碱CPT、羟基喜树碱HCPT、长春花碱VLB、地塞米松DXM、姜黄素CUR、博来霉素BLM中的至少一种，载药质量为〇.5-15%;所述的载药纳米粒的粒径平均为5〇-20〇11111。[0016]所述的纳米药物体系的制备方法包括的步骤:将氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体与疏水性药物，用三氟乙醇溶剂超声溶解，在超声作用下直接分散于pH=7.4的的磷酸盐缓冲溶液中，即得到载药纳米粒。溶剂挥发完全后，离心，除去沉积的疏水性药物即可。[0017]按照通常的方法制备出冻干粉剂型或者生理盐水分散液针剂。[0018]本发明提供了一种氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体的制备方法与应用。以活性可逆加成链转移自由基聚合方法，制备结构和组成可控的两亲性聚合物，该聚合物纳米粒具有明确的核-壳结构，通过相似相容原理负载疏水药物，其性质稳定、具有被动靶向递送功能。本发明可以构建抗肿瘤药物靶向递送的纳米载体，负载疏水性药物，得到载药纳米粒。特别是本发明疏水链段为聚2_2,4二硝基-N-烷基苯基磺酰胺）甲基丙烯酸酯，链段中存在强拉电子基团2,4_二硝基-苯磺酰胺，其能够与巯基快速发生亲核取代反应产生仲胺基团，仲胺基团在PH7.4条件下发生质子化，导致纳米探针组装解体，从而促进所负载药物的快速释放。即提高了纳米载体的递送效率，实现药物在肿瘤细胞内的定位可控释放，可以解决现有技术中纳米药物载体的体循环清除速率快、靶向性差、控释效果差等诸多问题。附图说明[0019]图1单体Ml核磁氢谱和碳谱表征。（A核磁氢谱；⑻核磁碳谱，其中以氘代氯仿为溶剂。[0020]图2聚合物P4核磁氢谱表征。[0021]图3纳米探针M粒径和微观形貌。[0022]图4纳米探针M的巯基响应紫外变化。[0023]图5纳米探针M体外药物释放。具体实施方式[0024]下面结合具体实施例，进一步详细阐述本发明，但本发明的保护范围并不限于此。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件;所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。[0025]实施例1单体Ml的合成[0026]单体Ml的化学结构如下图所示。具体合成步骤如下：首先，在IOOmL圆底烧瓶中加入甲基丙烯酸-2-氨基乙基酯盐酸盐（1.65g，10mmol，三乙胺（2.02g，20mmol，加入50mL无水四氢呋喃分散溶解，在冰浴条件下滴加2，4-二硝基苯磺酰氯2.66g，lOmmol的四氢呋喃溶液，滴加完成后恢复至室温反应l〇h。将反应液减压蒸馏除去溶剂，再进行柱层析分离，以乙酸乙醋石油醚混合液通用比例为洗脱剂，收集含目标化合物的洗脱液，蒸除溶剂后，即得中间产物2-2,4_二硝基苯基磺酰胺）甲基丙烯酸乙酯，收率70%。其次，在IOOmL圆底烧瓶中加入2-2,4-二硝基苯基磺酰膨甲基丙烯酸乙酯（3.59g，10mmol，乙醇0.92g，20mmol，三苯基膦Ph3P5.24g，20mmol，加入50mL无水四氢呋喃分散溶解，在冰浴条件下滴加偶氮二甲酸二乙酯（3.48g，20mmol的四氢呋喃溶液，滴加完成后恢复至20°C反应10h。将反应液减压蒸馏除去溶剂，再进行柱层析分离，以乙酸乙醋石油醚混合液为洗脱剂，收集含目标化合物的洗脱液，蒸除溶剂后，即得最终产物2-2，4-二硝基-N-乙基苯基磺酰胺甲基丙烯酸乙酯，收率85%。[0027][0028]核磁氢谱、碳谱如图1所示，数据如下所述:1HNMR300MHz，CDCl3δ8.53d，J=2.2Ηζ,ΙΗ,8.51-8.46m,3H,8.31s,1H,8.28d,J=O.4Hz,1H,6.10t,J=I.OHz,2H,5.60p,J=1.4Hz,2H,4.33t,J=5.7Hz,4H,3.70t,J=5.7Hz,4H,3.49q,J=7.2Hz,4H,1.94t，J=2.4Hz，3H，1.20t，J=7.2Hz，4H.13C匪R125MHz，CDC13S167.0，149.8,148.1，139.I,135.8,132.7,126.5,126.4,112.0,61·8,45·6,43·2,18.3,13.6.[0029]依照实施例1中的方法，仅改变R基团所属醇和伯胺端基的甲基丙烯酸酯单体，即可以得到其他单体。[0030]实施例2聚合物P4的合成[0031]在shlenk反应管中依次加入可逆加成-断裂链转移聚合RAFT链转移剂苯基-2-轻乙基）硫代碳酸酯（6.111^，0.11111、聚乙二醇单甲醚甲基丙稀酸甲酯11^61^50〇11^，ImM和2-2,4二硝基-N-乙基苯基磺酰膨甲基丙烯酸乙酯AMA-DNBSE455mg，ImM、引发剂AIBN1.64mg，0.OlmM和3mL溶剂二甲基甲酰胺DMF，抽真空通氩气三个循环后，密闭反应管，在68-72°C的油浴中反应24h。反应结束后，加入DMF溶解，装入透析袋中，用去离子水透析72h，每12h更换一次透析液。之后，冷冻干燥得到PEDF聚合物。利用核磁氢谱对P4聚合物进行表征，结果如附图2所示。[0032]依照实施例2中的方法，可以得到表1及其他组成比例的聚合物，如表1:[0033]表1.聚合物的组成与相应纳米探针的粒径及分布[0034][0035]实施例3载药纳米粒的制备方法[0036]称取PEDF聚合物20mg，阿霉素6mg，用2mL三氟乙醇超声溶解，在超声作用下直接分散于IOmLpH=7.4的0.OlM的磷酸盐缓冲溶液中，即得到N4纳米粒，纳米粒浓度为2mgmL。溶剂挥发完全后离心，除去沉积的药物，利用激光粒度仪和透射电子显微镜检测纳米粒的粒径和形态，检测结果如附图3所示，本实施例中制备的纳米粒的粒径为120nm，粒径分布0.12,且呈现明显的核-壳结构。利用紫外分光光度计检测此纳米药物的载药量为2.8%〇[0037]依照实施例3中的制备方法，可以制备其他聚合物组成和药物组分的载药纳米粒。[0038]实施例4聚合物P4的谷胱甘肽响应评价[0039]取5mLlmgmL的P4聚合物水分散液溶液，在氩气保护条件下加入谷胱甘肽GSH母液，使GSH的最终浓度为IOmM，在设定的时间点，利用紫外分光光度计对聚合物疏水链段2，4-二硝基苯磺酰胺结构变化进行跟踪检测。如附图4所示，纳米探针能够对巯基产生快速响应，在GSH存在条件下，紫外吸收发生明显变化。[0040]依照实施例4中的评价方法，对所述不同组成比例的聚合物进行巯基响应速率分析。[0041]实施例5载药纳米粒M的谷胱甘肽响应药物释放[0042]5mLN4纳米粒溶液（lmgmL封装在截留分子量为3500Da的透析袋中，释放液为pH=7.4的IOmM磷酸盐缓冲溶液，为了模拟细胞内的还原环境，GSH的浓度为10mM。释放在37°C的恒温振荡器中进行。在预定的时间点，取出5mL的释放液，补加相同体积的新鲜释放液。药物的释放量利用紫外分光光度计进行测定。[0043]释放结果如图5所示，在无激条件下，药物的释放速率缓慢。而在模拟细胞内GSH刺激条件作用下，药物发生快速释放，在8h内能够释放出全部负载的药物。

权利要求：1.一种氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体，其特征在于它是聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯-聚2-2，4二硝基-N-烷基苯基磺酰膨甲基丙烯酸酯两亲性聚合物，在水溶液中自组装得到，该两亲性聚合物具有如下结构通式：其中，a，b，c，d为各自独立的整数，a=l_16，b=1-10，c=5-50，d=5_50。2.权利要求1中所述的氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体的制备方法，其特征在于包括的步骤：1以有机碱为缚酸剂，含有伯胺端基的甲基丙烯酸酯单体与2，4-二硝基苯磺酰氯在无水四氢呋喃中反应得到磺酰胺中间体；2以偶氮二甲酸二乙酯和三苯基膦为催化剂，磺酰胺单体与醇单体发生光延反应，得到所述的目标单体:2_2,4二硝基-N-烷基苯基磺酰胺）甲基丙烯酸酯;其中a=l-16，b=l-10，a，b为各自独立的整数;所述的醇单体为乙醇、丙醇、正丁醇、正戊醇、正戌醇、正己醇、正庚醇、正辛醇、正壬醇、正癸醇；3以2-2,4二硝基-N-烷基）苯基磺酰胺）甲基丙烯酸酯与聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯mPEGMA为单体，苯基-2-羟乙基硫代碳酸酯为链转移剂，偶氮二异丁腈为引发剂，通过可逆加成链转移自由基聚合得到两亲性无规共聚物。其中，可通过调控单体与链转移剂的比例，控制聚合物的分子量;通过调整两种单体的投料比控制聚合物的亲疏水链段比例，进而调控纳米探针的组装。聚乙二醇单甲醚甲基丙烯酸甲酯和2-2,4二硝基-N-烷基）苯基磺酰胺）甲基丙烯酸酯的摩尔比为1:1-1:4。3.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤1中所述的有机碱是三乙胺、三丙胺、二异丙基乙胺、吡啶、N-甲基吗啉。4.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于所述的含有伯胺端基的甲基丙烯酸酯单体与2，4-二硝基苯磺酰氯的摩尔比为1:1-1:3。5.按照权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤2中所述的磺酰胺单体与醇单体的摩尔比为1:1-1:5。6.权利要求1所述的氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体应用于制备纳米药物体系的应用。7.按照权利要求6所述的制备纳米药物体系的应用，其特征在于该纳米药物体系是氧化还原敏感诱导PH响应纳米药物载体负载疏水性药物，所述的疏水性药物选自于阿霉素DOX、紫杉醇PTX、多西他赛TXT、喜树碱CPT、羟基喜树碱HCPT、长春花碱VLB、地塞米松DXM、姜黄素CUR、博来霉素BLM中的至少一种，载药质量为0.5-15%;所述的载药纳米粒的粒径为50_200nm。8.按照权利要求7所述的制备纳米药物体系的应用，其特征在于所述的纳米药物体系的制备方法包括的步骤:将氧化还原敏感诱导pH响应纳米药物载体与疏水性药物，用三氟乙醇溶剂超声溶解，在超声作用下直接分散于pH=7.4的的磷酸盐缓冲溶液中，即得到载药纳米粒，溶剂挥发完全后，离心，除去沉积的疏水性药物即可。9.按照权利要求7所述的制备纳米药物体系的应用，其特征在于所述的纳米药物体系为冻干粉剂型或者生理盐水分散液针剂。

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