申请/专利权人：艾一生命科技(广东)有限公司

申请日：2018-06-05

公开（公告）日：2020-10-23

公开（公告）号：CN108715850B

主分类号：C12N15/113(20100101)

分类号：C12N15/113(20100101);C12N15/90(20060101);C12N5/10(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.10.23#授权;2018.11.23#实质审查的生效;2018.10.30#公开

摘要：本发明提供了一种采用CRISPR‑cas系统针对表皮干细胞进行GINS2基因编辑，特别是涉及一种构建GINS2基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。其中构建并获得了两个特异的gRNA，能够显著提高表皮干细胞内CRISPRCas9针对GINS2的基因编辑效率。本发明提供的表皮干细胞GINS2敲除质粒具有较好的遗传稳定性以及较高的打靶效率。

主权项：1.一种用于表皮干细胞GINS2基因编辑的CRISPR-CAS系统，其特征在于：系统的组成包括：（1）用于表达SEQIDNO：1所示的ESCS-higher的质粒；（2表达SEQIDNO：3或4所示sgRNA和Cas9的PX330质粒。

全文数据：表皮干细胞中采用CRISPR-Cas系统进行GING2基因敲除技术领域[0001]本发明提供一种采用CRISPR-cas系统针对表皮干细胞进行GING2基因编辑，特别是涉及一种构建GING2基因敲除的表皮干细胞细胞系的建立。背景技术[0002]表皮干细胞Epidermalstemcells，EpiSCS是具有自我增殖和多向分化潜能的干细胞，它的正常增殖和分化是维持皮肤及其附属器汗腺毛发、皮脂腺结构和功能完整性的基本要求。在生理条件下，表皮干细胞通过不对称分裂方式分化为一个干细胞和一个短暂扩充细胞transitamplifyingcellsTA细胞），TA细胞再经过多次分裂后分化为有丝分裂后细胞（Post-mitoticcells及终末分化细胞（terminally-differentiatedcells，以补充表皮细胞不断更新的需要。研宄表明表皮干细胞不仅能在体外长期传代培养，并保持其增殖分化潜能（Dunnwaldetal，ExpDermatol,2001，10:45-54.Papinietal.stemcells，2003,21:481-494，而且，在一定环境条件下还表现出与胚胎干细胞相似的分化潜能[Liangetal，stemcelIs，2002:20:21-:31]。因此，获得纯化的表皮干细胞不仅可为构建有生理功能的人工皮肤提供种子细胞，而且可用于基因治疗和转基因动物的生产。[0003]人类多能干细胞Humanpluripotentstemcells,hPSCs和基因组编辑技术结合所建立的细胞模型，为疾病研宄提供了一个独特的实验平台。利用这个平台体系，研宄人员可以研宄特定基因突变甚至染色体结构变异对人类多种细胞类型和组织器官功能的影响及其详细的分子机制，并可建立携带不同遗传突变的“个性化”疾病模型用于大规模药物筛选。该模型体系的建立得益于基因组编辑技术，尤其是CRISPRCas9ClusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatsCRISPR-associatedproteins9,CRISPRCas9技术的飞速发展。[0004]GINS2是DNA复制复合体GINS家族成员之一，位于人染色体16q24上，其mRNA长度为1196bp，编码相对分子质量为21000的蛋白质。GINS是一种复制解旋酶，在移动到复制叉前打开DNA双链。研究表明，GINS家族成员在癌症的发生中起一定作用，如GINS家族成员在侵袭性黑色素瘤中过表达，也有文献表明，DNA复制相关蛋白在不同细胞中有不同的作用，如在决定中心体复制数量和疾病发生的不同阶段方面，GINS均发挥了一定功能，特别是与染色体的分离密切相关。[0005]而目前关于GINS2在肿瘤相关领域的报道很少。在CN106620703A中，针对人GINS2基因的小分子干扰RNA序列，RNA干扰载体和RNA干扰慢病毒，进一步检测了GINS2基因的沉默效率、GINS2-siRNA慢病毒对肿瘤细胞增殖能力和凋亡水平的影响，结果显示采用RNAi方法下调人GINS2基因的表达后可有效抑制肿瘤细胞的增殖和生长并促进其凋亡，表明GINS2基因是原癌基因，可作为肿瘤治疗的靶点，通过RNAi方式沉默GINS2基因的表达可作为抑制肿瘤发展的有效手段。但是在该研宄中，采用的是SiRNA进行干扰，所述方法具有敲除不彻底，不能稳定的敲除遗传的缺陷。在（IntegrationofGenomic,Biologic,andChemicalApproachestoTargetp53LossandGain-〇f-FunctioninTripleNegativeBreastCancer中，虽然提到了CRISPRCas可以用于MCM2，GINS2，Cl9orf43，EL0VL2，ARL4D，DNM30S，FGFR2，IFIT2，MPPED2，B2M，ERRFI1，GLULCASP4，CPED1，SPTLC2，CMTM6，CFH，CARS2，SUMF1，但是只是一个构想，并没有实施。针对不同的基因进行CRISPR修饰并非简单容易设计的，需要克服众多障碍，具有极大地实验困难。[0006]基于表皮干细胞的多能性，为了研究敲除GINS2基因的表皮干细胞在癌症治疗方面的功能，建立敲除GINS2基因的表皮干细胞细胞系变得尤为重要。发明内容[0007]本发明的目的是提供一种敲除GINS2基因的表皮干细胞，有效克服了现有技术使用siRNA进行干扰不能稳定遗传的技术缺陷。[0008]为实现上述目的，本发明提供一种CRISPR-cas系统的靶标，根据GINS2的基因序列，设计的具体的sgRNA如下：[0009]GINS2_sgRNA7:5’to3’aatgcccagcccttactaca[0010]GINS2_sgRNA23:5,to3,tgcatggaagccatcacact。[0011]为实现上述目的，本发明提供一种提高CRISPR-cas系统在表皮干细胞中敲除GINS2基因的方法，包括向宿主细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白ESCS-higher是由SEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质。[0012]进一步地，所述增效蛋白包含a或b:[0013]aSEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质的多核苷酸序列；[0014]1^3£〇10州:2所示的氨基酸序列。[0015]更进一步地，提供一种在表皮干细胞中采用CRISPRCas9进行基因编辑的系统，其特征在于所述系统包括：（1用于表达3£〇10即：1所述的£303-11181161'的质粒；（28_八己经插入的表达PX330的质粒其可以表达sgRNA和cas9。[0016]更进一步地，所述sgRNA和cas9表达载体也可以是本领域常用的其他表达载体。[0017]本发明提供了一种在表皮干细胞中采用CRISPRCas9基因编辑GINS2的方法，本发明具有以下优点：[0018]本发明提供了通过近百次的gRNA设计与优化，获得了在表皮千细胞中能够特异性的针对GINS2基因进行敲除的2个特意性的gRNA，具有较强的敲除效果，而且本发明在表皮干细胞中，构建了GINS2基因敲除的细胞系，筛选并优化获得了最佳的sgRNA，敲除效率高，传代稳定。附图说明[0019]图lWestern-blot检测GINS2蛋白表达结果图；4为表皮干细胞空白对照；3为未导入增效蛋白的gRNA7的效果;2为导入增效蛋白的gRNA7的效果；1为导入增效蛋白的gRNA23的效果。[0020]下面通过附图和实施例，对本发明的技术方案做进一步的详细描述。具体实施方式[0021]下面通过具体实施例进一步说明本发明提高基因组编辑效率的方法的技术方案。[0022]实施例UCRISPR表达载体的构建[0023]gRNA的设计[0024]根据靶基因的基因序列，通过申请人前期从几十个gRNA中优化设计具体筛选得到具体的sgRNA的形式如下：[0025]GINS2-sgRNA7:5’to3’aatgcccagcccttactaca[0026]GINS2-sgRNA23：5'to3'tgcatggaagccatcacact〇[0027]根据上述的gRNA，在其5’端加上CACC得到正向寡核苷酸序列，在其互补链的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸序列，分别合成正向和反向寡核苷酸序列，然后将合成的序列变性、退火，得到具有BbsI粘性末端的双链DNA片段，如下：正向：5’-CACCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN反向：NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCMA-5’，变性、退火体系为:2ul正向寡核苷酸链50uM2ul反向寡核苷酸链50uM46ul1*NEBbuffer在PCR仪中按以下程[0028]退火后的双链寡核苷酸链含有Bbsl的粘性末端，直接与被Bbsl酶切过的口\330_U6-Chimeric_BB-CBh-hSpCas9以下简称PX330载体进行连接，可以得PX330-gRNA_Cas9重组质粒。[0029]酶切体系：水39.3ul，10*FDbuffer5ul，BbsI2ul，PX3303.7ul2ug37°C水浴2h酶切后的质粒直接用胶回收试剂盒回收。[0030]连接体系：退火产物0.5ul，线性化的PX330质粒2ul，5*1igationbuffer2nl，T4DNALigase3unitsul，lul，水4.如1，16°C水浴2h将上述步骤得到的连接产物转化JM109感受态细胞，涂布于Amp+的LB平板，挑取阳性克隆接菌，37°C摇床摇菌过夜，质粒抽提试剂盒提取质粒并进行测序鉴定，得到PX330-gRNA质粒。[0031]实施例2克隆增效蛋白ESCS-higher及构建载体[0032]克隆增效蛋白ESCS-higher基因，通过全基因合成的方法，获得SEQIDNO:1所述的基因序列，以该序列为t旲板，根据上下游引物序列分别为5’-atgatatactttattagaat-3’，5’-tcaagggatttccatttctc-3’，引物和全基因组由上海生工有限公司合成。PCR反应扩增ESCS-higher基因目的基因片段，扩增反应体系如下：95°C、40s，57°C、lmin，72°C、lmin，72°C、10min，循环35次，PCR产物由上海生工有限公司进行测序，通过测序，结合与SEQIDNO:1完全匹配。随后，将PCR扩增的目的基因连接在空载体慢病毒载体pHIV-CS-CDF-CG-PRE上，通过PCR扩增、酶切、测序等方法鉴定重组慢病毒载体。结合证明重组慢病毒载体构建成功。随后将该重组慢病毒载体质粒同辅助质粒一起共感染表皮干细胞ESCs按照CN1253558C中权利要求1的方法分离培养获得），通过重组而包装成能表达ESCS-higher基因的表皮干细胞。通过PCR筛选鉴定，将稳定转染的干细胞用于后续基因编辑应用。[0033]实施例3CRISPRCas9在表皮干细胞中的应用分析[0034]将实施例1制备的SgRNA表达质粒，公知的Cas9表达质粒共转染表皮干细胞。采用脂质体转染法将构建好的转染表皮干细胞转染体系及试剂使LipofectamineTM2000invitrogen公司），转染详细步骤参照转染说明书。以未转染实施例2的增效基因的干细胞作为阳性对照。[0035]实施例4Western-blot检测GINS2蛋白表达情况[0036]1•总蛋白提取[0037]培养细胞裂解[0038]1将表皮干细胞贴壁细胞，去除培养液，用PBS洗一遍，悬浮细胞，离心收集，PBS洗一遍。[0039]⑵通常每1〇6个细胞可加0•lmlRIPAbuffer，裂解液和细胞充分接触。[0040]3冰上放置数分钟，用枪头轻轻吹打，使细胞充分裂解，再轻轻倾斜培养皿使裂解产物流向瓶皿的一边或一角，然后将之转移到l.5ml离心管，剧烈振荡30秒。[0041]⑷12,000Xg，4°C离心5分钟，取上清，即可进行后续的电泳、Western或免疫沉淀操作。[0042]组织块裂解[0043]1组织剪切成细小的碎片。每100毫克组织加入lmlRIPA裂解液。用玻璃勾楽器匀浆上下手动匀浆2〇次。[0044]2将匀浆物转移到1•5ml离心管。[0045]312，000Xg，4°C离心5分钟，取上清，S卩可进行后续的电泳、Western或免疫沉淀操作。[0046]2.蛋白浓度测定BCA测蛋白浓度）[0047]工作液的配制[0048]⑴测定前，按照BCAReagentA:BCAReagentB=100:1的比例混合后配制成工作液，例如配制30ml的工作液时，在30ml的BCAReagentA中添加0.3ml的BCAReagentB后，充分振荡混配制后的工作液可在4°C保存三天使用。[0049]2所需工作液量的计算方法如下：[0050]所需工作液总体积ml=[BSA标准溶液8份或7份+检测样品数）X平行样本数n+l]XI个样品所需的工作液体积[0051]例标准操作流程【lml反应体系】检测样品数为12个、平行样n=2时：[8+12X2+1]Xlml=41ml[0052]例）标准操作流程【200yl反应体系】、检测样品数为20个、平行样n=2时：[8+20X2+1]X0.2ml=11.4ml[0053]例低浓度蛋白质样品测定的操作流程【lml反应体系】、检测样品数为12个、平行样n=2时：[7+12X2+1]X0.5ml=19.5ml[0054]3.低浓度蛋白样品的标准操作流程定量范围:0〜200wgmlt〇〇55]【0.2ml反应体系•使用微孔板测定】[0056]1BSA标准品溶液的配制。[0057]10•2mgmlBSA标准品溶液的制备：取120iilBSAStandardSolution2mgml，加入l，080yl稀释液后充分混合。[0058]2按照不同的浓度稀释BSA标准品溶液，BSA标准品溶液和检测样品的稀释可使用去离子水、〇.9%NaCl或PBS。[0059]2BSA标准曲线的制备[0060]1分别取100yl稀释后的BSA标准品溶液加入到微孔板中，每个浓度取2个平行样。[0061]2加入lOOul工作液后，立即混匀。[0062]337°C水浴槽中反应60分钟后，冷却至室温。[0063]⑷使用分光光度计测定562nm处的吸光度值。测定时，使用lmL比色皿，用水校零。尽可能在20分钟内检测完毕所有样品。[0064]5各浓度BSA标准品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值，绘制BSA标准品溶液的标准曲线。[0065]3检测样品的测定[0066]检测样品测定时，建议同BSA标准品溶液同时进行测定。[0067]1分别取100U1检测样品加入到微孔板中，每个样品取2个平行样进行测定。[0068]如果必要，也可选择与BSA标准品溶液相同的稀释方法稀释检测样品后测定）[0069]⑵加入lOOul工作液后，立即混匀。[0070]⑶37°C水浴中反应60分钟后，冷却至室温。[0071]⑷酶标仪波长设定在562nm处进行测定。用水校零。尽可能在20分钟内检测完毕所有样品。[0072]各样品溶液的吸光度值减去Blank值的平均值，根据标准曲线计算出检测样品的蛋白浓度。[0073]4.SDS—PAGE电泳[0074]1玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。[0075]⑵配制10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。[0076]03当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。[0077]⑷配制4%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。[0078]5用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。（小玻璃板面向内，大玻璃板面向夕卜。若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。）（6取出上样样品与5XSDS上样缓冲液按4:1比例混合，混匀后沸水中煮5min使蛋白变性。[0079]⑺加足够的电泳液后按等量蛋白上样。[0080]8电泳，80V跑过浓缩胶后转换电压至120V，待溴酚兰跑到胶板底部刚好没有跑出即可。[0081]9将夹子打开使黑的一面保持水平，在上面依次垫海绵垫、滤纸、胶、PVDF膜经甲醇活化）、滤纸、海绵垫;同时将电泳液换成转移液。[0082]10将电流调整到恒流200mA，转移约1小时。[0083]11取出膜，并做好正反面标记，在TBST中清洗1分钟，然后用封闭液封闭。[0084]12用封闭液将对应的一抗稀释成一定的浓度（1:500，内参一抗的稀释终浓度为1:3000，然后温育1.5小时或4°C孵育过夜。[0085]13用TBST清洗3次，每次5分钟。[0086]14用封闭液将二抗稀释成一定的浓度1:30⑽，然后温育1.5小时。[0087]15用TBST清洗4次，每次5分钟。[0088]5.化学发光，显影，定影[0089]1将A和B两种试剂在试管内等体积混合，然后加在PVDF膜的正面，温育大概2分钟。[0090]⑵进入暗室，PVDF膜上盖一层保鲜膜，擦去多余的发光剂。将胶片压在保鲜膜上，依照发光的强度选择不同的曝光时间。[0091]⑶将胶片放入显影液中，出现条带后，立即放入定影液中，流水冲洗胶片后晾干。[0092]4对胶片进行扫描，然后用UVP凝胶图象处理系统Labw〇rkS4.6软件分析目的条带的灰度值。[0093]5通过Western-blot对转染后表皮干细胞中GINS2蛋白质表达进行检测，结果如图1所示，表皮干细胞空白对照，蛋白表达没有影响;未导入增效蛋白的gRNA1能够敲除目的基因，蛋白表达有一定影响;而导入增效蛋白的SRNA7具有显著的提高基因敲除效果蛋白抑制率达到92•1%;导入增效蛋白的gRNA23的蛋白表达抑制率达到91.〇%，效果极其显著。具有极好的应用前景和应用价值。、[0094]最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明g技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

权利要求：1.一种sgRNA，其用于基因编辑。2.—种88謝八，其序列如3£010冊:3或4任一所示。3.—种提高CRISPR-cas系统在离体的表皮干细胞中敲除GINS2基因的方法，包括向宿主细胞中引入增效蛋白，所述增效蛋白ESCS-higher是由SEQIDN0:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质;所述sgRNA，其序列如SEQIDNO:3或4任一所示。4.如权利要求3所述的方法，进一步地，所述增效蛋白包含a或b:aSEQIDNO:1所示的核苷酸序列编码的蛋白质；135£〇10购:2所示的氨基酸序列。5.—种在表皮干细胞中采用CRISPRCas9进行基因编辑的系统，其特征在于所述系统包括：⑴用于表达SEQIDNO:1所述的ESCS-higher的质粒；⑵sgRNA已经插入的表达PX330的质粒，其可以表达sgRNA和cas9。6.如权利要求5所述的系统，其特征在于：（1的质粒可以提前导入到基因编辑细胞中，筛选得到阳性细胞后，再转入⑵的质粒。7.权利要求5的系统在制备用于表皮干细胞基因编辑的试剂中的用途。8.权利要求2所述的gRNA在制备在表皮干细胞中及进行除的试剂中的用途。

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