申请/专利权人：重庆华邦制药有限公司

申请日：2018-10-30

公开（公告）日：2020-11-06

公开（公告）号：CN109406695B

主分类号：G01N30/34(20060101)

分类号：G01N30/34(20060101);G01N30/60(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.06#授权;2019.03.26#实质审查的生效;2019.03.01#公开

摘要：本发明属于分析化学领域，具体涉及一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法，其特征是采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇‑水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇‑水的体积比为20‑30:70‑80，用于同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质。本方法可以更好的分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质20S，和或杂质24R，和或杂质7Z，和或杂质14R，和或杂质22Z，避免了干扰，弥补了因现有质量标准和文献均没有提供这一检测方法的空白，且具有简单、快速、准确度高等优点，对帕立骨化醇注射液的质量控制能提供技术支持。

主权项：1.一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，以流动相A和流动相B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；15min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为5:95；46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；以甲醇-水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇-水的体积比为20-30:70-80，所述异构体杂质为杂质20S，和或杂质24R，和或杂质7Z，和或杂质14R，和或杂质22Z；所述杂质20S、杂质24R、杂质7Z、杂质14R、杂质22Z的结构式如下所示：

全文数据：一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法技术领域本发明属于分析化学领域，具体涉及高效液相色谱法、流动相及一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法。背景技术帕立骨化醇是一种化学物质，分子式是C27H44O3。帕立骨化醇是一种人工合成的具有生物活性的维生素D类似物，对骨化三醇侧链D2和A环19－nor进行修饰，主要用于治疗治疗慢性肾脏病。帕立骨化醇是由美国雅培公司Abbott开发的选择性的、第3代维生素D受体激活剂,能够选择性激活维生素D受体VDR以及选择性地上调甲状腺内的钙敏感性受体CaSR,更高效地抑制尿毒症患者PTH合成和分泌,同时更少发生高血钙症等不良反应。帕立骨化醇注射液商品名Zempalar于1998年上市，用于治疗成人肾透析患者的继发性甲状腺功能亢进症。临床前研究及体外试验研究显示，帕立骨化醇需通过与维生素D受体VDR结合，引发维生素D反应通路的选择活化产生生物学作用。本品用于治疗接受血液透析的慢性肾功能衰竭患者的继发性甲状旁腺功能亢进。制得的帕立骨化醇注射液中含有一些异构体杂质，比如异构体杂质20S、7Z、24R、14R、22Z，这些帕立骨化醇注射液中的异构体杂质会影响对帕立骨化醇注射液的质量控制，从而影响帕立骨化醇注射液的治疗效果。鉴于现有的帕立骨化醇注射液的质量标准JX20060114并没有提出相关检测异构体杂质的分离分析方法，且也没有任何相关的文献报道。因此，寻找一种能简单、快速、准确的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及其异构体杂质的高效液相色谱法很有必要。发明内容有鉴于此，本发明的目的之一是提供一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法，这种方法提高了分离分析的效率，准确的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及其异构体杂质。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇-水的体积比为20-30:70-80，所述异构体杂质为杂质20S，和或杂质24R，和或杂质7Z，和或杂质14R，和或杂质22Z；所述杂质20S、杂质24R、杂质7Z、杂质14R、杂质22Z的结构式如下所示：优选的，所述流动相甲醇-水的体积比为25:75。进一步的，所述流动相进行洗脱的流速为0.5-1.5mlmin。优选的，所述流动相进行洗脱的流速为1.0mlmin。进一步的，所述色谱柱的柱温为25℃-40℃。优选的，所述色谱柱的柱温为35℃。更进一步的，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；15min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为5:95；46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70。其次，本发明的目的之二是提供一种高效液相色谱法，该高效液相色谱法适用于同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：所述高效液相色谱法分离分析过程中采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇-水的体积比为20-30:70-80。优选的，所述流动相甲醇-水的体积比为25:75。进一步的，所述流动相进行洗脱的流速为0.5-1.5mlmin。优选的，所述流动相进行洗脱的流速为1.0mlmin。进一步的，所述色谱柱的柱温为25℃-40℃。优选的，所述色谱柱的柱温为35℃。更进一步的，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；15min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为5:95；46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70。最后，本发明的目的之三是提供一种高效液相色谱法中使用的流动相，使用含有此流动相的高效液相色谱法来同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质，能够提高分离分析的效率，并有利于对帕立骨化醇注射液的质量控制。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：所述流动相由以甲醇-水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇-水的体积比为20-30:70-80。所述流动相甲醇-水的体积比为25:75。进一步的，所述流动相进行洗脱的流速为0.5-1.5mlmin。优选的，所述流动相进行洗脱的流速为1.0mlmin。进一步的，所述色谱柱的柱温为25℃-40℃。优选的，所述色谱柱的柱温为35℃。更进一步的，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；15min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为5:95；46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70。本发明的有益效果在于：本发明提供了一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法，利用本发明提供的方法可以更好的分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质20S，和或杂质24R，和或杂质7Z，和或杂质14R，和或杂质22Z，避免了干扰，弥补了因现有质量标准和文献均没有提供这一检测方法的空白。且本发明所提供的方法具有简单、快速、准确度高等优点，对帕立骨化醇注射液的质量控制能提供技术支持。附图说明图1为实施例1的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图2为实施例2的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图3为实施例3的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图4为实施例4的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图5为实施例5的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图6为对比实施例1的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图7为对比实施例2的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图8为对比实施例3的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图9为对比实施例4的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图10为对比实施例5的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图11为对比实施例6的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。图12为对比实施例7的同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的色谱图。具体实施方式所举实施例是为了更好地对本发明进行说明，但并不是本发明的内容仅局限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。实施例1同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质1、对照品溶液：避光操作。取本品帕立骨化醇溶液，作为供试品溶液；精密量取帕立骨化醇对照品贮备液适量，用50％乙醇定量稀释制成每1ml中约含帕立骨化醇50ng的溶液，作为对照溶液；2、灵敏度溶液：精密量取对照品溶液适量，用50％乙醇定量稀释制成每1ml约含帕立骨化醇5ng的溶液，作为灵敏度溶液；3、系统适用性溶液：分别精密量取帕立骨化醇对照品贮备液及杂质20S、7Z、24R、14R、22Z对照品贮备液各适量，用50％乙醇稀释制成每1ml中约含帕立骨化醇5ug及各杂质50ng的混合溶液，作为系统适用性溶液。4、色谱条件：照高效液相色谱法中国药典2015年版通则0512测定。以十八烷基键和的硅胶为填充剂月旭C18柱，250mm×4.6mm，5μm或性能相当的色谱柱，柱温为35℃，流速为1.0mlmin，检测波长为252nm，以甲醇:水25:75为流动相A，甲醇为流动相B，按表一进行梯度洗脱。表一.色谱条件分别取灵敏度溶液和系统适用性溶液100μl注入液相色谱仪，在灵敏度溶液的色谱图中，主成分峰高信噪比应不得小于10，在系统适用性溶液的色谱图中，出峰顺序依次为20S、帕立骨化醇、7Z、24R、14R和22Z，帕立骨化醇与20S和7Z之间的分离度均应符合要求。再精密量取供试品溶液与对照溶液各100μl，分别注入液相色谱仪，供试品溶液的色谱图中，杂质20S、7Z、24R、14R、22Z均不得过1.0％，供试品溶液色谱图中任何小于0.1％的峰可忽略不计，分离度结果如表二所示，色谱图检测结果如图1所示。表二.分离度实施例2同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表三的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图2所示，各杂质分离度均大于1.5。表三.色谱条件实施例3同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表四的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图3所示，各杂质分离度均大于1.5。表四.色谱条件实施例4同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表五的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图4所示，各杂质分离度均大于1.5。表五.色谱条件实施例5同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表六的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图5所示，各杂质分离度均大于1.5。表六.色谱条件对比实施例1同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表七的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图6所示，各杂质分离度尚可，杂质14R与22Z分离度为1.47略低于1.5。表七.色谱条件对比实施例2同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表八的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图7所示，7Z与24R分离度为1.38，杂质14R与22Z分离度为1.24均低于1.5。表八.色谱条件对比实施例3同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表九的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图8所示，7Z与24R分离度为1.41，杂质14R与22Z分离度为1.27均低于1.5。表九.色谱条件对比实施例4同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表十的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图9所示，各杂质出峰太晚，不可行。表十.色谱条件对比实施例5同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表十一的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图10所示，7Z与24R分离度为1.45，杂质14R与22Z分离度为1.29均低于1.5。表十一.色谱条件对比实施例6同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表十二的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图11所示，各杂质不能有效分离。表十二.色谱条件对比实施例7同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质对照品溶液、灵敏度溶液和系统适用性溶液的准备与实施例1的步骤1-3相同，按照表十三的色谱条件进行分离分析检测。色谱图结果如图12所示，各杂质不能有效分离。表十三.色谱条件最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

权利要求：1.一种同时分离分析帕立骨化醇注射液中帕立骨化醇及异构体杂质的高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法分析过程中采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇-水的体积比为20-30:70-80，所述异构体杂质为杂质20S，和或杂质24R，和或杂质7Z，和或杂质14R，和或杂质22Z；所述杂质20S、杂质24R、杂质7Z、杂质14R、杂质22Z的结构式如下所示：2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述流动相甲醇-水的体积比为25:75。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述流动相进行洗脱的流速为0.5-1.5mlmin。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述流动相进行洗脱的流速为1.0mlmin。5.根据权利要求1所述的方法,其特征在于，所述色谱柱的柱温为25℃-40℃。6.根据权利要求5所述的方法,其特征在于，所述色谱柱的柱温为35℃。7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；15min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为5:95；46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70。8.一种高效液相色谱法，其特征在于，所述高效液相色谱法分离分析过程中采用的色谱柱是以十八烷基键合硅胶为填充剂，以甲醇-水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇-水的体积比为20-30:70-80。9.据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述流动相甲醇-水的体积比为25:75。10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述流动相进行洗脱的流速为0.5-1.5mlmin。11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述流动相进行洗脱的流速为1.0mlmin。12.根据权利要求8所述的方法,其特征在于，所述色谱柱的柱温为25℃-40℃。13.根据权利要求12所述的方法,其特征在于，所述色谱柱的柱温为35℃。14.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；15min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为5:95；46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70。15.一种高效液相色谱法中使用的流动相，其特征在于，所述流动相由以甲醇-水为流动相A,甲醇为流动相B进行洗脱，所述流动相甲醇-水的体积比为20-30:70-80。16.据权利要求15所述的流动相，其特征在于，所述流动相甲醇-水的体积比为25:75。17.根据权利要求15或16所述的流动相，其特征在于，所述流动相进行洗脱的流速为0.5-1.5mlmin。18.根据权利要求17所述的流动相，其特征在于，所述流动相进行洗脱的流速为1.0mlmin。19.根据权利要求15所述的流动相,其特征在于，所述色谱柱的柱温为25℃-40℃。20.根据权利要求19所述的流动相,其特征在于，所述色谱柱的柱温为35℃。21.根据权利要求15所述的方法，其特征在于，以溶液A和有机溶剂B按一定比例混合为流动相进行梯度洗脱，所述梯度比例为：0min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；15min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；45min，溶液A与有机溶剂B的体积比为5:95；46min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70；55min，溶液A与有机溶剂B的体积比为30:70。

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