申请/专利权人：上海交通大学

申请日：2019-05-05

公开（公告）日：2020-11-17

公开（公告）号：CN110184252B

主分类号：C12N9/12(20060101)

分类号：C12N9/12(20060101);C12N15/54(20060101);C12N15/84(20060101);A01H5/00(20180101);A01H6/46(20180101);A01H1/02(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.17#授权;2019.09.24#实质审查的生效;2019.08.30#公开

摘要：本发明提供了一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法；所述的雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。所述应用为：采用常规方法敲除、改变或抑制OsDAF1基因，使得常规水稻品种中的OsDAF1基因表达水平降低或丧失，进而获得水稻雄性不育株系。本发明还涉及恢复Osdaf1雄性不育性状的方法，包括：使用遗传转化方法将SEQIDNO.2转化到Osdaf1突变体，使其育性恢复到野生型表型。本发明制备的水稻雄性不育株系在水稻营养生长时期无异常表型出现，但在生殖生长时期的花药发育过程中出现异常，表现完全雄性不育。应用于杂交育种，可免除母本去雄的工作，大大提高生产效率。

主权项：1.一种雄性不育基因OsDAF1的应用，其特征在于，所述雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示；所述应用为：通过RNA干扰或者序列变异基因工程方法由编码SEQIDNO.1所示的氨基酸序列的SEQIDNO.2所示的核苷酸序列突变获得序列如SEQIDNO.3所示的15个碱基对缺失导致关键氨基酸缺失的水稻雄性不育株系，即突变体Osdaf1-1；或采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列移码并提前终止，突变为如SEQIDNO.12所示的氨基酸序列，获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。

全文数据：雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法技术领域本发明涉及常规水稻遗传育种技术领域，具体地，涉及一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法。背景技术水稻是全世界重要的粮食作物，世界上约有50％的人口以水稻为主食，大米也是加工许多食品的原材料。由于水稻的基因组较小，且水稻转化系统非常成熟，可以作为单子叶研究的模式植物，人们对水稻生殖发育机制还有待了解。水稻雄性不育系的发现及其利用开创了水稻杂交育种的新时代，对提高水稻产量发挥了巨大作用。由于目前水稻杂交过程中使用的不育系存在育性不稳定、细胞质负效应等缺点，因此深入开展水稻雄性不育调控机制的研究，对获得新型水稻不育系，提高农业产量等具有重要意义。同时对揭示植物生殖发育的分子调控机理等方面也具有重要的理论意义。雄性不育系：是指一种雄性退化主要是花粉退化但雌蕊正常的母水稻，由于花粉无力生活，不能自花授粉结实，只有依靠外来花粉才能受精结实，因此借助这种母水稻作为遗传工具，通过人工辅助授粉的方法，就能产生大量杂交种子。从育种战略上看，杂交水稻的发展可以分为三系法、两系法和一系法三个发展阶段。每进入一个新阶段，都是育种上的一次突破，从而会把水稻的产量提高到一个新台阶。现在生产上用的杂交水稻属于三系法品种间杂交优势利用的范畴，这种三系杂交稻一般要比常规水稻增产20％左右，当前仍处于方兴未艾时期。但是，三系法杂交水稻种子优势表现复杂，受恢复系和保持系关系限制，使优良组合的筛选比较困难。因此，科学家一直在筛选和培育新的不育系，以期扩展细胞质背景，为远缘杂交和杂种优势的利用奠定基础。发明内容针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法。本发明针对现有技术存在的上述不足，提供一种雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法，利用OsDAF1基因及其蛋白参与调控水稻雄性生殖的特点，及其利用转基因技术控制水稻雄性生殖发育，通过突变该蛋白序列或抑制该蛋白的表达产生新的水稻雄性不育株系，在农业生产上具有十分重要的应用。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：第一方面，本发明提供一种雄性不育基因OsDAF1，所述雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。优选地，所述雄性不育基因OsDAF1的核苷酸序列如SEQIDNO.2。第二方面，本发明提供一种雄性不育基因OsDAF1的应用，所述应用为：采用常规方法敲除、改变或抑制OsDAF1基因，使得常规水稻品种中的OsDAF1基因表达水平降低或丧失，进而获得水稻雄性不育株系。第三方面，本发明提供一种水稻雄性不育株系创制的方法，包括如下步骤：对常规水稻品种进行处理、培育，即得所述水稻雄性不育株系；所述处理为：采用常规基因工程方法或CRISPR-CAS9基因编辑方法，使得水稻中编码如SEQIDNO.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失，变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。优选地，所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。优选地，所述水稻品种包括粳稻品种9522、籼稻品种广陆矮4号、9311或龙特甫4号中的至少一种。优选地，所述处理的具体方法为：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列突变为如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-1突变体。更优选地，所述处理的具体方法为：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQIDNO.2所示核苷酸序列突变为SEQIDNO.3。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-1突变体。上述SEQIDNO.3和SEQIDNO.4分别是辐射突变后的DNA序列和氨基酸序列。优选地，所述处理的具体方法为：采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列移码并提前终止，突变为如SEQIDNO.12所示的氨基酸序列。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。更优选地，所述处理的具体方法为：采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQIDNO.2所示核苷酸序列突变为SEQIDNO.11。进而获得水稻雄性不育株系，即osdaf1-3突变体。上述SEQIDNO.11和SEQIDNO.12分别是CRISPR敲除后的DNA序列和氨基酸序列。优选地，所述CRISPR-CAS9基因编辑方法为：改变编码如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列SEQIDNO.2，降低所述氨基酸序列对应多肽的表达水平或者破坏所述氨基酸序列对应多肽的活性。优选地，所述CRISPR-CAS9基因编辑方法中CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建方法包括如下步骤：A1、选择OsDAF1基因编码区序列如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的第393位至第413位共20bp的特异性片段为靶标位点；A2、基于现有方法参考文献Xieetal.BoostingCRISPRCas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem.Proc.Natl.Acad.Sci.112,3570–35752015中的方法，采用两对如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的序列作为引物，以质粒pGTR为模板，分别扩增出两段序列；混合两段序列，以限制性内切酶Bsa1和T7连接酶进行边切边连；产物作为模板，以如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的序列作为引物，扩增出tRNA连接gRNA的片段，Fok1限制性内切酶处理该片段后，插入Bsa1处理后的pRGEB32载体中，测序验证后成功构建pRGEB32-OsDAF1质粒，转化根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105。第四方面，本发明提供一种水稻不育株系在水稻制种中的用途，以如前述所述应用获得的水稻雄性不育株系作为母本，配合具有杂交优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。第五方面，本发明提供一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，包括如下步骤：采用遗传手段将所述OsDAF1基因，转入如前述所述方法获得的水稻雄性不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型。优选地，所述方法包括如下步骤：将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsDAF1互补构建含有编码如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。优选地，所述方法的具体步骤为：B1、从野生型水稻幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，采用碱基序列如SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的引物，扩增出OsDAF1基因的如SEQIDNO.15所示的7234bp的基因组序列片段；B2、提供携带表达OsDAF1互补构建载体的根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105；其中，所述OsDAF1互补构建含有如SEQIDNO.15所示的核苷酸序列；B3、将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得。优选地，所述野生型水稻为野生型9522。优选地，所述步骤B3具体为：将水稻细胞或组织或器官与步骤B2中的根癌农杆菌接触，从而使编码如SEQIDNO.1所示氨基酸的核苷酸序列SEQIDNO.15转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；选择转入所述核苷酸的水稻细胞或组织，进行再生，获得水稻植株。与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：本发明通过控制水稻OsDAF1基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖的变异株，实现控制水稻生殖过程；本发明获得的水稻突变体在营养期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，花粉败育，得到完全不育的植株，在杂交水稻构建和农业生产上具有十分重要的应用。附图说明通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：图1为OsDAF1突变体雄性不育表型，基因编辑突变体表型及基因组互补表型示意图；其中：图1A为粳稻9522去除内外稃花表型图；图1B为Osdaf1-1不育株去除内外稃花表型图；图1C为基因编辑Osdaf1-3不育株去除内外稃花表型图；图1D为OsDAF1基因组DNA表达载体转化Osdaf1-1不育株去内外稃花表型图；图1E为粳稻9522花粉粒I2-KI染色图；图1F为Osdaf1-1花粉粒I2-KI染色图；图1G为Osdaf1-3花粉粒I2-KI染色图；图1H为OsDAF1基因组DNA表达载体转化Osdaf1-1不育株花粉粒I2-KI染色图；图1I为粳稻9522花粉粒扫描电镜图；图1J为Osdaf1-1花粉粒扫描电镜图；图1K为Osdaf1-3花粉粒扫描电镜图；图1L为OsDAF1基因组DNA表达载体转化Osdaf1-1不育株花粉粒扫描电镜图；图1A到图1D的图标等于50微米；图1E到图1H的图标等于20微米；图1I到图1L的图标等于5微米；图2为OsDAF1基因定位、结构和突变位点示意图；其中，图2A为OsDAF1基因定位示意图；图2B为基因结构及突变位点示意图；图3为OsDAF1表达模式示意图；其中，横坐标所述的S9、S10a、S10b、S11、S12、S13表示水稻雄性生殖发育的各个时期野生型花药材料。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变化和改进。这些都属于本发明的保护范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。所述OsDAF1基因为编码如SEQIDNO.1所示氨基酸序列的核苷酸序列。实施例1、水稻雄性不育株系创制的方法1.1创制Osdaf1-1水稻雄性不育株系本实施例中通过RNA干扰或者序列变异等常规基因工程方法获得粳稻背景野生型水稻武育粳7号又名9522的雄性不育突变体Osdaf1-1。1.2水稻育性控制蛋白基因的克隆利用本领域内技术人员清楚的水稻基因定位克隆map-basedcloning或positioncloning群体，按分子标记定位于二号染色体上的AP004771和AP004852两个BAC之间，约4188kb。在此基础上，利用高通量测序及RGAPRiceGenomeAnnotationProject网站对该区域内基因的注释分析，测序确定其中一个水稻雄性生殖发育控制蛋白OsDAF1基因发生突变图2A。1.3水稻育性控制蛋白基因OsDAF1的点突变本实施例的OsDAF1突变材料是由常规粳稻品种武育粳7号又名9522经过常规基因工程方法获得后，经过图位克隆和测序分析比较，发现水稻雄性生殖发育控制蛋白OsDAF1的关键氨基酸缺失会使得水稻雄性生殖器官不能正常发育，造成植株不育。全核苷酸序列分析结果表明：水稻雄性育性OsDAF1基因全长为2240bpSEQIDNO.16，包含调控区和内含子。经软件分析和cDNA克隆，其ORF如SEQIDNO.2所示，编码全长为695个氨基酸的水稻雄性生殖发育控制蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。通过测序和序列对比发现，相比于野生型序列SEQIDNO.2，突变体Osdaf1-1发生了15个碱基对缺失其序列如SEQIDNO.3所示。具体突变类型为在激酶结构域Kinasedomain上缺失15个碱基导致关键氨基酸缺失图2B。图2为OsDAF1基因定位、结构和突变位点示意图；其中，图2A为OsDAF1基因定位示意图，Chr.2表示基因位于2号染色体上；小箭头上方标记的数字和字符为重组子和群体数目及所用InDel标记名称；以“AP”开头的数字为BAC克隆名称；4188kb表示Y3’和YH42-5两个InDel标记之间的物理距离；最下方表示利用高通量测序在4188kb范围内定位到的基因OsDAF1的位置；图2B为基因结构及突变位点示意图。1.4通过CRISPR-CAS9手段敲除水稻品种中的OsDAF1创制Osdaf1-3水稻雄性不育株系为了对OsDAF1蛋白进行应用，构建了OsDAF1基因CRISPR-CAS9敲除的载体，并转化野生型9522植株，从而敲除或降低OsDAF1的表达，达到改变水稻育性的目的。参考文献Xieetal.BoostingCRISPRCas9multiplexeditingcapabilitywiththeendogenoustRNA-processingsystem.Proc.Natl.Acad.Sci.112,3570–35752015中的方法，用两对引物如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8以质粒pGTR为模板，分别扩增出两段序列。L5AD5-F:5’CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCAACAAAGCACCAGTGG3’SEQIDNO.5OsDAF1-CRI82-R:5’CGGGTCTCAGCCGAGGAAAGTTGCACCAGCCGGG3’SEQIDNO.6OsDAF1-CRI82-F:5’TAGGTCTCCCGGCGCTTCCAAGTTTTAGAGCTAGAA3’SEQIDNO.7L5AD5-R:5’TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAACAAAAAAAAAAGCACCGACTCG3’SEQIDNO.8混合两段序列，以限制性内切酶Bsa1和T7连接酶进行边切边连。产物作为模板,以引物如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10扩增出tRNA连接gRNA的片段。S5AD5-F:5’CGGGTCTCAGGCAGGATGGGCAGTCTGGGCA3’SEQIDNO.9S5AD5-R:5’TAGGTCTCCAAACGGATGAGCGACAGCAAAC3’SEQIDNO.10Fok1限制性内切酶处理该片段后，插入Bsa1处理后的pRGEB32载体中，测序验证后成功构建pRGEB32-OsDAF1质粒，转化根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105。将含有pRGEB32-OsDAF1构建的农杆菌在含有Kan50μgμl的YEB平板上划线，获的单菌落。挑单菌落接种到3ml含Kan和rif抗生素的YEB液体培养基中于28℃振荡培养过夜，第2天按1％接种量转接入50ml含抗生素的YEB液体培养基中，200rpm继续振荡培养至OD600为0.3至0.6左右时，将新鲜的农杆菌菌液于5000rpm、离心5分钟，收集并重悬于13体积的AAM-AS液体培养基中，此时即可用于转化水稻各种受体材料。本实施例采用常规的农杆菌转化方法转化水稻9522的幼穗愈伤。取幼穗分化形成后穗长约3-5cm的小穗进行诱导，N6D2培养基上诱导愈伤组织，在26±1℃、避光条件下培育，15天后继代，培养8天后可用于转化。将愈伤浸泡入新鲜的AAM农杆菌菌液中并不时摇动，20分钟后将水稻材料移出，在无菌滤纸上吸去过多的菌液，随即转移到N6D2C培养基上，于26℃共培养3天。共培养时，在共培养培养基中加入乙酰丁香酮，使用浓度为100μML。3天后，从共培养培养基上取出愈伤组织，切去胚芽并转入含有50mgL潮霉素和特美汀的选择培养基上进行选择培养。12天后将抗性愈伤组织转到含有50mgL潮霉素和特美汀的选择培养基上继续筛选。12天后生长旺盛的抗性愈伤组织转移到分化培养基上培养两周左右24小时光照，代绿芽点长出后更换新的分化培养基继续分化培养至有芽长出。再生的小苗在12M培养基上生根壮苗，随后移入人工气候室营养液栽培。阳性植株提取叶片总DNA，用鉴定引物测序鉴定成功敲除OsDAF1的转基因植株Osdaf1-3，使常规水稻品种中如SEQIDNO.2所示核苷酸序列突变为SEQIDNO.11，使常规水稻品种中如SEQIDNO.1所示氨基酸序列移码并提前终止，突变为SEQIDNO.12，进而获得Osdaf1-3水稻雄性不育株系。从表型上来看，Osdaf1-3突变体在成熟时期，花药偏小图1C,进行碘染发现，正常的花粉粒很少且花粉形态不正常图1G，1K，而野生型的花粉碘染及花粉形态正常图1E，1I，这说明OsDAF1基因敲除后使花粉的发育受到影响，能够获得新的水稻雄性不育系。1.5OsDAF1蛋白关键氨基酸缺失或移码提前终止导致水稻雄性发育异常，花粉形态异常对Osdaf1突变体植株的形态学观察。如图1，野生型9522花药发育正常，而Osdaf1-1和Osdaf1-3突变型花药变小图1A，1B，1C；野生型9522碘染正常图1E，大部分Osdaf1-1和Osdaf1-3突变型花粉碘染不正常图1F，1G，部分能碘染上的花粉结构也不正常图1J，1K。1.6OsDAF1表达特征利用Osdaf1突变株的来源亲本9522各个器官组织，提取RNA，进行反转录得到cDNA第一链，利用荧光定量PCR的方法确定OsDAF1基因的表达模式图3，发现OsDAF1基因在水稻中是广泛表达的，在根、茎、叶、雌蕊和不同发育时期的花药中都有表达。在水稻雄性生殖发育时期花药的Stage8至Stage10显著表达。1.7OsDAF1基因在创制其他水稻品系雄性不育株系中的应用将Osdaf1突变体与籼稻广陆矮4号、9311、龙特甫4号水稻品系杂交，在F2代中具有籼型特征的植株中均出现了雄性不育株系，符合3:1分离规律，进而证明OsDAF1基因在其他水稻品种中发生核苷酸序列变化时，同样可以产生雄性不育植株。实施例2、Osdaf1突变体在水稻制种中的用途将Osdaf1突变体作为母本与三系或两系杂交组合中的不育亲本杂交，得到F1代。在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株，将所筛选的植株与原不育亲本对应的保持系杂交。再次在F2代中筛选同时具有雄性不育及不育特征的植株与保持系杂交，经多代杂交筛选后获得新的雄性不育系，适宜作为杂交组合中的母本。实施例3、恢复Osdaf1突变体雄性不育性状的方法将编码OsDAF1基因的基因组核苷酸序列转入突变体Osdaf1突变体植株，能够使突变体恢复到野生型表型。从野生型9522幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，用引物：OsDAF1gDNAF:5’GCAGGCATGCAAGCTTCTCAACATCTGGCTTCAGTTGA3’SEQIDNO.13OsDAF1gDNAR:5’ATTCGAGCTGGTCACCAGAGAGCAGGTAATATCTGGAAT3’SEQIDNO.14扩增出OsDAF1基因如SEQIDNO.15所示的7234bp的基因组序列片段；将该片段通过大连宝生物公司的In-Fusion转化体系将扩增的DNA片段插入到用于转化水稻的双元载体pCAMBIA1301载体中；测序验证正确，该载体通过电击导入根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105，得到OsDAF1互补构建根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105，使用遗传转化手段转化突变体Osdaf1突变体营养生殖生长期的幼穗愈伤，从而使编码如SEQIDNO.1所示氨基酸的核苷酸SEQIDNO.15转入水稻细胞，并且整合到水稻细胞的染色体上；再生，获得水稻植株；以观察是否会使突变体恢复到野生型表型。T0代获得互补植株，图1显示T0代互补植株花药正常图1D，可以产生花粉，并被I2KI染色图1H，并且花粉形态正常图1L即表现出的野生型表型。综上所述，本发明通过控制编码水稻凝集素受体激酶的OsDAF1基因及其编码蛋白获得水稻雄性生殖发育异常的变异株，实现控制水稻雄性生殖发育和育性；本发明获得的水稻突变体在营养生长时期与来源亲本无明显差异，进入生殖生长阶段后，雄性生殖器官发育异常，花粉败育引起植株不育，在农业生产上具有十分重要的应用。以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变化或修改，这并不影响本发明的实质内容。在不冲突的情况下，本申请的实施例和实施例中的特征可以任意相互组合。序列表上海交通大学雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法DAG3820116PatentInversion3.51695PRT水稻（Oryzasativa）1MetProProArgCysArgArgLeuProLeuLeuPheIleLeuLeuLeu151015AlaValArgProLeuSerAlaAlaAlaAlaSerSerIleAlaAlaAla202530ProAlaSerSerTyrArgArgIleSerTrpAlaSerAsnLeuThrLeu354045LeuGlySerAlaSerLeuLeuProGlyAlaAlaGlyValAlaLeuThr505560ThrProSerArgAspGlyValGlyAlaGlyArgAlaLeuPheSerGlu65707580ProValArgLeuLeuLeuProGlnAspAlaAlaAlaSerAlaSerAla859095SerArgAlaAlaThrProAlaSerPheSerThrArgPheThrPheArg100105110IleThrProSerProThrTyrGlyAspGlyLeuAlaPheLeuLeuThr115120125SerSerArgThrPheLeuGlyAlaSerAsnGlyPheLeuGlyLeuPhe130135140ProSerSerSerAlaSerAspGluGlyGluLeuArgAspValSerThr145150155160ValAlaValGluIleAspThrHisLeuAspValAlaLeuHisAspPro165170175AspGlyAsnHisValAlaLeuAspAlaGlySerIlePheSerValAla180185190SerAlaGlnProGlyValAspLeuLysAlaGlyValProIleThrAla195200205TrpValGluTyrArgAlaProArgArgArgLeuAsnValTrpLeuSer210215220TyrSerProSerArgArgProGluLysProAlaLeuSerAlaAspVal225230235240AspLeuSerGlyLeuLeuArgThrTyrMetTyrAlaGlyPheSerAla245250255SerAsnGlyAsnGlyAlaAlaLeuHisValValGluArgTrpThrPhe260265270ArgThrPheGlyPheProAsnSerSerTyrAlaProProProThrLys275280285TyrIleGlyProMetProProAsnAsnGlnProLeuProProProPro290295300SerProSerProSerProProProProSerProProProProProHis305310315320ProAsnHisArgArgArgHisLeuPheTyrLysValLeuGlyGlyVal325330335LeuGlyGlyMetValLeuLeuGlyLeuValValValGlySerAlaVal340345350LeuLeuGlyArgSerValArgArgLysAsnGlnGluHisAlaValAla355360365SerGluAspMetGlyGluAlaThrLeuSerMetGluValAlaArgAla370375380AlaThrLysGlyPheAspSerGlyAsnValIleGlyValGlyGlySer385390395400GlyAlaThrV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权利要求：1.一种雄性不育基因OsDAF1，其特征在于，所述雄性不育基因OsDAF1的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.如权利要求1所述的雄性不育基因OsDAF1，其特征在于，所述雄性不育基因OsDAF1的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。3.一种根据权利要求1所述的雄性不育基因OsDAF1的应用，其特征在于，所述应用为：采用常规方法敲除、改变或抑制OsDAF1基因，使得常规水稻品种中的OsDAF1基因表达水平降低或丧失，进而获得水稻雄性不育株系。4.一种水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，包括如下步骤：对常规水稻品种进行处理、培育，即得所述水稻雄性不育株系；所述处理为：采用常规基因工程方法或CRISPR-CAS9基因编辑方法，使得水稻中编码如SEQIDNO.1所示氨基酸的核苷酸序列发生缺失、变异或抑制，进而使得所述氨基酸序列对应多肽的表达水平降低或活性丧失。5.如权利要求4所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。6.如权利要求4所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述处理的具体方法为：采用常规基因工程方法，使常规水稻品种中如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列突变为如SEQIDNO.4所示的氨基酸序列。7.如权利要求4所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述处理的具体方法为：采用CRISPR-CAS9方法，使常规水稻品种中如SEQIDNO.1所示的氨基酸序列移码并提前终止，突变为如SEQIDNO.12所示的氨基酸序列。8.如权利要求4或7所述的水稻雄性不育株系创制的方法，其特征在于，所述CRISPR-CAS9基因编辑方法中CRISPR-CAS9基因编辑载体的构建方法包括如下步骤：A1、选择OsDAF1基因编码区序列如SEQIDNO.2所示核苷酸序列的第393位至第413位共20bp的特异性片段为靶标位点；A2、基于现有方法，采用两对如SEQIDNO.5和SEQIDNO.6，SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的序列作为引物，以质粒pGTR为模板，分别扩增出两段序列；混合两段序列，以限制性内切酶Bsa1和T7连接酶进行边切边连；产物作为模板，以如SEQIDNO.9和SEQIDNO.10所示的序列作为引物，扩增出tRNA连接gRNA的片段，Fok1限制性内切酶处理该片段后，插入Bsa1处理后的pRGEB32载体中，测序验证后成功构建pRGEB32-OsDAF1质粒，转化根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105。9.一种水稻不育株系在水稻制种中的用途，其特征在于，以如权利要求3所述应用获得的水稻雄性不育株系作为母本，配合具有杂交优势的父本，生产杂种F1代，进行杂交育种。10.一种恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用遗传手段将所述OsDAF1基因转入如权利要求4所述方法获得的水稻雄性不育株系，进而使得突变体恢复野生型表型。11.如权利要求10所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得；其中OsDAF1互补构建含有编码如SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。12.如权利要求10所述的恢复水稻雄性不育株系的雄性不育性状的方法，其特征在于，所述方法的具体步骤为：B1、从野生型水稻幼苗叶片中提取基因组DNA作为模板，采用碱基序列如SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所示的引物，扩增出OsDAF1基因的如SEQIDNO.15所示的7234bp的基因组序列片段；B2、提供携带表达OsDAF1互补构建载体的根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105；其中，所述OsDAF1互补构建含有如SEQIDNO.15所示的核苷酸序列；B3、将含OsDAF1互补构建的根癌农杆菌AgrobacteriumtumefaciensEHA105转入所述水稻雄性不育株系，培育，即得。

百度查询： 上海交通大学 雄性不育基因OsDAF1的应用及恢复水稻雄性不育的方法

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