【发明授权】细胞微囊、载有抗癌药物的细胞微囊、其制备方法和应用_中山大学_201910297938.7 

申请/专利权人:中山大学

申请日:2019-04-15

发明/设计人:冯敏;郭羚

公开(公告)日:2020-10-23

代理机构:广州广典知识产权代理事务所(普通合伙)

公开(公告)号:CN110025593B

代理人:曾银凤;万志香

主分类号:A61K9/50(20060101)

地址:510275 广东省广州市海珠区新港西路135号

分类号:A61K9/50(20060101);A61K47/46(20060101);A61K31/704(20060101);A61K31/337(20060101);A61K31/175(20060101);A61P35/00(20060101)

优先权:

专利状态码:有效-授权

法律状态:2020.10.23#授权;2019.08.13#实质审查的生效;2019.07.19#公开

摘要:本发明涉及一种细胞微囊、载有抗癌药物的细胞微囊、其制备方法和应用。细胞微囊的制备方法包括如下步骤:1培养免疫细胞,取细胞上清液;2将步骤1所述的细胞上清液离心以去除细胞及细胞碎片,取上清液;3将步骤2所述的上清液离心以去除凋亡小体,取上清液;4将步骤3所述的上清液离心,取沉淀,即得;步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2000‑3000g,离心时间为40‑100min。该制备方法操作简单,可获得具有优良生物活性、结构完整、纯度高、粒径均一的细胞微囊,将所得细胞微囊通过简单的孵育即可负载脂溶性的抗癌药物,用于预防或者治疗癌症疾病,效果很好,靶向性好,毒副作用低。

主权项:1.一种细胞微囊的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:1培养免疫细胞,取细胞上清液;2将步骤1所述的细胞上清液离心以去除细胞及细胞碎片,取上清液;3将步骤2所述的上清液离心以去除凋亡小体,取上清液;4将步骤3所述的上清液离心,取沉淀,即得;或者包括如下步骤:1培养免疫细胞,取细胞上清液;2将步骤1所述的细胞上清液离心以去除细胞及细胞碎片,取上清液;3将步骤2所述的上清液离心以去除凋亡小体,取上清液;4将步骤3所述的上清液离心,取沉淀;5将步骤4所述沉淀用无菌生理盐水重悬,离心,取沉淀,即得;步骤2中所述离心的条件包括:离心力为400-600g,离心时间为5-80min;步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2000-3000g,离心时间为40-100min;步骤4中所述离心的条件包括:离心力为9000-11000g,离心时间为50-70min;步骤5中所述离心的条件包括:离心力为9000-11000g,离心时间为50-70min。

全文数据:细胞微囊、载有抗癌药物的细胞微囊、其制备方法和应用技术领域本发明涉及生物和医药技术领域,特别是涉及一种细胞微囊、载有抗癌药物的细胞微囊、其制备方法和应用。背景技术根据世界卫生组织的报道,肿瘤即癌症是世界第二大死因,就全球范围而言,近六分之一的死亡是由癌症造成的。脂质体剂型由于其能减少药物在体内的毒副作用,常被用在临床癌症治疗上。目前,临床上使用的脂质体粒径大小在100nm左右,含有磷脂、胆固醇等脂质成分,但由于其作为外源性物质缺少生物活性,束缚了它进一步发展成为精准治疗的药物载体。机体循环系统中的各种免疫细胞分泌的囊泡具有多种的生理功能,这些功能包括,持久的血液循环寿命、对内源性物质和代谢物的转运能力、对病变部位的趋向性、穿过脂性生物膜屏障,激活免疫系统,刺激血管再生等。鉴于囊泡具有上述所携带的天然生物功能,且粒径范围为50nm~200nm,越来越多的研究者考虑将其开发为新型药物载体。胞外囊泡主要分为三种:凋亡小体、微囊和外泌体,微囊和外泌体均广泛存在并分布在各种体液中,可由多种细胞分泌的膜性囊泡,是体内的信息传递信使,其中外泌体是被研究和被应用的主要对象,而对于微囊的研究较少。发明内容基于此,本发明提供了一种细胞微囊的制备方法,该制备方法操作简单,可获得结构完整、纯度高的细胞微囊。具体技术方案如下:一种细胞微囊的制备方法,包括如下步骤:1培养免疫细胞,取细胞上清液;2将步骤1所述的细胞上清液离心以去除细胞及细胞碎片,取上清液;3将步骤2所述的上清液离心以去除凋亡小体,取上清液;4将步骤3所述的上清液离心,取沉淀,即得;步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2000-3000g,离心时间为40-100min。在其中一些实施例中,步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2400-2600g,离心时间为50-90min。在其中一些实施例中,步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2400-2600g,离心时间为50-70min。在其中一些实施例中,步骤2中所述离心的条件包括:离心力为400-600g,离心时间为5-80min。在其中一些实施例中,步骤2中所述离心的条件包括:离心力为450-550g,离心时间为8-15min。在其中一些实施例中,步骤4中所述离心的条件包括:离心力为8000-20000g,离心时间为40-80min。在其中一些实施例中,步骤4中所述离心的条件包括:离心力为9000-11000g,离心时间为50-70min。在其中一些实施例中,所述细胞微囊的制备方法还包括如下纯化的步骤:5将步骤4所述沉淀用无菌生理盐水重悬,离心,取沉淀,即得。在其中一些实施例中,步骤5中所述离心的条件包括:离心力为8000-20000g,离心时间为40-80min。在其中一些实施例中,步骤5中所述离心的条件包括:离心力为9000-11000g,离心时间为50-70min。在其中一些实施例中,所述培养的时间为12-72小时。在其中一些实施例中,所述培养的时间为40-56小时。本发明还公开了一种细胞微囊。该细胞微囊通过简单的孵育即可负载脂溶性的抗癌药物,用于治疗癌症疾病,治疗效果佳,动物体内治疗效果明显优于商品化脂质体和同源外泌体。具体技术方案如下:一种细胞微囊,由上述制备方法制备得到。本发明还公开了一种载有抗癌药物的细胞微囊。该载有抗癌药物的细胞微囊用于治疗癌症疾病,治疗效果佳,动物体内治疗效果明显优于载有抗癌药物的商品化脂质体和同源外泌体。具体技术方案如下:一种载有抗癌药物的细胞微囊,由上述的细胞微囊和脂溶性抗癌药物制备得到。在其中一些实施例中,所述脂溶性抗癌药物选自:阿霉素、紫杉醇和卡莫司汀中的至少一种。在其中一些实施例中,所述细胞微囊和所述脂溶性抗癌药物的配比为8-20mg:1μmol。在其中一些实施例中,所述细胞微囊和所述脂溶性抗癌药物的配比为9-12mg:1μmol。本发明还公开了上述载有抗癌药物的细胞微囊的制备方法。该制备方法非常简单,孵育即可得到产品,并且药物包封率高。具体技术方案如下:上述载有抗癌药物的细胞微囊的制备方法,包括如下步骤:将所述细胞微囊的溶液和所述脂溶性抗癌药物的溶液在温度为30-40℃的条件下静置孵育8-28小时。在其中一些实施例中,所述静置孵育的条件包括:温度为35-39℃,时间为12-24小时。在其中一些实施例中,所述细胞微囊的溶液浓度为5-20mgmL;及或,所述脂溶性抗癌药物的溶液浓度为0.5-2mmolmL。在其中一些实施例中,所述细胞微囊的溶液浓度为8-12mgmL;及或,所述脂溶性抗癌药物的溶液浓度为0.8-1.2mmolmL。本发明还提供了上述载有抗癌药物的细胞微囊的应用。具体技术方案如下:上述载有抗癌药物的细胞微囊在制备预防和或治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的细胞微囊、载有抗癌药物的细胞微囊、其制备方法和应用具有如下有益效果:本发明制备得到了具有优良生物活性、结构完整、粒径均一的细胞微囊,其制备方法非常简单,仅对免疫细胞的培养上清液通过简单的离心,并且控制一定的离心条件即可获得,操作条件温和、可控,可避免机械损伤造成的人为干扰,可获得完整自然状态的细胞微囊。将所得细胞微囊负载脂溶性的抗癌药物,用于预防或者治疗癌症疾病,效果很好。进一步地,通过差速离心法并且合理控制各步差速离心的条件离心力和时间,可以获得粒径更均一、纯度更高的细胞微囊,可以进一步提高负载脂溶性抗癌药物的细胞微囊的抗肿瘤效果。本发明负载抗癌药物的细胞微囊的制备方法非常简单,利用脂溶性物质间的静电疏水作用和微囊内外渗透压差异,将微囊与药物在一定条件下孵育即可将药物负载于微囊内,得到载药的细胞微囊产品,该方法制备过程短,成本低,药物的适用范围广泛,脂溶性的药物均可包载,并且稳定性好,载药率高,药物包封率高。负载药物后微囊载体仍保留自身生物特性,生物相容性好,便于高效靶向递送抗癌药物至肿瘤部位,使得负载抗癌药物的细胞微囊治疗靶向性和治疗效果好,动物体内治疗效果明显优于商品化脂质体和同源外泌体,并且治疗靶向性比商品化脂质体更精准,毒副作用更低。附图说明图1为细胞微囊和外泌体的形态鉴定图;图2为细胞微囊和外泌体的粒径检测图;图3为负载阿霉素的细胞微囊和外泌体的药物包封率;图4为负载阿霉素的细胞微囊和外泌体的药物累积泄露量;图5为负载阿霉素的细胞微囊与外泌体的体外抗肿瘤效果;图6为负载阿霉素的细胞微囊与外泌体的体外抗肿瘤细胞侵袭的效果;图7为负载阿霉素的细胞微囊与外泌体给药后药物在体内组织中的分布;图8为负载阿霉素的细胞微囊与外泌体的体内抗肿瘤效果。图中:微囊药物制剂是指本发明制备的负载阿霉素的细胞微囊;外泌体药物制剂是指负载阿霉素的外泌体;商品化脂质体制剂是指购自石药集团的盐酸多柔比星脂质体;游离药物盐酸盐是指阿霉素盐酸盐。具体实施方式为了便于理解本发明,下面将参照实施例对本发明进行更全面的描述,以下给出了本发明的较佳实施例。但是,本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。除非另有定义,本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。本发明中的术语“细胞微囊microvesicles”是指:一种由脂质膜双分子层构成的粒径在30~300nm的内含RNA、DNA、蛋白质或脂质分子的生物囊泡,以细胞胞吐或自由脱落的形式被释放,进入体液中。本发明一实施方案中提供了一种细胞微囊的制备方法,包括如下步骤:1培养免疫细胞,取细胞上清液;2将步骤1所述的细胞上清液离心以去除细胞及细胞碎片,取上清液;3将步骤2所述的上清液离心以去除凋亡小体,取上清液;4将步骤3所述的上清液离心,取沉淀,即得;步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2000-3000g,离心时间为40-100min。该制备方法操作非常简单,可获得生物活性好、结构完整、纯度高的细胞微囊。该制备方法进一步优选地离心条件为差速离心法,即第一次离心的离心力小于第二次离心的离心力,第二次离心的离心力小于第三次离心的离心力。其中,步骤2的离心条件进一步优选为:离心力为400-600g,离心时间为5-80min;更优选为:离心力为450-550g,离心时间为8-15min;步骤3的离心条件进一步优选为:离心力为2400-2600g,离心时间为50-90min;更优选为:离心力为2400-2600g,离心时间为50-70min;步骤4的离心条件进一步优选为:离心力为8000-20000g,离心时间为40-80min;更优选为:离心力为9000-11000g,离心时间为50-70min。在该离心条件下能更充分地去除细胞及细胞碎片以及凋亡小体,获得粒径更均一、纯度和收率更高、活性更好的细胞微囊,进而使制备得到的载药微囊具有更好的抗肿瘤效果。通过上述方法提取的细胞微囊可以用现有的常规方法进行纯化,以获得纯度更高的细胞微囊。本发明中优选地纯化方法如下:将步骤4所述沉淀用无菌生理盐水重悬,离心,取沉淀,即得。其中,离心的条件优选为:离心力为8000-20000g,离心时间为40-80min;更优选为:9000-11000g,离心时间为50-70min。在该离心条件下纯化的细胞微囊具有更高的纯度,进而使制备得到的载药微囊具有更好的抗肿瘤效果。本发明的制备方法中,培养时间优选为12-72小时,更优选为40-56小时。在该时间范围内,可以获得更高产率的细胞微囊。本发明的制备方法中,培养免疫细胞的其它条件可以是在常规条件下进行,比如:无菌无毒环境,35℃-37℃,95%的空气和5%的CO2。本发明的制备方法中,培养免疫细胞的培养基可以是现有的常规培养基,比如:含10%血清的完全培养基。本发明的制备方法,用于分泌细胞微囊的免疫细胞选自但不限于以下细胞:巨噬细胞、B细胞、树突状细胞、T细胞。本发明还提供了由上述制备方法制备得到的细胞微囊。该细胞微囊具有较高的生物活性,可负载脂溶性抗癌药物制备成载有抗癌药物的细胞微囊,用于治疗癌症疾病,治疗效果佳,动物体内治疗效果明显优于商品化脂质体和同源外泌体。所述载有抗癌药物的细胞微囊,其药物适用范围广泛,脂溶性的药物均可包载,尤其可以是阿霉素、紫杉醇和卡莫司汀中的至少一种。其中,所述细胞微囊和所述脂溶性抗癌药物的配比优选为8-20mg:1μmol,以此配比制备的载药微囊具有更好的抗肿瘤效果,并且药物包封率高。该配比更优选为9-12mg:1μmol。本发明还提供了所述载有抗癌药物的细胞微囊的制备方法,包括如下步骤:将所述细胞微囊的溶液和所述脂溶性抗癌药物的溶液在温度为30-40℃的条件下静置孵育8-28小时。该孵育条件进一步优选为:温度为35-39℃,时间为12-24小时更优选为12-18小时。该条件下获得的载有抗癌药物的细胞微囊具有更高的药物包封率,和更低的药物泄露量,进而具有更好的抗肿瘤效果。进一步地,上述载有抗癌药物的细胞微囊的制备方法中,细胞微囊的溶液浓度优选为5-20mgmL,更优选为8-12mgmL,脂溶性抗癌药物的溶液浓度优选为0.5-2mmolmL,更优选为0.8-1.2mmolmL。本发明制备得到了具有优良生物活性、结构完整、纯度高、粒径均一的细胞微囊,其制备方法非常简单,仅对免疫细胞的培养上清液通过简单的离心,并且控制一定的离心条件即可获得,操作条件温和、可控,可避免机械损伤造成的人为干扰,可获得完整自然状态的细胞微囊。将所得细胞微囊负载脂溶性的抗癌药物,用于预防或者治疗癌症疾病,效果很好。本发明负载抗癌药物的细胞微囊的制备方法非常简单,利用脂溶性物质间的静电疏水作用和微囊内外渗透压差异,将微囊与药物在一定条件下孵育即可将药物负载于微囊内,得到载药的细胞微囊产品,该方法制备过程短,成本低,药物的适用范围广泛,脂溶性的药物均可包载,并且稳定性好,载药率高,药物包封率高。负载药物后微囊载体仍保留自身生物特性,生物相容性好,便于高效靶向递送抗癌药物至肿瘤部位,使得负载抗癌药物的细胞微囊治疗靶向性和治疗效果好,动物体内治疗效果明显优于商品化脂质体和同源外泌体,并且治疗靶向性比商品化脂质体更精准,毒副作用更低。以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。实施例1负载阿霉素的巨噬细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h即得负载阿霉素的细胞微囊。实施例2负载紫杉醇的巨噬细胞来源的细胞微囊一、紫杉醇原液的配置称取853.91μg紫杉醇粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的紫杉醇溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的药物步骤一制备的紫杉醇溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载卡紫杉醇的细胞微囊。实施例3负载卡莫司汀的巨噬细胞来源的细胞微囊一、卡莫司汀原液的配置。称取214.05μg卡莫司汀粉末溶于1mLDMSO中,配成1mM的终浓度。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的卡莫司汀溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载卡莫司汀的细胞微囊。实施例4负载阿霉素的B细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、微囊的提取与纯化在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养B细胞A202天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载阿霉素的细胞微囊。实施例5负载阿霉素的巨噬细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1.5h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载阿霉素的细胞微囊。实施例6负载阿霉素的巨噬细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入0.5μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载阿霉素的细胞微囊。对比例1负载阿霉素的巨噬细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载阿霉素的细胞微囊。对比例2负载阿霉素的巨噬细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心30min,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载阿霉素的细胞微囊。对比例3负载阿霉素的巨噬细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1.5μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h,即得负载阿霉素的细胞微囊。对比例4负载阿霉素的巨噬细胞来源的细胞微囊一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液。二、细胞微囊的制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、沉淀微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;4、纯化微囊:步骤3中沉淀用无菌生理盐水重悬,10000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞微囊。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞微囊的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞微囊溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的阿霉素溶液。在20℃、5%CO2的培养箱中静置孵育2小时,即得负载阿霉素的细胞微囊。实施例7细胞微囊形态的鉴定1将实施例1制备的5μL微囊悬液加到Formvar-carbon载样铜网上。每份exosome样品准备2-3个铜网。盖上盖子,在干燥环境中让Formvar膜吸收20min;2将100μLPBS加到封口膜上。用镊子将铜网Formvar膜面朝下放在PBS液滴上清洗;3将铜网放在50μL1%戊二醛液滴上5min;4将铜网放在100μL超纯水中洗涤2min;5将铜网放在50μL草酸双氧铀液滴上5min;6将铜网放在50μL甲基纤维素-UA液滴上10min;7用不锈钢环移开铜网,在滤纸上轻轻吸去多余液体,留下一薄层甲基纤维素膜;8铜网仍在不锈钢环上,空气中干燥5到10min后再置于透射电镜下观察形态。结果如图1所示:微囊在透射电镜下呈杯状结构,形态与外泌体一致,均为典型囊泡形态。实施例8细胞微囊粒径大小的鉴定将实施例1制备的微囊悬液注入纳米颗粒跟踪分析仪马尔文公司中,观察颗粒在溶液中的布朗运动,测定粒径大小。以同样的方法测试外泌体的粒径。结果如附图2所示:微囊的平均粒径大小为130.3±1.9nm,外泌体的平均粒径大小为130.5nm,两者粒径大小差异不大。用同样的方法检测实施例2-5,对比例1-2的载药细胞微囊的粒径,其结果如表1所示:实施例1、实施例2、实施例3、实施例4、实施例5制备的微囊的粒径大小及粒径分散程度相似。相较于对比例1和对比例2,实施例1具有更小的粒径和更均一的粒径分布,结合肿瘤的EPRenhancedpermeabilityandretentioneffect效应,更小粒径的颗粒更容易渗透进入肿瘤部位,因此优选粒径更小更均一的方案。其中,实施例1的粒径分散程度与实施例5的相似,但是粒径比实施例5的粒径更小,并且实施例1在去除凋亡小体时的离心时间更短,实施例1的制备方法具有更低的成本。表1载药细胞微囊粒径nm实施例1130.3±1.9实施例2135.1±2.0实施例3129.8±1.5实施例4142.1±2.4实施例5181.8±2.4对比例1239.5±17.3对比例2232.5±16.4实施例9载药细胞微囊的药物包封率1、配制阿霉素浓度为100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、0.1nM、0.01nM的巨噬细胞载药制剂溶液。利用紫外可见光谱仪购自日本岛津公司在190~700nm范围内对溶液进行波长扫描,然后在溶液吸收峰481nm处测定各溶液的吸光度,得到标准曲线为A=0.0109+0.0261c,线性相关系数R2=0.9999,其中A为吸光度,c为阿霉素浓度nM。2、将实施例1新制备的负载阿霉素的细胞微囊悬液在500g转速下离心3min,收集沉淀重悬于500μL二甲基亚砜中并在481nm处测紫外。根据阿霉素的标准曲线算出未包载的游离阿霉素的含量。包封率=1-[M游离阿霉素10μmol]。以同样的方法测试负载阿霉素的外泌体的包封率。结果如图3所示。其中,负载阿霉素的外泌体的制备方法如下:一、脂溶性阿霉素的制备1、称量20mg阿霉素盐酸盐于100毫升圆底烧瓶中,加入20ml二氯甲烷充分溶解。2、按照摩尔比1:3加入14.3ml的三乙胺,25℃搅拌过夜。3、24h后收集产物,置于透析袋中透析,直至透析液澄清无色。4、收集透析袋中物质,将其冻干,得到深红色阿霉素粉末。5、将543.52μg阿霉素粉末溶于1mLDMSO中,配成终浓度为1mM的阿霉素溶液终浓度。二、外泌体的提取与纯化制备在95%的空气和5%的CO2细胞培养箱中,无菌无毒环境下,35℃-37℃培养温度,含10%血清的完全培养基中持续培养巨噬细胞RAW264.72天以上,收取细胞上清液进行微囊提取与纯化,实验步骤如下:1、去除细胞及细胞碎片:将上述细胞培养上清液在500g转速下离心10min,弃去沉淀,取上清液;2、去除凋亡小体:步骤1中上清液在2500g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;3、去除微囊:步骤2中上清液在10000g转速下离心1h,弃去沉淀,取上清液;4、沉淀外泌体:步骤3中上清液在110000g转速下离心1h,弃去上清液,获取沉淀;5、纯化外泌体:步骤4中沉淀用无菌生理盐水重选悬,110000g转速,离心1h,弃去上清液,取沉淀,即得所述细胞外泌体。获得的沉淀用无菌生理盐水重悬,保存于-80℃冰箱中,以备后续实验使用。三、负载药物的细胞外泌体载体的制备将步骤二制备的1.0mL浓度为10mgmL的细胞外泌体溶液置于无菌管中,每管加入1μmol的步骤一制备的阿霉素溶液药物。在37℃、5%CO2的培养箱中静置孵育16h后,即可得负载阿霉素的外泌体参照本实施例的方法制作其它药物的标准曲线,并且测试实施例2-6、对比例1-4的药物包封率。结果如表2所示:实施例1-6均具有很高的药物包封率。其中,实施例1和实施例6相比,实施例1尽管药物包封率略低,但由于实施例1的投药量是实施例6的两倍,因此实施例1的实际载药量是实施例6的近两倍,因此,实施例1对药物的利用率及载体的利用率更高,实施例1的方法更佳。与对比例3和对比例4相比,实施例1的包封率远好于对比例3和对比例4,说明,细胞微囊和药物的配比以及孵育条件均对包封率有很大影响,以实施例1的配比和孵育条件可大大提高载药细胞微囊的药物包封率。表2载药细胞微囊包封率%实施例198.12±0.393实施例297.63±0.653实施例398.41±0.275实施例498.12±0.512实施例598.44±0.264实施例698.92±0.108对比例196.82±0.633对比例297.12±0.422对比例573.04±0.912对比例653.35±1.670实施例10载药细胞微囊的药物泄露量1、配制阿霉素浓度为100μM、10μM、1μM、100nM、10nM、0.1nM、0.01nM的巨噬细胞载药制剂溶液。利用紫外可见光谱仪购自日本岛津公司在190~700nm范围内对溶液进行波长扫描,然后在溶液吸收峰481nm处测定各溶液的吸光度,得到标准曲线为A=0.0109+0.0261c,线性相关系数R2=0.9999,其中A为吸光度,c为阿霉素浓度nM。2、将实施例1新制备的负载阿霉素的细胞微囊和参照实施例7的方法新制备的负载阿霉素的外泌体,分别在0min,4h,8h,12h,24h,36h,48h,72h,参照实施例7中的方法测试游离阿霉素的含量,即为相应时间点的阿霉素的释放量。结果如图4所示:微囊的72小时累计泄露量为28%,显著低于外泌体的72小时累计泄露量为62%,说明微囊制剂的稳定性优于外泌体制剂,在体内可实现缓释长效的作用。参照本实施例的方法测试实施例2-6、对比例1-4的72小时累计药物泄露量。结果如表3所示:实施例1-6的药物泄露量均较低。其中,实施例1与对比例1-2相比,药物泄露量更低,说明去除凋亡小体时的离心时间不仅仅影响所得微囊的粒径大小,还对所得载药微囊的药物泄露量有影响,实施例1的离心时间更佳。实施例1与对比例3相比,药物泄露量更低,说明微囊与药物的配比也对载药微囊的药物泄露量有影响,实施例1的配比有利于降低载药微囊的药物泄露量。实施例1与对比例4相比,药物泄露量更低,说明制备载药微囊的孵育条件对所得载药微囊的药物泄露量有很大影响,实施例1的制备方法中的孵育条件更佳,可以大大降低所得载药微囊的药物泄露量。表3载药细胞微囊药物泄露量%实施例128%实施例227%实施例328.2%实施例428%实施例528.4%实施例627%对比例138%对比例235%对比例340%对比例475%实施例11载药细胞微囊的体外抗肿瘤效果本实施例考察了实施例1制备的负载阿霉素的细胞微囊,实施例9制备负载阿霉素的外泌体,商品化脂质体和游离阿霉素原药在体外的抗肿瘤效果。方法如下:1、收集对数期卵巢癌细胞,调整细胞悬液浓度,种植到96孔板,每孔加入100μL,铺板使待测细胞的密度为5000个每孔;2、将96孔板置于细胞培养箱中培养24h后,分别加入各组测试药物分别为负载阿霉素的细胞微囊、负载阿霉素的外泌体、负载阿霉素的脂质体购自石药集团的盐酸多柔比星脂质体、游离的阿霉素盐酸盐,放回培养箱接着培养24h;3、24h后,每孔加入20μLMTT溶液5mgml,即0.5%MTT,继续培养4h;4、4小时后,每孔加入150μL二甲基亚砜,置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD值490nm处测量各孔的吸光值。计算肿瘤细胞的存活率。结果如图5所示:负载阿霉素的微囊抑制肿瘤细胞的IC50显著低于外泌体和商品化脂质体,说明负载阿霉素的微囊的体外抗肿瘤效果显著优于负载阿霉素的外泌体和负载阿霉素的商品化脂质体。实施例12载药细胞微囊的体外抗侵袭效果本实施例考察了实施例1制备的负载阿霉素的细胞微囊和实施例9制备负载阿霉素的外泌体在体外的抗侵袭效果。方法如下:1、采用xCELLigence细胞功能分析仪和CIM-Plate16检测板进行肿瘤细胞侵袭试验。此检测板由3部分组成:上盖、上室和下室。上室由16孔组成,孔底部装配有微孔孔径为8μm的PET微孔膜,镀金电极设计在微孔膜的下底表面。下室同样由16孔组成。加入165μL含血清的培养基至下室,将上室和下室组装一起。组装好的CIM-Plate16放入xCELLigence细胞功能分析仪中并测定背景阻抗值。2、用细胞培养基配置体积浓度为25%的matrigel溶液,上室每孔加入30μL的matrigel溶液。随后,CIM-Plate16放入37℃培养箱中静置平衡1h,待胶体凝固后进行下一步操作。3、消化处于对数生长期的卵巢癌细胞,调整细胞浓度为105cellsmL,然后每孔加入100μL于孔板上室,室温静置4h。4、4h后,待肿瘤细胞稳定分布在matrigel中,吸取14.4μL配置好的10×高浓度待测药液加在上室,并立即放入细胞功能分析仪中。设定400次扫描程序,每5min收集一次数据总共33.3小时。程序终止后即可获得肿瘤细胞侵袭的实时动力学曲线。细胞阻抗值的升高与粘附在下腔的侵袭肿瘤细胞数量呈正相关。结果如附图6所示:负载阿霉素的微囊的体外抗侵袭的效果显著优于负载阿霉素的外泌体和负载阿霉素的商品化脂质体。实施例13载药细胞微囊的体内肿瘤靶向性对比研究1、收集处于对数生长期的卵巢癌细胞SKOV3细胞,经裸鼠购自中山大学动物中心腹部注射SKOV3卵巢癌细胞1×107只,建立荷瘤鼠模型。2、造模两周后,将荷瘤裸鼠9只随机均分为三组:微囊载药制剂组、外泌体载药制剂组和市售的药品阿霉素脂质体组。按照600μg囊泡加入10μL标记工作液DiD购自美国Sigma-Aldrich公司的比例向待标记细胞中加入标记工作液,37℃孵育15分钟。标记后,囊泡实施例1制备的负载阿霉素的细胞微囊、实施例9制备的负载阿霉素的外泌体和市售的药品阿霉素脂质体购自石药集团的盐酸多柔比星脂质体以腹腔注射的方式注射至荷瘤裸鼠0.2mL只。3、24小时后,处死9只裸鼠,取动物的心、肺脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、子宫卵巢在小动物活体成像仪购自德国NightOWL公司拍照成像,并对药物在组织中的分布进行定量分析。结果如图7所示:负载阿霉素的细胞微囊在卵巢癌晚期腹腔扩散小鼠模型的肿瘤靶向效果显著优于市售的药品阿霉素脂质体。实施例14载药细胞微囊的体内抗肿瘤治疗效果1、收集处于对数生长期的卵巢癌细胞SKOV3细胞,经裸鼠购自中山大学动物中心腹部注射SKOV3卵巢癌细胞1×107只,建立荷瘤鼠模型。2、造模一周后,将荷瘤裸鼠30只随机均分为五组:微囊载药制剂组、外泌体载药制剂组、市售的药品阿霉素脂质体组、游离药物组和空白给药组。微囊载药制剂组实施例1制备的负载阿霉素的细胞微囊、外泌体载药制剂组实施例9制备的负载阿霉素的外泌体、市售的药品阿霉素脂质体组购自石药集团的盐酸多柔比星脂质体和游离药物组以阿霉素给药量为0.2mgkg的剂量腹腔给药;空白给药组注射200μL的生理盐水。3、给药周期为21天,每三天给一次药。之后,每天观察各组裸鼠状态,记录其死亡时间。结果如图8所示:负载阿霉素的细胞微囊的体内抗肿瘤效果显著优于外泌体药物制剂和商品化脂质体,显著延长了肿瘤鼠的生存期,相对生理盐水组中位数生存期提高316.4%。以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求:1.一种细胞微囊的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:1培养免疫细胞,取细胞上清液;2将步骤1所述的细胞上清液离心以去除细胞及细胞碎片,取上清液;3将步骤2所述的上清液离心以去除凋亡小体,取上清液;4将步骤3所述的上清液离心,取沉淀,即得;或者包括如下步骤:1培养免疫细胞,取细胞上清液;2将步骤1所述的细胞上清液离心以去除细胞及细胞碎片,取上清液;3将步骤2所述的上清液离心以去除凋亡小体,取上清液;4将步骤3所述的上清液离心,取沉淀;5将步骤4所述沉淀用无菌生理盐水重悬,离心,取沉淀,即得;步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2000-3000g,离心时间为40-100min。2.根据权利要求1所述的细胞微囊的制备方法,其特征在于,步骤2中所述离心的条件包括:离心力为400-600g,离心时间为5-80min;及或,步骤3中所述离心的条件包括:离心力为2400-2600g,离心时间为50-70min;及或,步骤4中所述离心的条件包括:离心力为8000-20000g,离心时间为40-80min;及或,步骤5中所述离心的条件包括:离心力为8000-20000g,离心时间为40-80min。3.根据权利要求1-2任一项所述的细胞微囊的制备方法,其特征在于,所述培养的时间为12-72小时。4.一种细胞微囊,其特征在于,由权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到。5.一种载有抗癌药物的细胞微囊,其特征在于,由权利要求4所述的细胞微囊和脂溶性抗癌药物制备得到。6.根据权利要求5所述的载有抗癌药物的细胞微囊,其特征在于,所述脂溶性抗癌药物选自:阿霉素、紫杉醇和卡莫司汀中的至少一种。7.根据权利要求5或者6所述的载有抗癌药物的细胞微囊,其特征在于,所述细胞微囊和所述脂溶性抗癌药物的配比为8-20mg:1μmol。8.一种权利要求5-7任一项所述的载有抗癌药物的细胞微囊的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:将所述细胞微囊的溶液和所述脂溶性抗癌药物的溶液在温度为30-40℃的条件下静置孵育8-28小时。9.根据权利要求8所述的载有抗癌药物的细胞微囊的制备方法,其特征在于,所述细胞微囊的溶液浓度为5-20mgmL;及或,所述脂溶性抗癌药物的溶液浓度为0.5-2mmolmL。10.权利要求5-7任一项的载有抗癌药物的细胞微囊在制备预防和或治疗肿瘤的药物中的应用。

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