申请/专利权人：天境生物科技(上海)有限公司

申请日：2016-06-13

公开（公告）日：2020-11-17

公开（公告）号：CN107488229B

主分类号：C07K16/28(20060101)

分类号：C07K16/28(20060101);C07K16/46(20060101);C12N15/13(20060101);A61K39/395(20060101);G01N33/68(20060101);G01N33/577(20060101);A61P35/00(20060101);A61P35/02(20060101);A61P31/14(20060101);A61P31/20(20060101);A61P31/18(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.17#授权;2018.03.30#专利申请权的转移;2018.01.12#实质审查的生效;2017.12.19#公开

摘要：本发明公开了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人PD‑L1蛋白，该抗体或其抗原结合部分包含分别如SEQIDNO.1、2和3所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列及分别如SEQIDNO.4、5和6所示的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列。本发明还公开了上述单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗PD‑L1相关性疾病的药物中的用途。本发明的PD‑L1抗体，能高效特异地结合人PD‑L1分子，通过有效阻断PD‑L1与其配体PD‑1及CD80的结合，能有效促进人的免疫反应，并能促进人的免疫系统对肿瘤的杀伤作用，具有很好的应用前景。

主权项：1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人PD-L1蛋白，该抗体或其抗原结合部分包含分别如SEQIDNO.1、2和3所示的重链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列及分别如SEQIDNO.4、5和6所示的轻链可变区CDR1、CDR2和CDR3序列。

全文数据：PD-L1抗体及其用途技术领域[0001]本发明涉及基因工程抗体技术领域，尤其涉及一种抗PD-LU程序性死亡受体-配体1抗体及其用途。背景技术[0002]双信号理论是调控免疫反应的重要理论。T细胞的激活除了依靠T细胞受体刺激信号以外还需要通过CD28受体家族提供的第二信号来促进或者下调T细胞反应。CD28受体家族包括义028，：1'1^-4，^03，？0-1，和81'1^等分子。其中〇28和1〇3这两种受体是用来传递共刺激信号来激活免疫反应肋丨1^€6丨1.1999恥丨11代397:263-266;版1186116丨1·1980Immunogenics10:247-260，CTLA-4，PD-1和BTLA分子用来传递共抑制信号来抑制免疫反应。PD-lProgrammedcelldeath1程序性死亡受体1，0279,在活化的T细胞而不是静息状态下的T细胞中表达。PD-I分子有两个配体:PD-Ll和TO-L2。在其和配体结合时能够给T细胞传递抑制信号，从而抑制细胞的增殖并减少细胞因子的分泌例如IL-2和IFNγ等Nishimuraetal.1999Immunity11:141；Nishimuraetal.2001Science291:319；Chemnitzetal.2004J.Immunol·173:945JD-Ll分子能够与T细胞表面的]3D-I分子或者B7-1CD80分子结合并抑制T细胞的激活Butteetal.2007Immunity27:lll。[0003]PD-Ll通常在静息状态下的淋巴细胞如B细胞、树突状细胞、巨噬细胞以及T细胞上低表达，然而在这些淋巴细胞活化以后会上调表达PD-LlJD-Ll也会在非淋巴细胞上表达例如：内皮细胞、心肌细胞、肺细胞、胰腺细胞、肌肉细胞、角质细胞等细胞。在非淋巴细胞上表达PD-Ll表明该分子在控制自身反应性T细胞、B细胞以及骨髓细胞中起到重要的作用。PD-Ll在上皮以及内皮细胞上的表达主要由IFNy诱导。除此之外，PD-Ll还在各种人癌症细胞上高表达Dongetal2002Nat.Med8:787-9并且I3D-Ll的表达与肿瘤的不良预后有着密切关系。PD-Ll与ro-i结合致使肿瘤沁润淋巴细胞的活性受到抑制并导致了肿瘤的免疫逃逸（Dongetal.2003J.Mol.Med.81:281-7;Blanketal.2005CancerTmmunol.Immunother.54:307-314；Konishietal.2004Clin.CancerRes.10:5094-100。抑制PD-I与PD-Ll的相互作用能够恢复这种肿瘤的免疫抑制现象（Iwaietal.2002Proc.Nat7.Acad.SciUSA99:12293_7;Brownetal.2003J.Immunol.170:1257-66。除此之外，病毒感染也能导致宿主细胞上H-L1的高表达。因此，PD-Ll的阻断抗体能够被用于抑制肿瘤生长及促进宿主对病毒感染的有效控制。[0004]目前，FDA于2016年5月批准罗氏atezolizumabMPDL3280APD-Ll抗体作为二线药物用于治疗一种叫做urothelialcarcinoma的最常见晚期膀胱癌。但是由于进口大分子药物对于病人来说需要花费高昂的费用，因此，研发新的抗ro-Li单克隆抗体，减少病人负担，降低治疗费用是一个亟待解决的问题。发明内容[0005]本发明要解决目前临床上缺乏价格优惠、效果好的ro-Ll抗体的技术问题，提供一种新的ro-Li抗体，该ro-Li抗体能高效特异地结合人ro-Li分子，并能够促进人的免疫系统对肿瘤的杀伤作用，同时还能减轻病人的治疗费用负担。[0006]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现：[0007]在本发明的一个方面，提供了一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人ro-Ll蛋白，该抗体或其抗原结合部分包含分别如SEQIDNO.1、2和3所示的重链可变区CDR1、⑶R2和⑶R3序列及分别如SEQIDN0.4、5和6所示的轻链可变区⑶R1、CDR2和⑶R3序列。[0008]在本发明中，所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。因而，这个术语涵盖了与之同源的抗体片段、衍生物以及抗体的功能等同物和同源物，也包括含有抗原结合结构域的任何多肽，无论是天然的还是合成产生的。抗体的实例是免疫球蛋白亚型（如IgG，IgE，IgM，IgD和IgA及其亚型亚类;也可以是包含抗原结合结构域的片段如?813、8〇?¥、？¥、^13或?1，或者双链抗体1丨31301丨68。融合至另一多肽的、包含抗原结合结构域的嵌合体分子或者等同物也包括在其中。嵌合抗体的克隆与表达在EP·A-0120694和EP·A-0125023中有所描述。[0009]本发明所述单克隆抗体可以是单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。[0010]抗体可以通过许多方式修饰，可用DNA重组技术来产生保留原来抗体特异性的其它抗体或嵌合分子。这种技术可以包括将编码抗体的免疫球蛋白可变区或互补性决定区CDRs的DNA引入不同免疫球蛋白的恒定区或恒定区加框架区。还可以对杂交瘤细胞或产生抗体的其它细胞进行遗传突变或其它改变，这可以改变或者不改变所产生抗体的结合特异性。[0011]本发明所述单克隆抗体除了重链和轻链中的高度可变区⑶RlXDR2和⑶R3和连接序列外，其它为框架区。框架区可在结合所需的三维结构不受影响的条件下被其他序列置换，抗体特异性的分子基础主要来自于它的高度可变区⑶RlXDR2和⑶R3，这些区域是与抗原结合的关键部位。为维持优选的结合特性，CDR的序列应尽可能保留，然而，可能需要一些氨基酸改变使结合特性最优化，本领域的技术人员可以用标准做法来达到此目的。[0012]本发明所述单克隆抗体在人源化过程中，为了保持抗体与ro-Li的结合活性，对于框架区的关键氨基酸位点予以保留（即回复突变位点），这些氨基酸对于人源化以后的抗体活性有着至关重要的作用。[0013]优选的，所述重链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合：1E、37V、44S、49A、91I、94R、108T、77N、40T。[0014]所述轻链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合：43S、60D、63T、42Q。[0015]优选的，所述重链可变区还包含下述突变位点：52位D突变为ED52E、53位G突变为AG53A、或53位G突变为VG53V，这几个CDR区的定点突变能增加抗体的稳定性、提高抗体效价。[0016]拥有这些取代位置中任一个取代位置的抗体和拥有所有取代位置的抗体同样具有结合Η-1的活性。氨基酸取代可同时存在于框架区和CDR区，或单独出现在框架区或CDR区。[0017]优选的，本发明抗体或其抗原结合部分包含SEQIDNO.7〜SEQIDNO.26中任意一条所示的重链可变区序列和SEQIDNO.27〜SEQIDNO.33中任意一条所示的轻链可变区序列。[0018]在本发明的一个具体实施方案中，抗体可能包含a—个重链可变区，其氨基酸序列与SEQIDNO.18所示序列至少有95%的一致性和b—个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQIDNO.28所示序列至少有95%的一致性。因此，目标抗体可能包含a—个重链可变区，其氨基酸序列与SEQID勵.18所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性和b—个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQIDNO.28所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。优选的，抗体包含a—个重链可变区，其氨基酸序列与SEQIDNO.18所示序列一致和b—个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQIDNO.28所示序列一致。[0019]在本发明的另一个具体实施方案中，抗体可能包含a—个重链，其氨基酸序列与SEQIDNO.24所示序列至少有95%的一致性和b—个轻链，其氨基酸序列与SEQIDNO.30所示序列至少有95%的一致性。因此，目标抗体可能包含a—个重链，其氨基酸序列与SEQ10勵.24所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性和13—个轻链，其氨基酸序列与SEQID勵.30所示序列至少有约95%、96%、97%、98%、99%或100%的一致性。优选的，抗体包含a—个重链可变区，其氨基酸序列与SEQIDNO.24所示序列一致和b—个轻链可变区，其氨基酸序列与SEQIDNO.30所示序列一致。[0020]除了上面所描述的氨基酸取代，目标抗体可能在重链或轻链的两端有附加的氨基酸。例如，目标抗体在重链和或轻链的C或N末端分别可能包含至少1、2、3、4、5或6或更多的附加氨基酸。在某些实施例中，目标抗体可能比这里所描述的示范性氨基酸短，其主要区别为在重链和轻链的两端分别比示范性氨基酸少1、2、3、4、5或6个氨基酸。[0021]在本发明的另一方面，还提供了一种双特异性抗体，包含上述抗体或其抗原结合部分、和第二抗体或其抗原结合部分。[0022]双特异性抗体拥有两种特异性抗原结合位点，可以同时与靶细胞和功能细胞一般为T细胞相互作用，进而增强对靶细胞的杀伤作用。[0023]在本发明的另一方面，还提供了一种药物组合物，该组合物包含上述单克隆抗体或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体或稀释剂。[0024]在本发明的另一方面，还提供了一种分离的核酸，其编码上述单克隆抗体或其抗原结合部分的重链或轻链可变区。[0025]在本发明的另一方面，还提供了一种包含上述核酸的重组表达载体。[0026]在本发明的另一方面，还提供了一种包含重组表达载体的宿主细胞。[0027]本发明的单克隆抗体可以采用杂交瘤方法制得，也可以采用基因工程抗体方法制得。编码本发明人源化抗体的DNA序列可用本领域技术人员熟知的常规手段获得，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成或用PCR法扩增得到人源化抗体的DNA序列，然后用本领域熟知的各种方法将该序列连入合适的表达载体中。[0028]本发明的单克隆抗体也可用稳定细胞株方法制得，如根据本发明公开的氨基酸序列人工合成质粒转染细胞，筛选获得稳定表达抗体的细胞株。[0029]一旦制得本发明的抗体分子，就可以通过本领域已知的纯化免疫球蛋白分子的任何方法对其进行纯化，例如，通过色谱法例如，离子交换色谱，亲和色谱，特别是通过蛋白A对特异性抗原的亲和色谱和其它柱色谱）、离心、利用溶解度差异，或通过任何其它纯化蛋白质的标准技术。在许多实施方案中，抗体从细胞分泌到培养基中，通过收集培养基并进行纯化得到抗体。[0030]在本发明的另一方面，还提供了一种上述单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗ro-Li相关性疾病的药物中的用途。[0031]所述PD-Ll相关性疾病包括增殖性疾病例如白血病，癌症和淋巴瘤和感染性疾病例如乙肝，丙肝和AIDS。本发明抗体还可以用于与ro-Ll相关的科学研究，如发育生物学、细胞生物学、代谢、结构生物学、功能基因组学等多个领域的科学研究、或肿瘤、全身性自身免疫性疾病等医学和药学的应用研究。[0032]在本发明的另一方面，还提供了一种检测PD-Ll活性的试剂盒，包含上述的单克隆抗体或其抗原结合部分。[0033]在本发明的另一方面，还提供了一种检测芯片，包含上述的单克隆抗体或其抗原结合部分。[0034]本发明的PD-Ll抗体，能高效特异地结合人ro-Ll分子，通过有效阻断ro-Ll与其配体PD-I及CD80的结合，能有效促进人的免疫反应，并能促进人的免疫系统对肿瘤的杀伤作用，该ro-Ll抗体在ro-Ll相关性疾病的治疗及诊断检测方面具有很好的应用前景。附图说明[0035]下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。[0036]图1是本发明实施例2的HL1210-3抗体抗原结合活性结果图；[0037]图2是本发明实施例3的HL1210-3抗体蛋白抑制活性结果图；[0038]图3是本发明实施例4的HL1210-3抗体细胞水平竞争抑制实验结果图；[0039]图4是本发明实施例5的HL1210-3抗体人T细胞体外功能实验结果图；[0040]图5是本发明实施例6的HL1210-3抗体亲和力测定结果图；[0041]图6是本发明实施例8的人源化抗体的抗原结合活性结果图；[0042]图7是本发明实施例9的人源化抗体在细胞水平抗原结合活性结果图；[0043]图8是本发明实施例11的人源化候选抗体细胞水平竞争抑制实验结果图；[0044]图9是本发明实施例13的人源化候选抗体体外T细胞功能实验结果图；[0045]图10是本发明实施例14的CMV刺激实验结果图；[0046]图11是本发明实施例15的人源化候选抗体在HCC-827-huPBMC肿瘤模型上的体内药效实验结果图。具体实施方式[0047]本发明采用ro-Ll高表达CHOKl细胞免疫BALBc小鼠，利用单克隆抗体制备技术，筛选获得了一个能够高效结合人PD-Ll的小鼠抗人PD-Ll单克隆抗体，命名为HL1210-3抗体。接着，通过人源化设计实验，将HL1210-3抗体VL中的3个互补决定区（Complementaritydeterminingregion，⑶R⑶Rl，⑶R2以及⑶R3序列移植到最佳匹配的人免疫球蛋白种系基因Ol8或者KVl-39*01的骨架区序列（frameworksequences上。同时，将HLl210-3抗体VH的CDRl，CDR2以及CDR3序列移植到最佳匹配的人免疫球蛋白种系基因VH3-7*01,VH3-21，VH3-ll，VH3-23或者VH3-48等基因的骨架区序列上。然后，将该人源化的VH以及VL基因分别克隆到含有人重链IgGl和轻链kappa链恒定区的表达载体上进行重组表达，获得数十个人源化的H-L1抗体。经抗原结合活性检测、亲和力测定、抗体体外T细胞功能检测等一系列实验验证，本发明的人源化PD-Ll抗体，能高效特异地结合人PD-Ll分子，并通过有效阻断PD-Ll与其配体Η-1及CD80的结合，有效促进人的免疫反应，具有非常好的市场应用前景。[0048]实施例1针对人ro-Ll的小鼠单克隆抗体的产生和筛选[0049]抗原:PDLl-Fc蛋白以及PD-Ll高表达CHOKl细胞[0050]免疫方法:6-8周雌性BALBc小鼠在免疫4天之前眼眶采血，获得血清15-30ul，存放-20度，作为免疫前血清样本。用1.5XIO7个PD-Ll高表达CHOKl细胞免疫BALBc小鼠。在初次免疫14天后再用1.5XIO7个PD-Ll高表达CHOKl细胞加强免疫。在初免后33天进一步用1.5XIO7个PD-Ll高表达CHOKl细胞加强免疫。在免疫后44天，眼眶采血15-30ul，存放于-20度用于测试血清效价。选择效价较高的小鼠于免疫后第54天，用50ugPD-Ll-Fc腹腔注射小鼠，进行最终免疫。3天后与SP20细胞进行细胞融合，数量比在10:1到5:1之间，每孔所铺脾细胞数量不超过IXIO5细胞。融合7天以后更换培养基，以补充营养并降低检测背景。直接Elisa结合，挑选阳性克隆扩增。通过一系列筛选最终得到HL1210-3小鼠抗人I3D-Ll抗体。[0051]小鼠血清检测第三次免疫后一周采血）[0052]ELISA检测:包被TOLl-Fc蛋白，采用间接Elisa的方法测定小鼠血清滴度。[0053]D组小鼠，阴性㈤值的2.1倍为0.258,大于此值的最大稀释倍数为该动物的血清滴度，效价较高的小鼠为D3。[0054]表ID3小鼠的血清滴度[0056]实施例2HL1210-3抗体的抗原结合活性[0057]包被0·lugml的PDLl-Fc于Elisa酶标板上4°C过夜。次日PBST洗涤2次后，加入1%BSA封闭液，37°C孵育1小时。洗涤2次后，加入梯度稀释的HL1210-3抗体，0.2ugml起始，3倍稀释，共8浓度，37°C孵育1小时。洗涤3次后，加入羊抗鼠-HRP，稀释倍数为10000，37°C孵育1小时。洗涤3次后，TMB显色IOmin后用2%的H2SO4终止液终止。酶标仪预热15min后，450-630nm读数。结果如图1所示，得到了能够高效结合人PD-Ll的抗体HL1210-3,其结合抗原的活性为EC5Q=5·539ngml。[0058]实施例3HL1210-3抗体的蛋白抑制活性[0059]包被lugml的TOLl-Fc，4°C过夜。次日洗涤2次后，加入封闭液，37°C孵育1小时。[0060]洗涤2次后，加入50ul梯度系列稀释ro-Ll抗体HL1210-32ugml起始，3倍梯度共8个梯度）和50ul生物素标记的？01+：0.81^111137°：孵育1小时。洗涤3次后，加入稀释10000倍的Streptavidin-HRP，37°C孵育1小时。洗涤3次后，TMB显色IOmin后用终止液终止。酶标仪预热15min后，450-630nm读数，并拟合数据。结果如图2所示，HLl210-3抗体能够高效的抑制PD-Ll分子与其配体Η-1分子的结合，其抑制结合的IC5q=117.5ngml。[0061]实施例4HL1210-3抗体细胞水平的竞争抑制实验[0062]PD-Ll高表达CHO-Kl细胞系与HL1210-3抗体20ugml起始，3被梯度稀释，共计8个梯度在室温25°C孵育1小时。在加入生物素结合的huro-1-mFc室温孵育1小时。用FACS洗液洗涤2次后，加入Streptavidin-PE室温孵育半小时，洗掉没有结合的Streptavidin-PE。FACSariaIII上机检测PE的平均荧光强度。[0063]抑制率（％ofInhibition=[1-待检测孔PE荧光MFI无PD-Ll抗体组PE荧光MFI]X100%[0064]PD-Ll抗体HL1210-3能够有效地抑制哺乳动物细胞表面表达的PD-Ll分子与其配体Η-1分子的结合，其最高抑制效率达到92.6%见图3，其抑制效果的1：5=2.561^。[0065]实施例5HL1210-3抗体人T细胞体外功能实验[0066]人混合淋巴细胞实验：[0067]刺激细胞：用人CD14磁珠从人外周血单核细胞中分离CD14阳性的单核细胞。用树突状细胞分化培养液50ngmlhuGM-CSF和35ngmlhuIL-4刺激CD14阳性的单核细胞总计6天，其中每2天更换一半的分化培养基。[0068]效应细胞：用人CD4磁珠从另一个供者的外周血单核细胞中分离CD4阳性的T细胞作为效应细胞。[0069]混合淋巴细胞反应:在刺激细胞分化第7天，分离效应细胞，并以每个孔IXIO5效应细胞对1\104刺激细胞进行细胞培养。加入不同浓度的鼠抗人^-1^抗体!〇210-3，培养5天后通过ELISA检测上清液中的IFNg的浓度。[0070]如图4所示，HL1210-3抗体通过抑制在人树突细胞表面或T细胞表面上表达的PD-Ll分子，能够计量依赖地提高IFNgIFN-gamma或IFNγ细胞因子的分泌，说明HLl210-3抗体能够通过抑制细胞表面的I3D-Ll活性提高人的免疫反应。[0071]实施例6HL1210-3抗体亲和力检测[0072]采用表面等离子共振法（SurfacePlasmonResonance，SPR测定亲和力[0073]1.捕获分子抗鼠Fe片段捕获抗体的固定[0074]固定有抗鼠Fc片段捕获抗体的通道作为检测通道，未固定抗鼠Fc片段捕获抗体的通道作为对照通道，过程如下：[00M]I表面平衡:HBS-EP缓冲液，以ΙΟμΙmin的流速平衡芯片表面5min;[0076]2表面活化:注射‘NHS+EDC’1:1混合液，以ΙΟμΙmin的流速活化芯片表面7min;[0077]3耦联抗体:注射羊抗鼠Fe片段捕获抗体稀释在IOmM醋酸钠pH4.5缓冲液中），以ΙΟμΙmin的流速親联7min;对照通道省略此步骤；[0078]4表面封闭:注射乙醇胺，以ΙΟμΙmin的流速封闭表面7min。[0079]2.亲和力测定及动力学分析[0080]亲和力及动力学分析实验的检测温度均为25°c，缓冲体系为HBS-EP。实验采用多循环测定法，每个循环分为捕获待检测抗体、系列浓度抗原注射至芯片表面监测结合解离信号以及芯片再生三个步骤。[0081]3.实验数据经双扣减（对照通道及零浓度）后，在BiacoreT200evaluationsoftware中进行‘1:lbinding’模型的拟合。KD=2·93X10—10。[0082]结果如图5和下表2所示，HL1210-3抗体能够快速的结合PD-Ll分子，结合之后解离速度也非常慢，因此HLl210-3抗体能够高效的结合人PD-Ll分子，其结合的亲和力Affinity达到2.93X10—10M。[0083]表2HL1210-3抗体亲和力测定数据[0085]实施例7HL1210-3人源化设计[0086]对鼠抗人PD-L1单克隆抗体HL1210-3的重链可变区（HeavyChainvariableregion,VH和轻链可变区（LightChainvariableregion,VL进行人源化改造。首先将HL1210-3抗体的VH以VL的氨基酸序列在人免疫球蛋白（humanIg氨基酸序列数据库进行对比和检索，找到最佳匹配的人免疫球蛋白种系基因序列（humanIggermlinegenesequences。与HL1210-3抗体的VL蛋白序列最为相似的人的免疫球蛋白种系基因为018Jk2和KV1-39*01KJ2*04。与HL1210-3抗体的VH蛋白序列最为相近的人的免疫球蛋白种系基因为VH3-21。除此之外，人的种系基因¥!13-21，¥!13-11，¥!13-23，¥!13-48以及¥!13-7*01也与HL1210-3抗体的VH蛋白序列非常相似。因此，HL1210-3抗体VH的人源化设计是将下表3的HL1210-3抗体VH的CDRl，CDR2以及CDR3序列移植到VH3-21,VH3-11,VH3-23,VH3-48或者VH3-7*01等基因的骨架区序列上。HL1210-3抗体VL的人源化设计是将下表4的HL1210-3抗体VL中的3个互补决定区（Complementaritydeterminingregion，CDRCDRl，CDR2以及CDR3序列移植到018Jk2或者KVl-39*0IKJ2*04基因的骨架区序列（frameworksequences上。[0087]表3HL1210-3抗体VH的CDR1，CDR2以及CDR3序列[0089]表4HL1210-3抗体VL的CDR1，CDR2以及CDR3序列[0091]~通过抗体3D建模发现：鼠抗HL1210-3可变区序列中一些骨架区氨基酸与⑶R区结合甚至参与了CDR区的形成。这些氨基酸对于维持人源化抗体的活性至关重要，因此在人源化过程中应对这些鼠源的氨基酸予以保留即回复突变Back-mutation。如表5所示，VL上这个氨基酸是43位的SKabat命名系统）以及60D、63T、42Q;VH上这些氨基酸是framework2和3上的（IE，37V，44S，49A，911，94R，108T，77N，40T。人源化设计的具体氨基酸序列如表6所示，其对应的核酸序列分别是:HL1210VHSEQIDN0.34、Hul210VH.lSEQIDN0.35、Hul210VH.laSEQIDN0.36、Hul210VH.lbSEQIDN0.37、Hul210VH.2SEQIDN0.38、Hul210VH.2aSEQIDN0.39、Hul210VH.2bSEQIDN0.40、Hul210VH.3SEQIDN0.41、Hul210VH.3aSEQIDN0.42、Hul210VH.4SEQIDN0.43、Hul210VH.4aSEQIDN0.44、Hul210VH.4bSEQIDN0.45、Hul210VH.4cSEQIDN0.46、Hul210_VH.4dSEQIDN0.47、Hul210_VH.4eSEQIDN0.48、Hul210VH.5SEQIDN0.49、Hul210VH.5aSEQIDN0.50、Hul210VH.5bSEQIDN0.51、Hul210VH.5cSEQIDN0.52、Hul210_VH.5dSEQIDN0.53、HL1210VKSEQIDN0.54、Hul210VK.lSEQIDN0.55、Hul210VK.laSEQIDN0.56、Hul210VK.2SEQIDN0.57、Hul210VK.2aSEQIDN0.58、Hul210VK.2bSEQIDN0.59、Hul210VK.2cSEQIDN0.60。[0092]人源化的VH以及VL基因被合成后分别被克隆到含有人重链IgGl和轻链kappa链恒定区的pcDNA3.1载体上，并在293T细胞上表达，通过proteinAGc纯化得到人源化抗体。这些抗体的重链以及轻链分别组合成为了40个人源化的H-L1抗体表7。[0093]注:HL1210-3的VH和VL直接克隆到含有人重链IgGl和轻链kappa链恒定区的表达载体上的抗体为嵌合抗体H1210Chimera。[0094]表5人源化设计[0096]表6人源化设计的具体氨基酸序列[0098][0099]表740个人源化抗体的合成方案与命名[0104]实施例8人源化抗体的抗原结合活性[0105]包被0.1ugml的huPDLl-Fc于Elisa酶标板上4°C过夜。次日PBST洗涤2次后，加入1%BSA封闭液，37°C孵育1.5小时。洗涤2次后，加入梯度稀释的人源化抗体，10ugml起始，5倍稀释，共8浓度，37°C孵育1小时。洗涤3次后，加入二抗:anti-humanIgGFab-HRP，（1:3000，25°C孵育40min.洗涤3次后，TMB显色IOmin后用INHCl终止液终止。酶标仪预热15!11；[11后，450-630111]1读数。结果如图6所示，所有的人源化抗体与嵌合抗体!11210〇1；[1116^在ELISA结合活性上非常相似，说明这些人源化抗体都能够有效的结合H-L1抗原。[0106]实施例9人源化抗体的抗原细胞水平结合活性[0107]在FACS缓冲液中重悬CHOKl-hroLl细胞，加入ΙΟΟμΙ梯度稀释2ugml，1:5的人源化抗体4°C孵育lh。用FACS缓冲液洗涤三次，加入100μ1二抗alexa488-anti-human抗体（1:1000虹1此丨〇114°：孵育111^403¥6^6上机检测。结果如图7所示，所有的人源化抗体与嵌合抗体H1210Chimera在PD-Ll细胞结合活性上非常相似，说明这些人源化抗体都能够有效的结合I3D-Ll抗原。[0108]实施例10人源化抗体的抗原亲和力排序[0109]使用OctetRed对亲和力进行排序，由下述表8的数据可知，hul21〇-3，hul21〇-8,hul210-9，hul210-14,hul210-17，hul210-19和hul210-22是亲和力最好、且与嵌合抗体最为接近的人源化抗体。[0110]表8人源化抗体的抗原亲和力排序[0112]实施例11人源化候选抗体细胞水平的竞争抑制实验[0113]PD-Ll高表达CHO-Kl细胞系与人源化候选抗体20ugml起始，3被梯度稀释，共计8个梯度在室温25°C孵育1小时。在加入生物素结合的huro-1-mFc室温孵育H^jFACS洗液洗涤2次后，加入Streptavidin-PE室温孵育半小时，洗掉没有结合的Streptavidin-PEt3FACSariaIII上机检测PE的平均荧光强度。IC5Q=2.56nM。抑制率（％ofInhibition=[1-待检测孔PE荧光MFI无PD-Ll抗体组PE荧光MFI]X100%[0114]结果如图8和下表9所示，在阻断PD-Ll与I3D-I结合的活性上，hul210-14和hul210-3优于嵌合抗体，hul210-9，hul210-8，hul210-17，hul210-22和hul210-19与嵌合抗体相似。[0115]表9人源化候选抗体抑制ro-Li与ro-i结合的数据[0117]实施例12人源化候选抗体亲和力测定[0118]使用BiacoreT200对人源化候选抗体进行亲和力测定。[0119]由以下表10数据可以得知，在阻断PD-Ll与PD-I结合的活性上，hul210-17，hul210-14和hul210-9与嵌合抗体的亲和力最为接近，其中hul210-17优于嵌合抗体。[0120]表10人源化候选抗体亲和力测定数据[0121][0122]实施例13人源化候选抗体体外T细胞功能实验[0123]刺激细胞：用人CD14磁珠从人外周血单核细胞中分离CD14阳性的单核细胞。用树突状细胞分化培养液50ngmlhuGM-CSF和35ngmlhuIL-4刺激CD14阳性的单核细胞总计6天，其中每2天更换一半的分化培养基培养基。[0124]效应细胞：用人CD4磁珠从另一个供者的外周血单核细胞中分离CD4阳性的T细胞作为效应细胞。[0125]混合淋巴细胞反应:在刺激细胞分化第7天，分离效应细胞，并以每个孔IXIO5效应细胞对IXIO4刺激细胞进行细胞培养。加入不同浓度的人源化候选抗体，培养5天后通过ELISA检测上清液中的IFNgIL-2的浓度。[0126]结果如图9所示，人源化抗体hul210-8，hul210-9，hul210-16，hul210-17通过抑制在人树突细胞表面或T细胞表面上表达的H-L1分子，能够计量依赖地提高IL-2和IFNg细胞因子的分泌，说明这些人源化抗体能够通过抑制细胞表面的ro-Li活性提高人的免疫反应。和嵌合抗体相比，这些人源化的抗体具有与其相似的活性，说明人源化非常成功，具有很好的应用前景。[0127]实施例14CMV刺激实验[0128]巨细胞病毒CMV感染过的人会产生对于CMV抗原的免疫反应。PD-Ll阻断抗体应该能通过抑制PD-Ll信号通路，来增强人PBMC外周血中单个核细胞，包括淋巴细胞和单核细胞对CMV抗原的免疫反应。[0129]用lugml的CMV抗原刺激人PBMC，加入不同浓度的PD-Ll抗体，培养5天后，检测上清液中的IFNg的水平。[0130]如图10所示，hul210-40，hul210-41以及hul210-17抗体均能够有效地提高人PBMC对CMV抗原的反应性，说明这些ro-Ll抗体能够有效促进人的免疫反应。[0131]实施例15人源化候选抗体在HCC-827-huPBMC肿瘤模型上的体内药效实验[0132]PD-Ll阻断抗体是通过抑制肿瘤表面上PD-Ll分子与T细胞上的受体结合并抑制PD-Ll通路介导的免疫抑制，激活肿瘤特意性的免疫反应从而达到控制肿瘤成长的药效。因此建立HCC-827-huPBMC肿瘤模型来评价候选抗体的体内药效。[0133]HCC-827-huPBMC肿瘤模型：[0134]HCC-827细胞是人非小细胞肺癌细胞系，这个肿瘤细胞系高表达PD-Ll。先皮下接种HCC-827细胞到完全免疫缺陷的NSG小鼠上。在接种后第17天，皮下肿瘤生长至150mm3左右时，尾静脉注射人PBMC，并将荷瘤鼠分成2组，分别给予阴性对照IgG和受试抗体Hul210-31，以分组当天为Dayl，从Dayl至Day15每周给药三次，考察肿瘤生长情况。[0135]如图11所示，与IgG组相比，给药期间Hu1210-31的相对肿瘤体积抑瘤率均能达到40%左右。Dayl5末次给药后停药5天，Day20再次测量，Hul210-31的相对肿瘤体积抑瘤率分别降低至10.57%，该结果表明本发明的ro-Li抗体能够有效的促进人免疫系统对于肿瘤生长的抑制。[0136]以上所述实施例仅表达了本发明的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

权利要求：1.一种分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其结合人PD-Ll蛋白，该抗体或其抗原结合部分包含分别如SEQIDNO.1、2和3所示的重链可变区⑶R1、CDR2和⑶R3序列及分别如SEQIDΝ0·4、5和6所示的轻链可变区⑶R1、⑶R2和⑶R3序列。2.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合：1E、37V、44S、49A、91I、94R、108T、77N、40T〇3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述轻链可变区还包含下述回复突变位点的任意一个或任意两个以上的组合:43S、60D、63T、42Q。4.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，所述重链可变区还包含下述突变位点:52位D突变为E、53位G突变为A、或53位G突变为V。5.根据权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，该抗体或其抗原结合部分包含SEQIDNO.7〜SEQIDNO.26中任意一条所示的重链可变区序列和SEQIDNO.27〜SEQIDNO.33中任意一条所示的轻链可变区序列。6.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，该抗体或其抗原结合部分包含SEQIDNO.18所示的重链可变区序列和SEQIDNO.28所示的轻链可变区序列。7.根据权利要求5所述的单克隆抗体或其抗原结合部分，其特征在于，该抗体或其抗原结合部分包含SEQIDNO.24所示的重链可变区序列和SEQIDNO.30所示的轻链可变区序列。8.—种双特异性抗体，包含权利要求1所述抗体或其抗原结合部分、和第二抗体或其抗原结合部分。9.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分、以及药学上可接受的载体或稀释剂。10.—种分离的核酸，其编码权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合部分的重链或轻链可变区。11.一种重组表达载体，其包含权利要求10所述的核酸。12.—种宿主细胞，其包含权利要求11所述的重组表达载体。13.权利要求1所述单克隆抗体或其抗原结合部分在制备治疗PD-Ll相关性疾病的药物中的用途。14.根据权利要求13所述的用途，其特征在于，所述ro-Ll相关性疾病包括增殖性疾病和感染性疾病，其中，增殖性疾病包括各种癌症，感染性疾病包括乙肝、丙肝、或艾滋病。15.—种检测PD-Ll活性的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。16.—种检测芯片，其特征在于，包含权利要求1所述的单克隆抗体或其抗原结合部分。

百度查询： 天境生物科技(上海)有限公司 PD-L1抗体及其用途

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