申请/专利权人：安徽大学

申请日：2018-03-23

公开（公告）日：2020-11-17

公开（公告）号：CN108424469B

主分类号：C08B37/00(20060101)

分类号：C08B37/00(20060101);A61K31/715(20060101);A61P3/10(20060101);A23L33/125(20160101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.17#授权;2018.09.14#实质审查的生效;2018.08.21#公开

摘要：本发明公开了一种芡实种仁多糖及其分离提取方法和用途，其中芡实种仁多糖的分子量为8.75ⅹ103Da，单糖组成及摩尔比为葡萄糖醛酸：甘露糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55：0.6：52.7：1：4.3。本发明芡实种仁多糖可以促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取量，具有研发降血糖保健食品和药物的应用前景。

主权项：1.一种芡实种仁多糖在制备降血糖保健品或药品中的应用，其特征在于：所述芡实种仁多糖的分子量为8.75ⅹ103Da，单糖组成及摩尔比为葡萄糖醛酸：甘露糖：葡萄糖：半乳糖：阿拉伯糖＝0.55：0.6：52.7：1：4.3；所述芡实种仁多糖的分离提取方法包括如下步骤：步骤1：分离提取将成熟的芡实种仁粉碎成粉末，加入蒸馏水超声提取5min，然后于60℃水浴2h，四层纱布过滤，收集上清液，向滤渣中加入蒸馏水重复上述提取过程再次提取，合并上清液；将所得上清液旋蒸浓缩，然后加入无水乙醇4℃下静置沉淀，离心收集沉淀，加水溶解沉淀即得粗多糖水溶液；步骤2：sevag法脱蛋白将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇混合，磁力搅拌2-3h，离心后收集上清液；重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白芡实种仁多糖溶液；步骤3：透析除杂将步骤2获得的脱蛋白芡实种仁多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，使用透析袋流水透析48h，蒸馏水透析24h，再次旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻干燥，即得芡实种仁粗多糖；步骤4：纯化将步骤3获得的芡实种仁粗多糖通过SuperdexTM75葡聚糖凝胶柱洗脱分离，使用高效液相色谱跟踪检测分离效果，收集保留时间相同的多糖，浓缩冻干后即得芡实种仁纯多糖；步骤3中，透析袋的截留分子量为3500Da。

全文数据：一种芡实种仁多糖及其分离提取方法和用途技术领域[0001]本发明涉及一种芡实种仁多糖及其分离提取方法和用途，属于天然产物提取和生物活性领域。背景技术[0002]n型糖尿病T2DM是一种以高血糖为特征的糖代谢紊乱的疾病。近年来糖尿病患病率迅猛增长，据统计2010年中国糖尿病患病率已高达9.7%，患者人数达到了9240万，预计到2030年将增至1.29亿。因此，T2DM的防治已经成为影响中国公民健康的重要问题之一。糖尿病的主要发病机制是由于胰岛功能缺失或受损引起，既有遗传因素也有环境因素包括后天饮食、作息习惯、肥胖等影响引起胰岛素分泌不足，常常伴有胰岛素抵抗现象发生。[0003]突实（Eureyalefe;roxSalisb是睡莲科（Nymphaeaceae突属（Euryale—年生水生草本植物。野生芡实全国各地分布比较广，人工栽培主要以江苏、浙江和安徽等省为主。芡实成熟种仁含有丰富的基本营养成分，有碳水化合物、蛋白质、矿物质和维生素等，功效成分主要有黄酮类、环肽类、酚类、多糖、留醇类和脑苷脂等成分。传统中医学上，芡实的成熟种仁具有益肾固精，有健脾利湿作用，常用于治疗遗精遗尿，脾虚久泄，白浊带下。文献调研发现，芡实粗提取物主要有抗氧化、抗心肌缺血、抗衰老、降血糖、降血压及抑菌、保护冑粘膜等作用。然而关于芡实多糖的研究还比较少，只有抗氧化活性方面的报道，目前尚未有芡实种仁多糖结构鉴定及降糖方面的活性报道。发明内容[0004]本发明提供了一种芡实种仁多糖及其分离提取方法和用途。本发明芡实种仁多糖可以促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取量，天然无毒，具有研发降血糖保健食品和药物的应用前景。[0005]本发明芡实种仁多糖，分子量为8.75xl03Da，单糖组成及摩尔比为葡萄糖醛酸：甘露糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=0.55:0.6:52.7:1:4.3。本发明芡实种仁多糖的分离提取方法，包括如下步骤：[0006]步骤1:分离提取[0007]将成熟的芡实种仁粉碎成粉末，加入3-5倍体积的蒸馏水超声提取5min，然后于60°C水浴2h，四层纱布过滤，收集上清液，向滤渣中加入蒸馏水重复上述提取过程再次提取，合并上清液;将所得上清液旋蒸浓缩，然后加入四倍体积的无水乙醇4°C下静置沉淀，离心收集沉淀，加水溶解沉淀即得粗多糖水溶液;加水量使沉淀刚好完全溶解即可。[0008]步骤2:seVag法脱蛋白[0009]将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇按照体积比5:4:1的比例混合，磁力搅拌2-3h，离心后收集上清液;重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白芡实种仁多糖溶液；[00!0]步骤3:透析除杂[0011]将步骤2获得的脱蛋白芡实种仁多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，使用35〇〇KDa的透析袋，流水透析48h，蒸馈水透析24h，再次旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻干燥，即得突实种仁粗多糖；~J[0012]步骤4:纯化[0013]将步骤3获得的芡实种仁粗多糖通过Superdex™75葡聚糖凝胶柱洗脱分离，以蒸溜水为洗脱液，使用高效液相色谱跟踪检测分离效果，收集保留时间相同的多糖，浓缩冻^后即得芡实种仁纯多糖。~[0014]本发明获得的突实种仁纯多糖的分子量为8_75Xl〇3Da图1和图2，是一种中性多糖，单糖组成（图3和图4，其单糖组成及摩尔比为葡萄糖醛酸:甘露糖:葡萄糖:半乳糖：阿拉伯糖=〇•55:0•6:52•7:1:4•3。红外光谱图显示芡实种仁多糖含有构型，存在卩比喃^，有多糖的五个典型特征峰，如图5。’[0015]本发明芡实种仁多糖的的用途，是在制备降血糖保健品或药品中的应用。[0016]本发明以胰岛素抵抗细胞模型为研究对象，研究无毒副作用的芡实种仁多糖的降血糖降血脂效果。[0017]芡实种仁多糖对胰岛素抵抗细胞的葡萄糖摄取的影响实验：[0018]3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成熟，使用lymoLL的地塞米松诱导48h建立胰岛素抵抗模型后，以不同浓度的芡实种仁纯多糖处理24h，使用葡萄糖检测试剂盒检测细胞上^液中的葡萄糖含量。HepG2细胞也使用同样方法处理。实验结果从图6和图7可知，突实种仁多糖可以促进胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗量，改善胰岛素抵抗，具有研制治疗糖尿病药物和保健食品的应用前景。附图说明[0019]图1是葡聚糖标准曲线。[0020]图2是芡实种仁多糖高效液相色谱图。[0021]图3是标准单糖高效液相色谱图（*-溶剂峰，1-葡萄糖醛酸，2—甘露糖，3_葡萄糖，4-半乳糖，5-阿拉伯糖）。[0022]图4是芡实种仁多糖单糖组成高效液相色谱图（*-溶剂峰，:L-葡萄糖醛酸，2_甘露糖，3-葡萄糖，4-半乳糖，5-阿拉伯糖。[0023]图5是芡实种仁多糖红外光谱图。[0024]图6是芡实种仁多糖对胰岛素抵抗3T3_L1脂肪细胞葡萄糖消耗率的影响，与模型组比较具有显著性差异*0.05，#p0•01，##0.01。[0025]图7是芡实种仁多糖对胰岛素抵抗HepG2细胞葡萄糖消耗率的影响，与模型组比较具有显著性差异*〈〇•05，**p0•01，##〈0•01。具体实施方式[0026]以下通过具体的实施例描述本发明的制备，结构表征及降糖降脂活性，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的保护范围。[0027]实施例1:芡实种仁多糖的提取和分离纯化[0028]1、分离提取[0029]将成熟的芡实种仁清洗，烘干，粉碎并过40目筛3尔取500g芡实种仁粉末，加入2L蒸馏水，搅拌均匀后超声提取5分钟，然后置于60°C水浴锅中水浴，每30min搅拌一次，2h后使用四层纱布过滤，收集上清液，向滤渣中加入2L蒸馏水，重复上述提取过程再次提取，合并上清液;将得到的上清液离心4000rpmmin，lOmin，弃沉淀，收集上清液，旋蒸浓缩至150mL，加入4倍体积的无水乙醇在4°C冰箱过夜沉淀，离心（4500rpmmin，lOmin，收集沉淀，并用尽量少的蒸馏水溶解，再次离心4500rpmmin，lOmin，除去水不溶性物质，即得到粗多糖水溶液。[0030]2、sevag法脱蛋白[0031]将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇按照体积比为5:4:1的比例混合，磁力搅拌2-3h，离心7500rpmmin，lOmin，收集上清液;重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白芡实种仁多糖溶液。[0032]3、透析除杂[0033]将步骤2获得的脱蛋白芡实种仁多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，然后装入截留分子量为3500Da的透析袋中，流动自来水中透析48h，然后在蒸馈水中磁力搅拌透析24h，每4小时换一次蒸馏水，透析完成后取出，旋蒸浓缩至最浓体积，真空冷冻干燥48h，即得芡实粗多糖。[0034]4、纯化[0035]SUperdex™75葡聚糖凝胶装柱体积为800nrni*30mm的柱子，防止有气泡，恒流栗流速为lmlmim。将步骤3获得的芡实粗多糖用蒸馏水配制成3ml、浓度为50mgml的溶液，0.22wn的水相滤头过滤，上样，蒸馏水洗脱，流速为0•68mlmin;3h后，开始收集洗脱液，每管4ml。硫酸苯酚法跟踪检测糖含量，一直收集到不能检测到糖为止。收集的洗脱液，每隔5管，用高效液相色谱检测分离效果，收集保留时间相同的多糖，浓缩冻干后即得芡实种仁纯多糖。使用的色谱柱为Ultrahydrogel™250，规格为7•8*300mm。[OO36]实施例2:芡实种仁多糖的结构表征[0037]1、分子量测定[0038]分别精确配制lmgmL的芡实种仁多糖£?3?-1、13、17、1'10、150的溶液11111，并用0.22wii的微孔过滤膜过滤制样。利用高效液相色谱法检测其出峰时间，上样量为3〇此。根据标准品葡聚糖的出峰时间，得出分子量计算公式，并计算芡实种仁多糖的分子量。[0039]2、单糖组成测定[0040]芡实种仁多糖的单糖组成分析采用酸水解-柱前PMP衍生化方法处理样品，再用高效液相色谱法测定。精确称取芡实种仁多糖（10mg溶于5mL的2m〇LL的三氟乙酸TFA中，充氮气封管，在ll〇°C油锅水解6h。再用旋转蒸发仪反复旋干，加适量的去离子水，再旋干，如此反复几次直到溶液PH显示中性为止。加入lmL蒸馈水，备用。[0041]标准单糖和已水解的样品溶液中加入50wL，0.5MPMP甲醇溶液和50yL、0.3MNaOH溶液，在70°C的水浴锅中反应3〇min进行PMP柱前衍生化，然后用50uL的0•3M的HC1中和至中性。所得产物使用高效液相色谱检测，选用DAD检测器。HPLC柱温为30°C，色谱柱为ZorboxEclipseXDB-Ci8柱4.6mmx250mm，5ym，在波长为254nm条件下检测。检测流动相选用两种，流动相A为乙酸铵缓冲溶液2〇〇mm〇LL，流动相B为乙腈。时间梯度洗脱0-30min，初始设置为流动相A:流动相B=86%:14%，最终洗脱到比例为流动相A:流动相B=74%:26%，进样量为1〇此。[0042]3、红外光谱分析[0043]芡实种仁多糖的红外光谱结构进行分析采用溴化钾压片法，压成薄片，在4000〜400CHT1的频率范围内进行测定。称取1mg的芡实种仁多糖，与1〇〇mgKBr1:100研磨均匀后检测。实验结果：[0044]芡实种仁多糖分子量为8.75xl03Da，共有五种单糖，分别为葡萄糖酸酸、甘露糖、葡萄糖、半乳糖和阿拉伯糖，主要以葡萄糖为主，葡萄糖醛酸、甘露糖含量很少。各种单糖摩尔比为葡萄糖醛酸:甘露糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=0.55:0.6:52.7:1:4.3。[0045]芡实种仁多糖红外光谱具有五个典型吸收峰，分别是3404^-^2921^-^1642^和lOMcnf1的位置。在MCMcnf1处出现的强而宽的峰是因为醇羟基0-H伸缩震动引起的，因存在分子间氢键而出现宽锋;在2921CHT1处出现的中尖峰是饱和烷烃震动区域内，是由C-H伸缩震动产生的。在1642cm_1处的中峰是由0-H的弯曲震动引起的，在1412cm—1处的中峰是由_CH2的变形震动引起的吸收峰。红外光谱看到出现三个峰分别为1153cm—1、1080CHT1和1032CHT1，所以认为存在吡喃环。在900CHT1处出现弱的吸收峰认为此多糖为运构型。[0046]实施例3:芡实种仁多糖的降血糖活性测定[0047]1、芡实种仁多糖对胰岛素抵抗细胞葡萄糖消耗量的影响[0048]3T3-L1脂肪细胞和HepG2细胞使用lumoLL的地塞米松作用48h，建立胰岛素抵抗模型后实验分成四组:对照组、模型组Dex、阳性对照组二甲双胍和芡实多糖EFSP-1组。对照组和模型组使用DMEM高糖完全培养液培养，二甲双胍组使用含有0•5mm〇LL二甲双胍的DMffl高糖完全培养液培养，芡实多糖EFSP-1组由含有不同浓度的芡实多糖EFSP-l25ugmL，50ligmL，1OOugmL，200tigmL，400iigmLDMEM高糖完全培养液培养。药物配成不同浓度等体积，对照组和模型组的培养液中加入与药物同体积的PBS，确保加入的培养液体积一致。药物作用24h后，使用葡萄糖测定试剂盒，测定细胞上清中的葡萄糖含量。[0049]实验结果：[0050]与模型组比较，芡实种仁多糖能够显著提高胰岛素抵抗HepG2细胞和3T3-L1脂肪细胞的葡萄糖消耗率。在芡实种仁多糖的浓度为25ugmL，50ugmL，100ugmL，200ugmL，400邱11^时，胰岛素抵抗1^口62细胞和3了3-1^脂肪细胞的葡萄糖消耗率分别为102.3%、104.1%、104.5%、106.6%、126.1%和72.35%、88.54%、93.27%、95.26%、100.4%。

权利要求：1.一种芡实种仁多糖，其特征在于:所述芡实种仁多糖的分子量为8•75x103Da，单糖组成及摩尔比为葡萄糖醛酸:甘露糖:葡萄糖:半乳糖:阿拉伯糖=0.55:0.6:52.7:1:4.3。2.—种权利要求1所述的芡实种仁多糖的分离提取方法，其特征在于包括如下步骤：步骤1:分离提取将成熟的芡实种仁粉碎成粉末，加入蒸馏水超声提取5min，然后于60。：水浴2h，四层纱布过滤，收集上清液，向滤渣中加入蒸馏水重复上述提取过程再次提取，合并上清液;将所得上清液旋蒸浓缩，然后加入无水乙醇4°C下静置沉淀，离心收集沉淀，加水溶解沉淀即得粗多糖水溶液；步骤2:sevag法脱蛋白将步骤1获得的粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇混合，磁力搅拌2-3h，离心后收集上清液;重复上述处理步骤直至蛋白质完全去除，获得脱蛋白芡实种仁多糖溶液；步骤3:透析除杂将步骤2获得的脱蛋白芡实种仁多糖溶液旋蒸浓缩除去有机试剂，使用透析袋流水透析48h，蒸馏水透析24h，再次旋蒸浓缩至浓稠状液体，真空冷冻千燥，即得芡实种仁粗多糖；步骤4:纯化将步骤3获得的芡实种仁粗多糖通过Superdex™75葡聚糖凝胶柱洗脱分离，使用高效液相色谱跟踪检测分离效果，收集保留时间相同的多糖，浓缩冻干后即得芡实种仁纯多糖。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤2中，粗多糖水溶液、三氯甲烷和正丁醇混合的体积比为5:4:1。4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤3中，透析袋的截留分子量为35〇〇Da。5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤4中，洗脱液为蒸馏水。6.—种权利要求1所述的芡实种仁多糖的的用途，其特征在于:是在制备降血糖保健品或药品中的应用。

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