申请/专利权人：皇家学习促进会/麦吉尔大学;蒙特利尔大学

申请日：2015-09-21

公开（公告）日：2020-11-20

公开（公告）号：CN107533049B

主分类号：G01N33/53(20060101)

分类号：G01N33/53(20060101);C12M1/34(20060101);C12N15/62(20060101);C12Q1/02(20060101);C12Q1/66(20060101);G01N33/58(20060101)

优先权：["20140919 US 62/052,738"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.20#授权;2018.01.26#实质审查的生效;2018.01.02#公开

摘要：公开了用于评估蛋白如受体和其他生物分子如第二信使的胞内定位、内化和运输至细胞区室的生物发光共振能量转移BRET生物传感器。这些依赖于细胞区室中BRET供体和受体的浓度密度而非特异性蛋白‑蛋白相互作用的生物传感器使用海肾GFPLucBRET对，其允许稳健和可再现地监测蛋白运输定位，具有与高通量筛选HTS相适应的灵敏性。还公开了这些生物传感器用于各种应用的用途，包括评估监测蛋白的胞吞作用、回收和胞内运输、通过药物分子伴侣的受体成熟拯救、各种胞吞作用胞吐作用过程、激活抑制以及不同细胞区室中的生物分子浓度密度。

主权项：1.一种用于评估感兴趣的蛋白的运输和或定位的生物传感器，其包括：第一组件，所述第一组件包括用海肾Renilla绿色荧光蛋白海肾GFP或海肾Renilla荧光素酶蛋白海肾Luc标记的所述感兴趣的蛋白；第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分，其中所述细胞区室靶向部分是：i质膜PM靶向部分，PM靶向部分包括氨基酸序列MGCIKSKGKDSSEQIDNO:1、氨基酸序列GKKKKKKSKTKCVIMSEQIDNO:7、氨基酸序列CMSCKCVLSSEQIDNO:47、氨基酸序列CMSCKCCILSEQIDNO:43或氨基酸序列SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKSSEQIDNO:8；或ii内体靶向部分，所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白的第739～806位残基SEQIDNO:20，其中，如果所述感兴趣的蛋白用所述海肾GFP标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述感兴趣的蛋白用所述海肾Luc标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。

全文数据：用于监测细胞中生物分子的定位和运输的生物传感器[0001]相关申请的交叉引用[0002]本申请要求于2014年9月19日提交的美国临时申请号62052,738的权益，其通过引用全文并入本文。技术领域[0003]本发明一般地涉及生物分子如蛋白质的定位、运输和运输，例如受体和效应物的细胞表面受体胞吞作用、回收和胞内运输的评估监测。背景技术[0004]蛋白运输是蛋白质从细胞的一个区域至另一个区域的重定位的活动过程。膜和其蛋白组件通过具有多组件和途径的机制被不断地移位。调节细胞表面受体如G蛋白偶联受体GPCR和表皮生长因子受体EGFR的活性的机制之一是通过受体胞吞作用。对于GPCR，配体诱导的受体胞吞作用可以驱动受体通过特化的区室如披网格蛋白小泡（clathrin-coatedvesicles从PM移除，这与胞吞衔接体adaptorβ-抑制蛋白至相配的受体的募集有关Claing，Lap〇rte等人.2002。可以将内化受体引导至分开的溶酶体途径和回收途径，产生对通过异源三聚体G蛋白的细胞信号传导的强度和持续时间的本质上相反的作用，并且可以通过β-抑制蛋白的信号传导骨架促进来自细胞内膜的不同的信号传导事件Hanyaloglu和vonZastrow2008;Posner和Laporte2010。已经提出了促进GPCRβ-抑制蛋白复合体的胞内靶向的药物的治疗优势，同时对于某些受体来说，其回收至PM对充分保持生理响应也是必要的。[0005]因此，用于监测受体运输的简单可靠的系统对于研究受体胞吞的机制和开发作用于细胞表面受体如GPCR的有效治疗剂是关键的。例如，血管紧张素II1型受体ATlR吸引了药物开发的重点关注，这是因为其与心血管疾病包括高血压、肥大、纤维化和动脉粥样硬化的发展有关，以及具有心脏保护功能的配体也可以促进受体和胞内ATlRβ-抑制蛋白信号传导复合物的内化。因此，开发以定量和高效方式有效评估药物诱导受体如GPCR的内化的倾向可以产生巨大的优势。[0006]本描述参考许多文献，所述文献的内容通过引用全文并入本文。发明内容[0007]本发明涉及以下的1至73个项目：[0008]1.用于评估感兴趣的蛋白的运输和或定位的生物传感器，包括：[0009]第一组件，所述第一组件包括用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的所述感兴趣的蛋白；[0010]第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分；[0011]其中如果所述第一蛋白用所述海肾GFP标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述第一蛋白用所述海肾Luc标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。[0012]2.项目1所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白用所述海肾Luc标记，所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。[0013]3.项目1或2所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽、β-抑制蛋白多肽、细胞表面受体或G蛋白亚基多肽。[0014]4.项目3所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽。[0015]5.项目3所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白是细胞表面受体。[0016]6.项目5所述的生物传感器，其中所述细胞表面受体是G蛋白偶联受体GPCR。[0017]7.项目1至6中任一项所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是质膜PM靶向部分、内体靶向部分、高尔基体靶向部分、溶酶体靶向部分、过氧化物酶体靶向部分、自噬体靶向部分、核糖体靶向部分、线粒体靶向部分、细胞骨架靶向部分或细胞核靶向部分。[0018]8.项目7所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是质膜PM靶向部分。[0019]9.项目8所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分是定位于PM中的PM蛋白或其片段。[0020]10.项目9所述的生物传感器，其中所述PM蛋白或其片段包括a棕榈酰化信号序列、豆蔻酰化信号序列和或异戊烯化信号序列，和或b多碱序列。[0021]11.项目10所述的生物传感器，其中所述棕榈酰化信号序列和或豆蔻酰化信号序列来自人Src家族激酶Lyn。[0022]12.项目11所述的生物传感器，其中所述PM祀向部分包括氨基酸序列MGCIKSKGKDSSEQIDN0:1〇[0023]13.项目12所述的生物传感器，其中所述多碱序列和异戊烯化信号序列来自人KRAS剪接变体b。[0024]14.项目13所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列GKKKKKKSKTKCVIMSEQIDN0:7〇[0025]15.项目10所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和异戊烯化信号序列。[0026]16.项目15所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCVLSSEQIDN0:47。[0027]17.项目10所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和来自Rail的异戊烯化信号序列。[0028]18.项目17所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCCILSEQIDN0:43。[0029]19.项目9所述的生物传感器，其中所述PM蛋白或其片段是小窝蛋白Ια。[0030]20.项目10所述的生物传感器，其中所述PM祀向多碱序列来自人GRK5。[0031]21.项目20所述的生物传感器，其中所述PM靶向部分包括氨基酸序列SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKSSEQIDN0:8〇[0032]22.项目8至21所述的生物传感器，其中⑴所述PM靶向部分包括来自人Src家族激酶Lyn的棕榈酰化信号序列和或豆蔻酰化信号序列，并且所述PM祀向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端，或（ii所述PM靶向部分包括a来自人KRAS剪接变体b或HRAS的多碱序列和异戊烯化信号序列；（b来自HRAS的棕榈酰化序列和来自Rail的异戊烯化信号序列；（c小窝蛋白Ia或其片段;或d来自人GRK5的多碱序列，并且所述PM祀向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。[0033]23.项目7所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是内体靶向部分。[0034]24.项目23所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分是定位于内体的内体蛋白或其片段。[0035]25.项目24所述的生物传感器，其中所述内体蛋白或其片段包括FYVE域。[0036]26.项目23至25中任一项所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白（endofin的FYVE域。[0037]27.项目26所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白的第739〜806位残基（SEQIDNO:20。[0038]28.项目23所述的生物传感器，其中所述内体蛋白或其片段是Rab蛋白或其片段。[0039]29.项目28所述的生物传感器，其中所述Rab蛋白是Rab4或Rab11。[0040]30.项目23至29中任一项所述的生物传感器，其中所述内体靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。[0041]31.项目23至30中任一项所述的生物传感器，其中所述感兴趣的蛋白融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端。[0042]32.项目7所述的生物传感器，其中所述细胞区室靶向部分是高尔基体靶向部分。[0043]33.项目32所述的生物传感器，其中所述高尔基体靶向部分是定位于高尔基体的尚尔基体蛋白或其片段。[0044]34.项目33所述的生物传感器，其中所述高尔基体革El向部分是定位于高尔基体的eNOSl或其片段。[0045]35.项目34所述的生物传感器，其中所述高尔基体靶向部分包括人eNOSl的第1〜73位残基（SEQIDN0:42。[0046]36.项目1至35中任一项所述的生物传感器，其中所述第一组件和第二组件通过柔性接头共价连接。[0047]37.项目36所述的生物传感器，其中所述柔性接头是约50〜约500个氨基酸的多肽。[0048]38.项目37所述的生物传感器，其中所述柔性接头是约300个氨基酸的多肽。[0049]39.编码项目1至38中任一项所述的生物传感器的第一组件和或第二组件的核酸。[0050]40.包括项目39所述的核酸的载体。[0051]41.表达项目1至38中任一项所述的生物传感器的宿主细胞。[0052]42.用于确定试剂是否调节感兴趣的蛋白在细胞中运输的方法，所述方法包括:测量在存在和不存在所述试剂的情况下项目1至38中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；[0053]其中相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下的所述BRET信号的差异表明所述试剂调节所述感兴趣的蛋白在所述细胞中的运输。[0054]43.用于确定试剂是否诱导感兴趣的细胞表面受体在细胞中的内化的方法，所述方法包括:测量在存在和不存在所述试剂的情况下项目8至22中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；[0055]其中相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下更低的BRET信号表明所述试剂诱导感兴趣的细胞表面受体的内化。[0056]44.用于评估在细胞表面的感兴趣的内化受体的回收的方法，所述方法包括：[0057]a在诱导所述受体的内化的配体存在的情况下，使包括PM靶向部分的如本文定义的第一生物传感器和第二生物传感器接触；[0058]b在所述接触之后，测量第一生物传感器中的BRET信号；[0059]C洗涤第二生物传感器以移除所述配体；[0060]d在所述洗涤之后，测量第二生物传感器中的BRET信号;和[0061]e通过比较第一生物传感器和第二生物传感器中的BRET，确定细胞表面的感兴趣的内化受体的回收，[0062]其中，相对于所述第一生物传感器，所述第二生物传感器中更高的BRET信号表明在细胞表面的感兴趣的内化受体的回收。[0063]45.项目44所述的方法，进一步包括在洗涤之后的不同时间重复步骤d和e，以研究感兴趣的内化受体的回收的动力学。[0064]46.用于确定试剂是否诱导内体区室的感兴趣的细胞表面受体的运输的方法，所述方法包括:测量在所述试剂存在和不存在的情况下项目23至31中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；其中相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下更高的BRET信号表明所述试剂诱导所述内体区室中的所述感兴趣的细胞表面受体的运输。[0065]47.项目46所述的方法，其中所述方法使用多种生物传感器进行，并且其中所述生物传感器中的每一种包括不同的内体靶向部分。[0066]48.用于确定试剂是否充当感兴趣的受体的药物分子伴侣（pharmacologicalchaperone的方法，所述方法包括:测量在存在和不存在所述试剂的情况下项目8至22中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；其中相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下更高的BRET信号表明所述试剂充当所述感兴趣的受体的药物分子伴侣。[0067]49.用于确定试剂是否充当感兴趣的受体的药物分子伴侣的方法，所述方法包括：[0068]提供生物传感器，其包括：用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白海肾Luc标记的所述感兴趣的受体；以及用所述海肾GFP或海肾Luc标记的内质网（ER靶向部分;其中如果所述受体用所述海肾GFP标记，则所述ER靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述受体用所述海肾Luc标记，则所述ER靶向部分用所述海肾GFP标记；以及[0069]测量在存在和不存在所述试剂的情况下BRET受体信号；[0070]其中相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下BRET信号的降低表明所述试剂充当所述受体的药物分子伴侣。[0071]50.项目48或49所述的方法，其中所述受体是突变的受体。[0072]51.项目48至50中任一项所述的方法，其中所述受体是G蛋白偶联受体GPCR。[0073]52.项目51所述的方法，其中所述GPCR是黑皮质素4受体MC4R或血管升压素2受体V2R。[0074]53.项目48至52中任一项所述的方法，其中所述受体是离子通道。[0075]54.项目53所述的方法，其中所述离子通道是电压门控钾通道。[0076]55.项目54所述的方法，其中所述电压门控钾通道是hERG。[0077]56.项目48至55中任一项所述的方法，其中所述受体用所述海肾Luc标记，所述PM靶向部分或ER靶向部分用所述海肾GFP标记。[0078]57.项目48至56中任一项所述的方法，其中所述PM靶向是项目9至22中任一项所限定的PM革E向部分。[0079]58.用于确定试剂是否诱导β-抑制蛋白募集至质膜的方法，所述方法包括：[0080]提供包括细胞或膜制备物的生物传感器，所述细胞或膜制备物包括：用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的所述β-抑制蛋白；用海肾GFP或海肾Luc标记的质膜PM靶向部分；以及GPCR;其中如果所述β-抑制蛋白用所述海肾GFP标记，则所述PM靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述β-抑制蛋白用所述海肾Luc标记，则所述PM祀向部分用所述海肾GFP标记；以及[0081]测量在存在和不存在所述试剂的情况下BRET受体信号；[0082]其中相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下BRET信号的提高表明所述试剂诱导抑制蛋白募集至质膜。[0083]59.项目58所述的方法，其中所述β-抑制蛋白用所述海肾Luc标记。[0084]60.项目58或59所述的方法，其中所述PM靶向部分PM祀向是项目9至22中任一项所限定的PM革E向部分。[0085]61.用于评估在第一条件和第二条件之间调节细胞区室的生物分子的量的方法，所述方法包括：[0086]提供生物传感器，所述生物传感器包括:第一组件，所述第一组件包括用结合于所述生物分子的蛋白标记物标记的海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP;以及第二组件，所述第二组件包括用所述蛋白标记物标记的海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc;[0087]测量所述第一条件和第二条件下的BRET受体信号；[0088]其中BRET信号在所述第一条件和第二条件之间的差异表明在所述第一条件和第二条件之间调节所述细胞区室的所述生物分子的量。[0089]62.项目61所述的方法，其中所述第一条件是存在试剂，所述第二条件是不存在所述试剂。[0090]63.项目61或62所述的方法，其中所述生物分子是磷脂。[0091]64.项目63所述的方法，其中所述磷脂是4，5-二磷酸磷脂酰肌醇PIP2。[0092]65.项目64所述的方法，其中所述蛋白标记物包括普列克底物蛋白同源PH域。[0093]66.项目65所述的方法，其中所述PH域是ΡΙΧδΙ的PH域。[0094]67.项目61或62所述的方法，其中所述生物分子是第二信使。[0095]68.项目67所述的方法，其中所述第二信使是二酰甘油DAG。[0096]69.项目68所述的方法，其中所述蛋白标记物包括佛波酯二酰甘油结合域。[0097]70.项目69所述的方法，其中所述蛋白标记物包括佛波酯PKCClb的二酰甘油结合域。[0098]71.项目70所述的方法，其中所述蛋白标记物包括SEQIDΝ0:72的氨基酸序列。[0099]72.项目42至71中任一项所述的方法，其中所述BRET信号使用酶标仪或通过显微镜检查法测量。[0100]73.项目1至38中任一项所述的生物传感器或项目42至71中任一项所述的方法，其中海肾（RenillaLuc是海肾（Renillareniformis焚光素酶IIRlucII和或所述海肾Reni11aGFP是海肾（RenillareniformisGFPrGFP。[0101]在阅读仅参照附图通过举例的方式提供的以下具体实施方式的非限制性描述时，本发明的其他目的、优势和特征会变得更明显。附图说明[0102]在附图中：[0103]图IA至图IF显示了基于生物发光能量共振移位BRET的GPCR胞吞作用传感器的产生。图IA至图1C:用于评估监测GPCR胞吞作用的基于BRET的传感器的三种构型。为了监测质膜中的受体图1A和β-抑制蛋白（图1C的量，通过在rGFP的N端标记Iyn激酶的酰化部分MGCIKSKGKDS在质膜中锚定rGFP。图1B、图1C:为了检测受体（图1B或β-抑制蛋白（图1C对内体的革巴向，使连接于（tether内体中的传感器的内体相关蛋白的FYVE域第739至第806位氨基酸融合于rGFP的C端。使表达lyn-rGFP图1D或rGFP-内体相关蛋白FYVE图1E的HEK293SL细胞经受共聚焦荧光显微镜检查法。表达rGFP-内体相关蛋白FYVE的细胞用500nM渥曼青霉素处理40分钟（图IE，右图）。比例尺ΙΟμπι。图1F:受体胞吞时，受体、lyn-rGFP和FYVE域的同时可视化。用B2R-CFP、lyn-rGFP和mCherry-内体相关蛋白FYVE瞬时转染HEK293SL细胞。图IF的上图显示了基态，下图显示了缓激肽诱导B2R胞吞作用。比例尺ΙΟμπι。图IG:mCherry标记的内体相关蛋白FYVE传感器的变体还与位于EE的Rab5共定位。[0104]图2A至图2F显示了通过BRET测量的剂量和时间依赖性的ATlR胞吞作用。图2A:用ATIR-RlucII连同Iyn-GFPlO□或lyn-rGFP—起转染HEK293SL细胞。用各种浓度的AngII温育细胞40分钟，然后如“材料与方法”部分描述的测量BRET。图2B:用ATIR-RlucII连同GFPlO-内体相关蛋白FYVE或rGFP-内体相关蛋白FYVE—起转染HEK293SL细胞。图2C:用ATlR和ferr2-RlucII连同GFPlO-内体相关蛋白FYVE或rGFP-内体相关蛋白FYVE—起转染HEK293SL细胞。在37°C下将ATIR-RlucII连同lyn-rGFP图2D或rGFP-内体相关蛋白FYVE图2E—起转染的细胞在存在或不存在IOOnMAngII的情况下温育指定的时间，然后测量BRETARET比改变表示为对照无AngII处理组中观察到的BRET比的百分比。数据表示为来自2〜6次独立实验的平均值±S.E.。图2F:将图2D和2E中的数据分别标准化为最大响应，并绘制在一起。[0105]图3A至3F显示了阻止β-抑制蛋白2的受体胞吞作用和过表达对AngII诱导的BRET改变的作用。用ATIR-RlucIIlyn-rGFP图3Α、ATlR-RlucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE图3B或ATlRferr2-RlucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE图3C，连同pcDNA或动力蛋白K44A—起转染HEK293SL细胞。在不存在对照，;DynK44A，〇）或存在0.45M蔗糖（▲的情况下温育细胞20分钟，然后用各种浓度的AngII刺激40分钟，然后进行BRET测量。用ATIR-RLucIIlyn-rGFP图3D或ATIR-RlucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE图3E，连同pcDNA或β-抑制蛋白2—起转染HEK293SL细胞。图3F:在存在小泡酸化抑制剂巴弗洛霉素ABaf和氯喹CQ的情况下的ATlR的胞吞作用。用各种浓度的AngII温育细胞40分钟，然后进行BRET测量。显示的值是来自至少三次独立实验的平均值土S.E.。[0106]图4A至图4E显示了用具有各种受体的胞吞作用BRET生物传感器获得的剂量响应曲线。图4A:用Iyn-rGFP连同ATIR-RLucII、B2R-RlucII、V2R-RLucII或^AR-RlucII—起转染HEK293SL细胞。图4B:用rGFP-内体相关蛋白FYVE连同ATlR-RlucIKBSR-RLucIKVSR-RlucII或feAR-RlucII—起转染HEK293SL细胞。在37°C下将细胞与图中描述的各种浓度的各自的同源配体温育30分钟（图4A或40分钟（图4B，然后测量BRET。图4C:用ferr2-RlucII和rGFP-内体相关蛋白FYVE连同六111?、821?、¥21?、02六1^奸?受体构建体一起转染册129351^细胞。将细胞与各种浓度的各自的同源配体温育40分钟，然后进行BRET测量。用于各种受体的同源配体如下:ATlR、AngII正方形）；B2R，缓激肽BK，三角形）；V2R，AVP圆圈）或催产素0T，星形）；feAR，异丙肾上腺素（IS0,倒三角形）；FP，PGF2a菱形）。（a至（c的数据表示为2-3次独立实验的平均值土S.E.。图4D:通过RlucII-GRB2和rGFP-内体相关蛋白FYVE之间的BRET监测EGFR胞吞作用（GRB2与EGFR相互作用，并且参与EGFR内化）。用EGFR连同RLucII-GRB2和rGFP-内体相关蛋白FYVE—起转染HEK293SL细胞。将细胞在37°C下与各种浓度的EGFR温育30分钟，然后测量BRET。图4D的结果是两次独立实验中的一个代表性实验的一式三份的平均值±SE。图4E:作为对高通量筛选HTS测定的稳健性robustness的指标的Z’因子的评估。用ATIR-RLucII1yn-rGFP、ATIR-RLucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE或AT1Rβarr2-RlucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE共转染HEK293,并将该HEK293铺在48孔板中，在37°C下用IOOnMAngII刺激20分钟，使受体从质膜中脱离并在内体中积累受体和β抑制蛋白2两者。用BRET2评价细胞表面受体胞吞作用。在给出的图中BRET值按每孔表示，评价AngII处理组的Z’因子分别高于0.64、0.73和0.79,这说明了对内体中受体内化的稳健的测定。[0107]图5A至图5C显示通过胞吞作用BRET测定监测配体移除后的受体回收。图5A:用ATIR-RlucII连同lyn-rGFP—起转染HEK293SL细胞。在不存在对照）或存在IOOnMAngII的情况下，温育细胞30分钟，然后洗涤细胞，进一步在不存在AngII的情况下温育细胞45分钟。BRET比改变表示为对照无AngII处理组中观察到的BRET比的百分比。数据表示为来自4次独立实验的平均值土S.E.。图5B:使表达lyn-rGFP以及V2R-RlucII、B2R-RlucII、ATlR-RlucII或f32AR-RlucII的HEK293SL细胞经历如图5A描述的受体回收，及它们的同源配体：IOOnMAVP用于V2R，IOOnMBK用于B2R，IOOnMAngII用于ATlR和ΙμΜISO用于02AR。受体回收表示为配体洗去后45分钟的BRET比的增加百分比。所有值表示为来自3〜4次独立实验的平均值土S.E.。图5C:用ATIR-RlucII连同rGFP-内体相关蛋白FYVE—起转染HEK293SL细胞。在不存在对照或存在IOOnMAngII的情况下温育细胞30分钟，然后洗涤细胞，进一步在不存在AngII的情况下温育细胞45分钟。BRET比改变表示为对照无AngII处理组中观察到的BRET比的百分比。数据表示为来自3次独立实验的平均值土S.E.。[0108]图6A至图6F显示了AngII类似物对ATlR运输和分选的作用。图6A:使表达ATlR-RLucIIrGFP内体相关蛋白FYVE的HEK293SL细胞与IOOnMAngII正方形）、IOOnMSI三角形或ΙμΜDVG圆圈）温育指定的时间，然后测量BRET。使BRET比按最大AngII响应60分钟）作为100%以及基础值无配体作为0%来标准化。数据表示为来自至少三次独立实验的平均值土S·E·。用ATIR-RlucIIlyn-rGFP图6B、ATIR-RlucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE图6C或ATlRferr2-RlucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE图6D转染HEK293SL细胞。使细胞与各种浓度的AngII正方形）、SI三角形）或DVG圆圈）温育30分钟（图6B或40分钟（图6C、图6D，然后进行BRET测量。数据表示为来自至少三次独立实验的平均值±S.E.。图6E和图6F:用ATIR-RlucII连同rGFP-rab4图6E或rGFP-rabll图6F—起转染HEK293SL细胞。使细胞与IOOnMAngII正方形）、IOOnMSI三角形）或ΙμΜDVG圆圈）温育指定的时间，然后测量BRETARET比改变表示为对照无配体处理组中观察到的BRET比的百分比。数据表示来自三次独立实验的平均值土S.E.。[0109]图7Α和图7Β显示了通过完整细胞[125I]AngII结合测定评估的ATlR内化。图7Α:用单独的ATlRD、单独的ATIR-RlucII或ATIR-RlucII连同lyn-rGFP—起（瞬时转染HEK293SL细胞。在不存在或存在IOOnMAngII的情况下在37°C下温育细胞30分钟，然后经历如“材料与方法”部分描述的完整细胞[125I]AngII结合测定。图7B:在不存在或存在IOOnMAngII的情况下在37°C下温育表达ATIR-RlucIILyn-rGFP以及pcDNA□、动力蛋白K44A或β-抑制蛋白2的HEK293SL细胞30分钟，然后经历如下（实施例1所述的完整细胞[125I]AngII结合测定。受体胞吞作用表示为细胞表面受体损失的百分比。数据表示为3次独立实验的平均值土S.E.。[0110]图8显示了V2R的高的基础内体定位。将瞬时表达V2R-YFP以及mCherry-内体相关蛋白FYVE的HEK293SL细胞进行共聚焦显微镜检查法。比例尺，ΙΟμπι。[0111]图9Α显不了rGFP_rab4和rGFP-rabl1与mCherry-FYVE的小泡定位。用rGFP_rab4左或rGFP-rabll右转染HEK293SL细胞，然后进行共聚焦显微镜检查法。[0112]图9B至图9D显示了Gaq抑制对AngII介导的ATlR内化的作用。图9B:用ATIR-RlucII连同Lyn-rGFP—起转染HEK293SL细胞。在不存在-Ubo或存在IOOnMUbo+Ubo的情况下将细胞温育30分钟，然后用各种浓度的AngII刺激细胞30分钟，然后进行BRET测量。图9C:用ATIR-RlucII连同rGFP-FYVE—起转染HEK293SL细胞。在不存在（-Ubo或存在IOOnMUbo+Ubo的情况下将细胞温育30分钟，然后用各种浓度的AngII、SI或DVG刺激细胞40分钟，然后进行BRET测量。图9D:用ATIR-RlucII连同rGFP-rab4或rGFP-rab11—起转染细胞。在不存在-Ubo或存在IOOnMUbo+Ubo的情况下温育细胞30分钟，然后用IOOnMAngII、IOOnMSI或ΙμΜDVG刺激细胞，对于rGFP-rab4，刺激细胞IOmin，对于rGFP-rabl1刺激细胞30min，然后测量BRET。BRET比改变表示为对照无配体处理组中观察到的BRET比的百分比。数据表示为来自三次独立实验的平均值土S.E.。[0113]图IOA和图IOB描述了评估功能性拯救的基于BRET的药物分子伴侣PC测定和分离（sequestration测定的原理。图10A:药物分子伴侣PC测定基于会另外被保留在不同亚细胞区室中的药物分子伴侣拯救蛋白的重定位。使用BRET，优选与具有质膜靶向序列的rGFPrGFP-CAAX、Lyn-rGFP或rGFP-PB;对于描述，见图11D—起检测和测量重定位。错误折叠的受体和通道如hERG被保留在胞内区室中，并根据药物分子伴侣介导的拯救移位到质膜。在该测定中，受体优选用RlucII标记，膜优选用rGFP标记;BRET信号与膜中的RlucII标记的蛋白的密度成比例。错误折叠的蛋白可以是突变体或WT蛋白。对于在激动剂暴露时内化的受体，可以使用图IOB中描述的激动剂诱导的分离测定评估拯救的受体的功能基本上对应于图IA中描述的基于BRET的传感器）。图10B:基于BRET的激动剂诱导的分离测定的原理。质膜PM标记物用BRET受体如GFPG标记，感兴趣的PC拯救的受体（例如，PC拯救的GPCR用BRET供体如RLucR标记。在不存在激动剂（左）的情况下，受体保持在PM，并且与BRET受体标记的PM标记物共定位，因此产生强的BRET受体信号。然而，在存在激动剂的情况下（右），受体是内化的，因此减少了PM中BRET供体标记的受体的密度，这导致BRET受体信号的减弱。可以在受体的PC介导的细胞表面拯救后在相同的孔中进行该测定，因此，它们是监测受体生物学的两个不同方面的同源测定。[0114]图IlA至图IlD显示了用于验证和优化检测药物分子伴侣特性的传感器的构建体。图IlA至图11C:开发了分子伴侣拯救测定，并用其测试用BRET供体标记的人GPCR黑皮质素受体4:hMC4R和血管升压素受体2:hV2R和电压门控钾通道H2hERG的野生型WT和天然存在的置换。受体的C端用RlucII标记。hERG通道用RlucII在第379位残基的等价位置内部地标记，第373至379位残基的序列在接头3和接头4的每侧被复制见图11C。柔性接头用于受体通道和RlucII标记之间。接头的序列在图IlA中表示为MC4R构建体接头1，在图IlB中表示为V2R构建体接头2，在图IlC中为hERG构建体接头3和4。图IlD=BRET受体rGFP用不同的质膜或高尔基体靶向序列标记:在N端标记来自Lyn激酶的棕榈酰化序列和豆蔻酰化序列Lyn-，在C端标记来自KRAS剪接变体b的多碱序列和异戊二烯化信号序列-CAAX，在C端标记来自人GRK5的多碱序列（-PB，在C端标记来自hRas的质膜靶向棕榈酰化序列和异戊二稀化信号序列，在C端标记来自hRas的质膜祀向棕榈酰化序列和来自Ral1的异戊二烯化信号序列，在C端标记人小窝蛋白Ia小窝的标记物）；以及在N端标记来自人eNOSl的高尔基体靶向序列第1至73位残基）。接头5、6和7用于rGFP与质膜靶向序列：分别为lyn、CAAX和PB之间。接头8用于rGFP与来自hRAS的棕榈酰化异戊二烯化序列（CAAX和来自hRASRail的棕榈酰化异戊二烯化序列（CAAx=CCIL之间，用于rGFP与小窝蛋白Ia之间。接头9用于来自eNOS的高尔基体靶向序列（1至73和rGFP之间。[0115]图12A和图12B显示了对靶向质膜的rGFP的两种形式的不同比（滴定）的测试。用分子伴侣DCPMPN-2R-32，4-二氯苯基-1-4-2-1-甲氧基丙-2-基氨基）甲基苯基）哌嗪-1-基-1-氧代丙-2-基丙酰胺），ΙΟμΜ或载体DMSO处理16小时后，对转染的细胞可变量的rGFP构建体+24ng的受体构建体用于96孔板的10个孔进行BRET供体至受体的滴定和PC拯救测定。用hMC4RR165Q-RlucII构建体和不同量的rGFP-CAAX图12A;以及rGFP-PB构建体（图12B转染HEK293。以GFP构建体表达（以荧光评价）与RlucII构建体表达以生物发光评价的函数报告BRET比。[0116]图13A至图13C显示了不同比的受体和rGFP-CAAX下的wtMC4R和突变MC4R的细胞表面表达和功能性PC介导的拯救。用rGFP-CAAX构建体72ng质粒用于96孔板的10个孔和3种不同量（如图中所示：6、12和24ng用于10个孔）的hMC4RWt-RlucII图13A;hMC4RP299H-RlucII图13B;和hMC4RR165Q-RlucII图13C共转染HEK293。用分子伴侣DCPMP，ΙΟμΜ;实心黑色柱和灰色柱或载体DMS0;白色柱处理16小时后，在BRET2中，对转染的细胞评价细胞表面表达和功能（激动剂诱导的分离）的PC介导的拯救。灰色柱表示由DCPMP处理的细胞获得的数据，所述细胞暴露于激动剂a-MSHl小时以诱导受体分离。如预期的，与未处理的细胞相比（白色柱withbars，如由BRET信号的提高揭示的，DCPMP处理诱导细胞表面表达的提高。与用DCPMP处理但未暴露于激动剂的细胞黑色柱相比，如由BRET信号的减少灰色柱揭示的，激动剂处理诱导分离。Wt图13A和R165Q突变（图13C受体对于DCPMP和α-MSH10μΜ，37°C下1小时两者都敏感，而P299H突变MC4R没有被PC拯救（图13B。用于该测定的最佳窗口已经以6ng供体获得，增加转染的供体构建体的量没有导致可测量的hMC4RP299H的拯救。[0117]图13D显示了编码rGFP-CAAXKras的多顺反子构建体和WThMC4R或突变hMC4R在Hek293细胞中瞬时表达。该图显示了如通过激动剂诱导的分离+α-MSH;灰色柱测量的，可以由多顺反子构建体和非多顺反子构建体获得细胞表面表达的PC拯救（白色柱:DMSO对比黑色柱：10μΜDCPMP和功能性拯救的相似结果（图13A至图13C。提供了未用分子伴侣预处理的细胞的激动剂诱导的分离条纹柱）。[0118]图13Ε显示了已知在胞内保留的V2R突变体的PC介导的拯救，如由质膜中的BRET的提高证明的。在用分子伴侣（SR121463,ΙΟμΜ;实心黑色柱或载体DMS0;白色柱处理16小时后，在BRET1中对转染的细胞评价细胞表面表达的PC介导的拯救。[0119]图14Α和图14Β显示了WT和突变R165QMC4R细胞表面表达的2种PC介导的功能性拯救的剂量响应曲线。用rGFP-CAAX构建体和hMC4RWt-RlucII或hMC4RR165Q-RlucII构建体72ngrGFP构建体+24ng受体构建体用于96孔板的10个孔共转染HEK293。用可变浓度的DCPMP图14A和化合物1图14B处理16小时后，在BRET2中评价细胞表面表达的PC介导的拯救的剂量响应。用hMC4RWt-RlucII上曲线）或hMC4RR165Q-RlucII下曲线）获得的结果以对数尺度表达的分子伴侣浓度的函数报告。EC50和其他曲线参数在以下每幅图中表不。[0120]图15A至图15D显示了Z’因子作为测定的的稳健性指标的评估。用rGFP-CAAX构建体以及，hMC4RWt-RlucII图15A和图15B或hMC4RR165Q-RlucII图15C和图15D构建体72ngrGFP构建体+24ng受体构建体用于96孔板的10个孔共转染HEK293。用ΙΟμΜDCPMP48个孔对比载体DMSO48个孔处理16个小时后，在图15Α和图15C中，在BRET2中使用腔肠素400a评价细胞表面表达，以及，在BRETl中使用腔肠素H评价细胞表面表达（图15Β和图15D。提供的图中以每孔表达BRET值，评价hMC4Rwt受体的Z’因子超过0.63,突变体R165Q突变体hMC4R的Z’因子超过0.82,这说明对于两种受体都是稳健的测定。[0121]图16A和图16B显示了DMSO对基于BRET的细胞表面表达测定的影响的评估。用rGFP-CAAX构建体，和hMC4RWt-RlucII图16A或hMC4RR165Q-RlucII图16B构建体72ngrGFP构建体+24ng受体构建体用于96孔板的10个孔共转染HEK293。为了评价用于细胞表面评价的基于BRET的测定是否对不同水平的DMSO敏感，在PC处理期间，在提高浓度的DMSO高达3%的存在下，用ΙΟμΜDCPMP右柱或载体DMS0，左柱处理16小时后，在BRET2中评价细胞表面的表达。如提供的，获得的结果说明该测定对至少3%的DMSO是耐受的，这与化合物的HTS应用和表征相适合。[0122]图17Α和图17Β显示了在转染的和稳定的rGFP细胞系中MC4R和V2R表达的PC介导的拯救。用rGFP-CAAX构建体72ng质粒用于96孔板的10个孔和3种不同量如图所示:6、12和24ng用于10个孔）的hMC4RR165Q-RlucII图17A或hV2RY128S-RlucII图17B共转染HEK293。用相同量的受体构建体转染选择的稳定表达不同水平的rGFP-CAAX低、中Med和高Hi的HEK293细胞。用ΙΟμΜDCPMP处理16小时后，在BRET2中评价MC4R的细胞表面表达的PC介导的拯救，以及用ΙΟμΜ的SR121463分子伴侣（已知的具有反向激动剂和药物分子伴侣特性的诘抗剂；Serradeil-LeGalC.,CardiovascDrugRev.2001,193:201-14或载体DMSO处理16小时后，评价表达V2RY128S-RlucII的细胞的细胞表面表达的PC介导的拯救。表达MC4R和V2R的细胞的数据表示为用载体DMSO处理的细胞观察到的BRET信号的百分比（％。提供的数据说明用表达更高水平的rGFP-CAAX的稳定细胞系可以获得更好的响应。表达高水平rGFP-CAAX的稳定细胞系稳定:Hi可以用于建立共表达受体-RlucII的细胞系。[0123]图18A至图18E:用于检测hERG通道非GPCR的配体的PC拯救测定。以不同的hERG与rGFP-CAAX比的wt图18A和突变的hERGG601S;图18B的细胞表面表达和功能性PC介导的拯救。用rGFP-CAAX构建体72ng质粒用于96孔板的10个孔和3种不同量如图所示:6、12和24叫用于10个孔）的1^1^¥卜1?111311图18六）和1^1^66015-1?111311图188共转染HEK293细胞。用分子伴侣（阿司咪唑，ΙΟμΜ;实心黑色柱或载体DMS0;白色柱处理16小时后，在BRET2中评价细胞表面表达的PC介导的拯救。与载体处理的细胞相比，如通过BRET信号的增加揭示的，阿司咪唑处理诱导细胞表面表达的增加。Wt图18Α和G601S突变（图18ΒhERG均对PC处理敏感，并且用于表征已知以与hERG上的分子伴侣不同的效果来结合和起作用的配体（图18C和图18D。在图18E中，用Z’因子评价使用hERGG601S-RlucII构建体测定的稳健性。用1〇μΜ阿司咪唑48个孔相对于载体DMSO48个孔处理16小时后，在BRET2中评价细胞表面表达。在提供的图中BRET值按每孔表示，评价Ζ’因子为0.622,这说明其会是可以适用于接受高通量筛选应用的稳健测定。[0124]图19Α显示了用于监测β-抑制蛋白至质膜中的GPCR的募集的生物传感器的构型。BRET受体例如rGFP、GFP10用PM祀向部分标记（因此在PM中连接BRET受体），β-抑制蛋白用BRET供体例如RlucII标记。在GPCR激动剂存在的情况下（以A表示），β-arr被募集至GPCR，因此提高了质膜中RluCII-i3-arr的浓度，这转而导致RlucII和PM标记的GFP之间能量转移BRET的提高。[0125]图19B和图19C分别显示了用提高剂量的激动剂异丙肾上腺素（iso刺激后，在A类GPCR02AR中，对于不同PM靶向部分（Lyn、CAAX和PB-GRK5和BRET受体rGFP和GFP10，β-抑制蛋白4Ρβ-抑制蛋白2的募集的BRET比的提高。具有rGFP-CAAX正方形）的β-抑制蛋白-RlucII移位传感器提供了用两种受体的最佳的窗口。[0126]图19D和图19E分别显示了在用提高剂量的激动剂AVP刺激后，在B类GPCRV2R处，对于不同PM靶向部分Lyn、CAAX和ro-GRK5和BRET受体rGFP和GFP10，β-抑制蛋白1和β-抑制蛋白2的券集的BRET比的提尚。[0127]图19F显示了如使用不同的PM靶向部分来自Kras的CAAX、来自Hras的CAAX、来自hRas的质膜靶向棕榈酰化序列和来自RailCCIL的异戊烯化信号序列）和用rGFP标记的小窝结构小窝蛋白Ia的标记物评估的，用提高剂量的激动剂异丙肾上腺素（iso刺激后的β_抑制蛋白2至f32AR的募集。具有rGFP-CAAX正方形）的β-抑制蛋白-RlucII移位传感器显示了在质膜中提高的密度。与用rGFP-CAAX标记物获得的响应相反，02AR的刺激导致小窝上β-抑制蛋白2的密度降低。[0128]图19G显示了ATlR刺激后质膜中β抑制蛋白2移位的剂量响应曲线。用ATlR和βarr2-RlucII连同Lyn-rGFP或rGFP-CAAX或GFP10-CAAX—起转染HEK293SL细胞。在室温下使细胞与各种浓度的AngII温育6分钟，然后测量BRET。数据以基础BRET的百分比表示。数据是3次独立实验的平均值土S.E.。[0129]图19H至图19J分别显示了图19C、图19E和图19G的β抑制蛋白2-R1ucIIrGFP-CAAX生物传感器和受体的所获得的Z’因子。该测定用于监测受体介导的β抑制蛋白募集，获得了至少为0.740.74、0.80和0.838的Ζ’因子，其可以适用于对A类和B类GPCR两者的筛选高通量筛选应用。[0130]图20A和图20B显示了如通过RlucII-PHPLCSl和rGFP-PHPLCSl或Lyn-rGFP或rGFP-CAAX之间的BRET检测的，细胞质plasmaPIP2量的AngII剂量依赖性减少。用ATlR和HA-RlucII-PHPLCSl连同rGFP-PHPLCSl、Lyn-rGFP或rGFP-CAAX—起转染HEK293SL细胞。在室温下使细胞与各种浓度的AngII温育1分钟，然后测量BRET。结果是一个典型实验的一式三份的平均值土S.E.。[0131]图21A显示了用于监测质膜中β-抑制蛋白募集至GPCR的单分子生物传感器的构型。BRET受体例如rGFP、GFP10用PM靶向部分标记（因此连接PM中的构建体），柔性接头位于BRET受体和BRET供体例如RlucII之间，所述BRET供体连接于β-抑制蛋白。在存在GPCR激动剂（由A表示）的情况下，β-arr被募集至GPCR，从而提高质膜中RlucII-0-arr的浓度，转而导致RlucII和PM-标记的GFP之间的能量转移BRET提高。[0132]图21B显示使用具有不同长度的柔性接头的单分子生物传感器，评估在用AVP刺激后抑制蛋白2募集至V2R的BRET比。[0133]图21C至图21Ε显示了使用单分子生物传感器以不同6?〇?01'11?、¥21?和0241?募集β-抑制蛋白2的剂量响应曲线。[0134]图22Α显示了用于测量PKCS的二酰甘油-DAG-结合域Clb移位至质膜的单分子生物传感器的示意图。生物传感器包括PM靶向域部分Mem、BRET受体例如GFP10、柔性接头、BRET供体例如RLucII和PKCS的DAG结合域Clb。当PLC激活时，膜PIP2被水解为IP3和DAGJAG富集导致Clb域结合于膜，使BRET受体例如GFP10和BRET供体例如RLucII相互更接近，诱导更高的BRET信号。[0135]图22B显示了ATlR暴露于血管紧张素II之后DAG传感器激活的动力学。用编码单分子DAG传感器DNA和BRET的构建体转染稳定表达ATlR的HEK293细胞。每4秒监测BRET水平。测量16次BRET64秒之后添加AngII终浓度为IOOnM。数据是典型实验的一式三份的平均值土SD。[0136]图22C至图22E显示了用单分子DAG传感器获得的剂量响应曲线，其代表用血管紧张素ANGII激活血管紧张素II受体ATlR图22C，用两种天然配体前列腺素2aPGF2a;实心方块和前列腺素E2PGE2;空心圆圈）激活前列腺F受体FP图22D，用硬骨鱼紧张肽IIUTII激活硬骨鱼紧张肽II受体GPR14图22E后，在质膜中产生的DAG水平。获得的这些配体的EC5Q值ANGII=5.3nM、PGF2a=IlnM、PGE2=90nM和UTII=1.7nM类似于已经公布的另一种相关的测定1丐流入和结合的数据。[0137]图22F显示了用单分子DAG传感器测量的BRET响应反应PLC激活和二酰甘油的伴随产生。使瞬时表达单分子DAG传感器的HEK293细胞暴露于5μΜ的m-3m3FBS、PLC的直接激活剂Φ2、β3、γ1、γ2、δ1同种型）指定的时间。PLC激活导致BRET的提高，反映了质膜中DAG水平的持续提尚。[0138]图22G和图22Η显示了DAG生物传感器的稳健性。使用瞬时表达硬骨鱼紧张肽-II图23G或前列腺素F受体（图23Η以及DAG生物传感器的ΗΕΚ293,确定DAG生物传感器的Z因子。使细胞暴露于IOOnM激动剂（图23G中的Uroll或图23Η中的PGF2ax分钟，然后测量BRET。[0139]图23A显示了用于测量PKCS的二酰甘油-DAG-结合域Clb移位至质膜的生物传感器的示意图。生物传感器包括连接于BRET受体例如rGFP的PM靶向域部分和连接于PKCδ的DAG结合域Clb的BRET供体例如RLucII。当PLC激活时，膜PIP2被水解为IP3和DAGJAG富集导致Clb域结合于膜，使BRET受体例如GFP10和BRET供体例如RLucII相互更接近，诱导更高的BRET信号。[0140]图23B至图23D显示了使用DAG生物传感器在组胺Hl受体HlR图23B、缓激肽受体B2BKRB2图23C、多巴胺D2受体D2R图23D和I32AR图23E激活后质膜中Clb的募集的剂量响应曲线。Gq偶联受体H1R和BKRB2激活引起比Gi偶联受体D2R或Gs偶联受体更好的信号，在不存在G15—种Gq家族的G蛋白）共表达的情况下基本上不引起可检测的响应。[0141]图24A显示了用于测量G蛋白移位和激活的生物传感器的示意图。生物传感器包括连接于BRET受体（例如rGFP的PM靶向域部分（例如CAAX域）和连接于G蛋白亚基例如Gγ基于Gi3γ-分离的传感器或Ga基于Ga-分离的传感器）的BRET供体例如RLucII。当激动剂A激活GPCR时，G蛋白亚基从GPCR释放，因此减少了质膜中G蛋白亚基的量密度，导致较低的BRET信号。BRET中的改变也可以反映从膜的亚域或用rGFP标记物标记的亚细胞区室的移位BRET降低或移位至膜的亚域或用rGFP标记物标记的亚细胞区室BRET提高）。[0142]图24B和图24C显示了响应于用异丙肾上腺素刺激01AR图24B或02AR图24C的各种RLucII标记的Gγ亚基与质膜rGFP-CAAXKras的分离。在实验之前，用编码β-肾上腺素能受体、WTGfH亚基、RlucII标记的Gy亚基（如说明的）和WTGal5的构建体共转染HEK293细胞。与RlucII-Gyl亚基的组合提供了为两种受体建立剂量响应曲线的最好窗口。[0143]图24D显示了用异丙肾上腺素刺激WAR圆圈）和02AR三角形）后，激动剂促进的RLucII标记的Gγ1与rGFP-CAAXKras的分离的HEK293细胞的剂量响应曲线，所述HEK293细胞用编码肾上腺素能受体、WTGf31亚基、RlucII标记的Gy1亚基和WTGal5的构建体瞬时转染。观察到的EC5q与报告的这些受体的异丙肾上腺素的kd相似。[0144]图24E显示了用异丙肾上腺素刺激f31AR后，激动剂促进的RLucII标记的Gs与rGFP-CAAXKras圆©、rGFP-CAAXHras正方形）和rGFP-CAAXCCIL三角形）的分离的剂量响应曲线。用3种PM标记物观察到的效果跨越4.4nM用rGFP-CAAXKras至847nM^rGFP-CAAXCCIL，说明不同配体的药理学在用特定的标记物监测的域中可以是不同的。[0145]图24F显示了用ΙμΜ异丙肾上腺素刺激WAR指定的时间后，激动剂促进的RLucII标记的Gs与rGFP-CAAXKras圆圈）、rGFP-CAAXHras正方形）和rGFP-CAAXCCIL三角形）的分离的动力学。如用3种PM标记物测量的，多数在刺激的5分钟内达到最大响应。因此，图24E中EC5q的差异不是由动力学的差异驱动的，因为剂量响应曲线是在最大响应处建立的。[0146]图24G显示了用异丙肾上腺素刺激mAR后，激动剂促进的RLucII标记的G12与rGFP-CAAXCCIL三角形）、rGFP-CAAXHras正方形）和高尔基体-rGFPeNOSl的高尔基体靶向域;方块）的分离的剂量响应曲线。基础BRET说明Gl2与高尔基体标记物共定位。然而，使用PM标记物和仅最少地从高尔基体观察到G12的多数激动剂诱导的移位。这些结果显示受体刺激后可以观察到Gs和G12两者。[0147]图24H显示了用典型激动剂:U46619刺激血栓素A2受体同种型aTpaR后，激动剂促进的RLucII标记的Gq移位至rGFP-CAAXKras圆圈）、rGFP-CAAXHras正方形）、rGFP-CAAXCCIL三角形和高尔基体-rGFPeNOS1的高尔基体靶向域;方块的剂量响应曲线。剂量响应曲线获得自用编码paR、Gaqp0S118RlucII在Gaq的第118位残基后插入的RlucII、WTGγ5和Gm的构建体瞬时转染，用Ubo-Qic—种特别的Gq抑制剂预处理20分钟或不预处理的HEK293细胞。基础BRET说明Gq大多数与rGFP-CAAXKras实心圆圈）共定位，用Ubo-Qic的预处理（空心圆圈）进一步提高了具有该标记物的Gq的密度，使响应于U46619的窗口钝化blunting。用其他标记物获得的剂量响应曲线显示了仅采用未暴露于Gq阻滞剂的细胞，Gq的密度提高BRET提高;实心方形、实心三角形和实心方块分别表示rGFP-CAAXHras、rGFP-CAAXCCIL和高尔基体）。用Gq抑制剂（实心方形、实心三角形和实心方块分别表示rGFP-CAAXHras、rGFP-CAAXCCIL和高尔基体预处理的细胞，用这些标记物没有观察到响应。这些结果证实了G蛋白（至少对于Gq来说移位与它们的激活有关，可能观察到响应于激动剂刺激的与亚域的分离或向亚域的募集。[0148]图25A显示了用于测量通过蛋白激酶NIPKN的Rho结合域移位至质膜激活Rho的生物传感器的示意图。生物传感器包括连接于BRET受体例如rGFP的PM靶向域部分和连接于PKN的Rho结合域的BRET供体例如RLucII。当G蛋白激活时，RhoGEF被募集至Gq和G1213家族的如激活的Ga亚基或募集至由激活的Ga释放的邱γ。该GEF激活Rho家族的小G蛋白。一旦激活，Rho募集具有与激活的Rho特异性相互作用的域的特定效应物;PKN是那些效应物中的一种。基于该特性，通过将PKNlRho结合域CRIB亚克隆至含有BRET供体、RlucII的表达载体，以及通过监测它们移位至激活的Rho所在的质膜来建立监测Rho激活的传感器。移位使BRET受体例如rGFP和BRET供体例如RLucII相互更接近，诱导更高的BRET信号。[0149]图25B显示了用激动剂U46619刺激TpaR后，激动剂促进的PKN-RLucII移位至质膜标记物:rGFP-CAAXKras圆圈）、rGFP-CAAXHras倒三角形）和rGFP-CAAXCCIL;三角形）的剂量响应曲线。剂量响应曲线获得自用编码TPaR、PKN_RLucII和质膜rGFP标记物的构建体瞬时转染的HEK293细胞。TPaR是已知激活RhoA的典型Gq1213偶联受体。[0150]图25C显示了ATlR暴露于血管紧张素II后Rho传感器激活的动力学。用编码ATlR以及PKN-crib-RlucII和rGFP-CAAX的构建体转染HEK293SL细胞。在不存在或存在IOOnMUbo-Qic—种也称为FR900359的特定Gq抑制剂）的情况下首先温育细胞30分钟，然后每2秒测量BRETJO秒后注射台氏液未刺激的）或AngII刺激的；终浓度IOOnM。数据是典型实验的在不同时间点的一式两份的读数的平均值。[0151]图25D至图25F显示了Gq抑制对通过不同的AngII配体激活Rho的影响。用编码ATlR以及PKN-CRIB-RLucII和rGFP-CAAX的构建体转染HEK293SL细胞。在不存在（实线）或存在点线）IOOnMUbo-QicGq抑制剂）的情况下温育细胞30分钟，然后用不同浓度的AngII或类似物刺激4分钟，然后测量BRET。数据标准化为AngII的Emax。数据表示为来自3至4次独立实验的平均值±5上.。69激活的配体，如4即11、1^1^111、3¥^、31^3、11331'11168；[11和31，显示了在ubo存在的情况下减少的效果和向右移动的能力（图25D和图25EAq的阻断不影响DVG、肌丙抗增压素（Saralasin和TRV介导的Rho激活，因为这些配体不激活GqAII显示了仅通过ubo处理改变EC5q，说明SII微弱地激活Gq11。[0152]图25G显示了Gq抑制对通过ATIR和乙酰胆碱受体激活Rho的影响。用编码ATIR以及PKN-CRIB-RlucII和rGFP-CAAX的构建体转染HEK293SL细胞。在不存在对照）或存在IOOnMUbo的情况下温育细胞，然后用IOOnMAngII或ΙΟΟμΜ氨甲酰胆碱CCh刺激70秒，然后测量BRET。结果显示Ubo部分地阻碍了AngII介导的BRET提高，以及完全阻碍了CCh介导的响应；说明Gq在通过AngII和CCh激活Rho中起作用。数据是来自典型实验的一式三份的平均值土SD0[0153]图25H显示了Rho抑制剂对Rho传感器激活的作用。使表达ATlR、PKN-crib-RlucII和rGFP-CAAX的HEK293SL与3ygmlC3毒素Rho抑制剂，Cytoskeleton公司）在台氏液中在37°C下温育约4小时，然后在室温下用IOOnMAngII刺激70秒。C3毒素完全使激动剂介导的BRET增加停止，验证了用于监测Rho活性的传感器。[0154]图251显示了PKN移位至质膜依赖于Rho激活。用Rho抑制剂（CT04;Cytoskeleton公司）过夜预处理或不预处理瞬时表达TPaR和PKN传感器PKN-RlucII+CAAX-rGFP的HEK293细胞，使HEK293细胞暴露于IOOnMU46619TPaR激动剂）、lygmlRho激活剂IICN03;CytoskeIeton公司）或载体。Rho抑制剂停止TPaR介导的响应，而Rho激活剂诱导响应，验证了用于监测Rho活性的传感器。[0155]图26A和图26B显示了单分子融合构建体的RlucII和不同BRET受体之间获得的BRET转移。使用rGFP获得的BRET信号是使用典型的BRETlVenus和BRET2GFP2受体获得的信号的10倍。图26A显示了当RlucII与Venus、GFP2和rGFP配对时能量转移的差异。图26B显示了由Venus-、GFP2-和rGFP-融合构建体计算的BRET比。[0156]图26C显示了甚至对于基于密度BRET的测定，如募集β-抑制蛋白至质膜，rGFP提高的BRET信号可以用于在显微镜下监测BRET。正如使用酶标仪监测的，用于该实验的测定与图19C中呈现的相似。用编码I32AR、财φ制蛋白2-RlucII和质膜标记物rGFP-CAAXKras的构建体瞬时转染HEK293细胞。异丙肾上腺素刺激仅诱导质膜中BRET信号水平的提高，说明BRET信号的提高是β抑制蛋白募集至质膜的反映。[0157]图27Α显示了ATlR胞吞作用调节剂的筛选结果。ATIR-RlucII和rGFP-FYVE的瞬时转染之后，将HEK293细胞分配至384孔的白色组织培养物处理板Greiner，使HEK293细胞生长额外的24小时。根据化合物子库，使用384磁力注射头VPscientific以15μΜ或5ygml的终浓度添加化合物。对于激动剂模式，在37°C下温育化合物30分钟。使用Envision™Perkin-E丨mer®，;FP焚光是红色的，使用多道移液器384multidrop384Thermo-Scientific®以5yM的终浓度添加腔肠素400a。在室温下温育细胞，然后读出BRET信号RLuc在480nm下读，rGFP在530nm下读）。对于拮抗剂模式，在37°C下温育化合物30分钟。以IOnMEC8q添加血管紧张素II，并在37°C下温育额外的30分钟。其余的测定以激动剂模式进行。使用ActivityBaseIDBS分析数据，并且基于血管紧张素II的激活将数据报告为激动剂％或抑制％。显示了分别充当ATlR靶向于内体的增强剂提高信号超过100%和抑制剂阻断信号超过50%的30种和42种化合物。[0158]图27B显示了筛选中化合物#21对B2R和β抑制蛋白2胞吞至内体的作用，图27C显示了筛选中鉴定的化合物#10和#29对B2R胞吞至内体的作用。在转染前一天，在35mm玻璃底皿中以100，000个细胞皿的密度接种HEK293SL细胞。用B2R-YFP+mCherry-FYVE图27B左和中以及图27C或B2R+0抑制蛋白2-YFP图27C转染细胞。转染后48小时，使细胞血清饥饿30分钟，以及在37°C下用载体（图27B左和图27C左）、化合物21图27B中和右）、化合物10图27C中）或化合物29图27C右预处理30分钟。然后用或不用（未处理的）缓激肽（ΙμΜ刺激细胞15分钟。在Zeiss™LSM-510Meta激光扫描显微镜上使用氩514nm和HeNeI543nm激光器分析样品，并且使用63X油浸镜收集图像2048X2048像素）。具体实施方式[0159]在本文描述的研究中，本发明人开发了能够评估监测蛋白如受体或其他蛋白的胞内定位和运输例如受体的内化、回收、胞吐作用）的基于BRET的生物传感器。使用GPCR和离子通道作为模型，本发明人开发了基于海肾BRET配对RLucII-rGFP的灵敏的手段，其用于实时监测和药理学描述受体和β-抑制蛋白的内化和其运输至不同细胞区室，以及用于鉴定运输调节剂。这些传感器依赖于在给定的细胞位置或给定的细胞区室处供体相对于受体的浓度或密度的变化，所述变化由调节剂促进，不依赖于直接的蛋白-蛋白相互作用（而这通常是常规BRET测定的情形），所述传感器更通用和适合于不同细胞位置区室之间的多数蛋白运输。发现了使用海肾BRET对如代表性的RLucIIrGFPBRET对），系统提供了非常稳健和可再现的响应，与传统BRETlRlucVenus或BRET2RlucIIGFPIO相比，其提高了动态范围超过约5至10倍。总之，与使用RLucIIGFPIO对的生物传感器形式所获得的动态范围相似，使用RlucVenus对的信号的动态范围是非常窄的BRET比为0.04至0.08见实施例3和实施例12,图2A至图2C和图19A至图19E。这种非常窄的动态范围极大地限制了对受体和效应物运输中微小变化的分析，并且使得测定对高通量筛选HTS不够灵敏。本文描述的灵敏的生物传感器可以用于：[0160]•细胞表面受体内化和回收（即内化后受体回到质膜的实时监测:它们允许检查不同受体例如GPCR、RTK从质膜移除，以及相反地，在诱导胞吞作用之后，在配体移除后通过重新获得PM中的BRET信号监测受体的回收。它们还允许研究受体运输的胞吞作用的调节、药理学和途径特异性。[0161]•不同胞内区室中的受体和β-抑制蛋白运输的实时监测。它们允许评估网格蛋白依赖性和β-抑制蛋白依赖性的受体例如GPCR内化和受体β-抑制蛋白复合物至不同的细胞区室如回收内体END的差别运输。[0162]•受体如GPCR和β-抑制蛋白运输的药理学谱：它们允许评估配体调节受体β-抑制蛋白复合物运输至不同细胞区室的倾向，以及监测药物对质膜中的受体初始内化作用和受体如GPCR回收的作用。[0163]•通过高通量筛选HTS鉴定运输调节剂：因为测定是可再现的和灵敏的，它们允许用于鉴定受体例如GPCR调节剂和其他蛋白运输的高通量筛选。原理证据提供有AT1R，该受体运输的新型小分子调节剂的鉴定以及其他GPCR如B2R实施例17。[0164]•能够拯救受体表达的试剂分子伴侣）的鉴定。分子伴侣测定不依赖于受体信号传导，多数是检测稳定化或影响特定靶标受体构型的配体的结合测定。因此，它是用于以信号传导非偏倚方式筛选正构配体和变构配体的感兴趣的测定。该结合测定可以进一步用于鉴定试剂的“脱祀”效应，即确定鉴定的针对具体靶标的试剂是否与一种或多种额外的靶标交叉反应其可以通过使用本文描述的生物传感器确定试剂是否“拯救”这些一种或多种另外的靶标来评估）。[0165]•监测评估蛋白（例如衔接体或信号传导蛋白）至受体的募集例如β_抑制蛋白至GPCR的募集、G蛋白亚基分离、Grb2至受体酪氨酸激酶RTK的募集），这反映了受体激活。[0166]因为不同的细胞区室标记物在其选择性区室（例如质膜PM或内体END中保留，并且因为在配体调节例如激动剂刺激、拮抗剂抑制或药物分子伴侣时仅受体或其他标记的蛋白如β抑制蛋白、G蛋白亚基、效应物等从一个区室移动至其他区室，因此其允许追踪蛋白从PM至END的运输，这分别可以通过BRET信号的降低PM-rGFP受体-RlucII测定）和或提高END-rGFP受体-RlucII测定来揭示。另外，使用PM-rGFP受体-RlucII系统，可以通过在受体的胞吞作用后洗掉配体来监测受体回收。该测定不限于评估受体的胞吞作用回收，而且适于鉴定和表征药物分子伴侣（见实施例7至11以及评估监测胞吐作用和蛋白移位过程。因此，可以使用本文描述的生物传感器以高灵敏性定量评估不同胞内区室之间的任何类型的蛋白移动运输）。[0167]这些生物传感器也不仅可以应用于蛋白（例如受体、胞内蛋白）运输，而且可以应用于监测细胞内蛋白和其他生物分子的任何类型的局部浓度或密度的改变。这可以通过两种途径完成:第一，如果用特定的胞内细胞器或细胞区室标记物来标记rGFP或RlucII，其可能在任何特定条件下遵循不同胞内定位中的感兴趣的蛋白。第二，本发明的生物传感器可以应用于监测蛋白的局部浓度或密度，以及脂质或其他生物分子例如第二信使）的局部密度。RLucII-rGFP对应用于使用ΡΙΧδΙ-ΡΗ域检测膜PI4,5扦2的产生（实施例13，图2^和20Β。在基础状态中，ΡΙΧδΙ-ΡΗ-RlucII和ΡΙΧδΙ-ΡΗ-rGFP或与PM靶向部分如Lyn或CAAX融合的rGFP位于PI4,5P2所在的PM中，所以它们的局部浓度足够高以产生BRET。当磷脂酶CPLC被激活时，PI4，5P2被水解，标记了RlucII和rGFP的ΡΙΧδI-PH域分散至胞质溶胶，降低rGFP和RlucII的局部浓度，由此降低BRET信号。相似地，PKCS的DAG结合域Clb可以用于测量PIP2水解为IP3和DAG图22A和图23A^AG富集引起Clb域结合于膜，使BRET受体例如连接于PM靶向部分的rGFP和BRET供体例如连接于Clb的RLucII相互接近，诱导更高的BRET信号。根据相同的原理，可以检测任何类型的蛋白分离。在一种实施方式中，运输是受体内化和或回收。[0168]因此，在第一方面，本发明提供了用于评估感兴趣的蛋白多肽的定位和或运输的生物传感器，其包括:第一组件，所述第一组件包括用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的感兴趣的蛋白多肽;第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分;其中如果所述感兴趣的蛋白多肽用所述海肾GFP标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述感兴趣的蛋白多肽用所述海肾Luc标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。[0169]术语“感兴趣的蛋白多肽”是指任何蛋白多肽天然的、突变的、可溶性的或膜结合的）或其片段部分，其向一个或多个细胞区室的定位、移位和或募集是要评估的。感兴趣的蛋白可以是例如在受体、受体刺激时募集至质膜或与质膜隔离的蛋白、移位至细胞核的蛋白等。在一种实施方式中，感兴趣的蛋白是受体（即连接于质膜或嵌入质膜内的蛋白质）。在一种实施方式中，受体是在配体激动剂结合时内化的。在一种实施方式中，受体是G蛋白偶联受体（GPCR。“GPCR”是指全长天然GPCR分子以及突变GPCR分子。Foord等人2005PharmacolRev.57，279-288其通过引用并入本文）中给出了GPCR的清单，更新的GPCR的清单可从IUPHAR-DB数据库中获得HarmarAJ，等人.（2009IUPHAR-DB:G蛋白质偶联受体和离子通道的IUPHAR数据库（theIUPHARdatabaseofGprotein-coupledreceptorsandionchannels.Nucl.AcidsRes.37数据库期）：D68〇-D685;SharmanJL，等人，（2013IUPHAR-DB:更新的数据库内容和新特性（IUPHAR-DB:updateddatabasecontentandnewfeatures.Nucl.AcidsRes.41数据库期）：D1083_8。[0170]在另一种实施方式中，受体是离子通道，例如电压门控离子通道例如钠、钙、钾通道）。离子通道的清单可从IUPHAR-DB数据库中获得见上文的参考文献）。[0171]在另一种实施方式中，感兴趣的蛋白多肽是衔接体蛋白（例如信号转导衔接体蛋白）或其变体片段。衔接体蛋白是在信号转导途径中附属于主要蛋白的蛋白，并且包含将蛋白结合配偶体连接在一起和促进更大的信号传导复合体形成的多种蛋白结合组件例如SH2和或SH3±|D。这些蛋白通常本身缺少任何固有的酶活性，但是相反介导驱动蛋白复合体形成的特定的蛋白-蛋白相互作用。衔接体蛋白的例子包括MyD88、Grb2或SHCl。[0172]在另一种实施方式中，感兴趣的蛋白是β-抑制蛋白、β-抑制蛋白变体或其活性部分片段，例如抑制蛋白-IRefSeq:同种型1为ΝΡ_004032.2;同种型2为NP_064647.1或β-抑制蛋白-2RefSeq:同种型1为NP_004304.1;同种型2为NP_945355.1;同种型3为ΝΡ_001244257.1;同种型4为NP_001244258.1;同种型5为NP_001244259.1;和同种型6为ΝΡ_001244260.1〇[0173]在另一种实施方式中，感兴趣的蛋白是G蛋白亚基、G蛋白亚基变体或其活性部分片段，例如Ga、Gγ或G0亚基或其活性片段。[0174]因此，在另一个方面，本发明提供了用于评估G蛋白和或GPCR激活的生物传感器，所述生物传感器包括:第一组件，所述第一组件包括用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的G蛋白亚基或其活性片段;第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的PM靶向部分;其中如果所述G蛋白亚基用所述海肾GFP标记，则所述PM靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述G蛋白亚基用所述海肾Luc标记，则所述PM靶向部分用所述海肾GFP标记。[0175]在另一个方面，本发明提供了用于评估GPCR配体是否调节G蛋白亚基活性的生物传感器，所述生物传感器包括：第一组件，所述第一组件包括用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的G蛋白亚基或其活性片段;第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的PM靶向部分;其中如果所述G蛋白亚基用所述海肾GFP标记，则所述PM靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述G蛋白亚基用所述海肾Luc标记，则所述PM祀向部分用所述海肾GFP标记。[0176]在一种实施方式中，所述G蛋白亚基或其活性片段用所述海肾Luc标记，所述PM靶向部分用所述海肾GFP标记。在一种实施方式中，G蛋白亚基是Gγ亚基，例如GγI、Gγ2、Gγ3、Gy4、Gy5、Gy6、Gy7、Gy8、Gy9、Gy10、Gyll、Gy12或Gy13。在另一种实施方式中，G蛋白亚基是Ga亚基，例如69、68、6;11、612、613、61：-锥61：-3〇116、61：-棒61：-1'〇1、61：-格斯Gt-gus、62、6〇厶、6〇8、6〇1厂611、612、613、614或615616。在另一种实施方式中，6蛋白亚基是邱，例如邱1、602、603、604或邱56邱-5或邰5-〇。[0177]在另一种实施方式中，感兴趣的蛋白是结合于DAG的蛋白或其活性部分片段，例如佛波酯二酰甘油结合域DAG结合域）。在一种实施方式中，DAG结合域Clb来自PKCS。包括DAG结合域通常是指Cli或的其他蛋白包括例如AKAP13;ARAF;ARHGAP29;ARHGEF2;BRAF;CDC42BPA;CDC42BPB;CDC42BPG;CHNl;CHN2;CIT;DGKA;DGKB;DGKD;DGKE;DGKG;DGKH;DGKI;DGKK；DGKQ；DGKZ；GMIP；HMHAl；KSRl；KSR2；MY09A；MY09B；PDZD8；PRKCA；PRKCBl；PRKCD；PRKCE；PRKCG；PRKCH；PRKCI；PRKCN；PRKCQ；PRKCZ；PRKDl；PRKD2；PRKD3；RACGAPI；RAFl；RASGRP；RASGRPI；RASGRP2；RASGRP3；RASGRP4；RASSFl；RASSF5；ROCKl；R0CK2；STAC；STAC2；STAC3;TENCl;UNCl3A;UNCl3B;UNCl3C;VAVl;VAV2和VAV3。[0178]在另一种实施方式中，感兴趣的蛋白是ΡΙΧδΙ或其能够结合于PI4,5?2的活性部分片段，例如ΡΙΧδΙ的普列克底物蛋白同源PH域。[0179]在另一种实施方式中，感兴趣的蛋白是结合于小GTP酶的蛋白（Expasy酶登记号：3.6.5.2。小GTP酶是与G蛋白亚基关系较远的分子质量为21kDa的约50种酶的家族，其与细胞生长调节Ras亚家族）、膜小泡运输和去包被Rab和ARF亚家族）、核蛋白输入Ran亚家族和细胞骨架的组织Rho和Rac亚家族有关。在一种实施方式中，感兴趣的蛋白是结合于小GTP酶的Ras超家族的一个或多个成员（例如GTP酶的1^8、他〇、1^11、1^13和4”家族）的蛋白。可以使用包含Ras结合域RBD例如RAFl的RBD或其包括A85K置换的变体其具有对Ras更高的亲和性）的多肽评估这样的小GTP酶的定位移位。包含RBD的其他蛋白包括ARAF、BRAF、RGS12、RGS14、TIAM1和PI3K。感兴趣的蛋白因此可以包括结合于小GTP酶的蛋白的完整天然序列或其保持与小GTP酶结合能力的片段的变体。[0180]在进一步的实施方式中，感兴趣的蛋白是结合于小GTP酶的Rho超家族的一个或多个成员（RhoA、B和C、Racracl、2、3或RhoG或Cdc42Cdc42、RhoQ或RhoJ的蛋白。在另一种实施方式中，感兴趣的蛋白是结合于Rho蛋白（Rh〇A、Rh〇B和或RhoC，优选RhoA或其活性片段（例如Cdc42Rac相互作用结合CRIB±或）的蛋白。CRIB域EMBL-EBIInterpro登录号IPR000095是GTP酶结合域GBD，也称为p21结合域，PBD的N端部分内的保守区，所述GTP酶结合域存在于小GTP酶的许多推定的下游效应物例如Cdc42p样和或Rho样小GTP酶）中，并且包括约15至16个氨基酸。包含CRIB域的蛋白包括哺乳动物激活Cdc42相关激酶ACK、哺乳动物P21激活激酶ΡΑΚΙ至PAK4、RhotekinRTKN、哺乳动物维斯科特-奥尔德里奇综合征蛋白（Wiskott-AldrichSyndromeProteins，WASP\蛋白激酶C超家族的激酶如丝氨酸苏氨酸蛋白激酶NPKN，也被称为蛋白激酶C相关激酶，PRK。在一种实施方式中，感兴趣的蛋白包括人PKNlUniprot参考：Q16512-1或PKN2Uniprot参考：Q16513的CRIB域，优选PKNl的CRIB域。人PKNl的CRIB域包含序列VQSEPRSWSLLEQLGSEQIDN0:40，其与天然人PKNlUniprot参考:Q16512-1的第6至20位残基对应。[0181]因此，在另一个方面，本发明提供了用于评估小GTP酶例如Rho的激活的生物传感器，所述生物传感器包括:第一组件，所述第一组件包括用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的包含结合于所述小GTP酶的域例如CRIB域的多肽；第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的PM或内体靶向部分;其中如果所述包含结合于所述小GTP酶的域例如CRIBi或的多肽用所述海肾GFP标记，则所述PM或内体靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述包含结合于所述小GTP酶的域例如CRIBi或的多肽用所述海肾Luc标记，则所述PM或内体靶向部分用所述海肾GFP标记。在一种实施方式中，小GTP酶是Rho蛋白（例如RhoA。在一种实施方式中，结合于小GTP酶的域是CRIB域，如人PKNl的CRIB域。在一种实施方式中，第二组件包括PM祀向部分。[0182]如本文使用的术语海肾荧光素酶是指用于生物发光的氧化酶，其来自海肾属的生物体如海肾Renillareniformis或海肾Renillamulleri。海肾焚光素酶包括来自海肾属生物体的天然荧光素酶或其变体，例如海肾Renillareniformis荧光素酶Rluc的天然形式（就氨基酸序列而言）或其变体如RlucII或RlucS。术语“RlucII”是指海肾Renillareniformis荧光素酶的突变形式，其包括相对于天然海肾荧光素酶的以下氨基酸置换:A55T、C124A和M185V。在一种实施方式中，RlucII包括实施例1中描述的序列（SEQIDNO:10。术语“Rluc8”是指海肾Renillareniformis焚光素酶的突变形式，其包括相对于天然海肾荧光素酶的以下氨基酸置换:A55T、C124A、S130A、K136R、A143M、M185V、M253L和SSSTL13GenBank登录号AAG54094.1中公开了天然海肾（Renillamulleri荧光素酶的氨基酸序列。[0183]术语“海肾GFP”是指来源于海肾属的生物体如海肾Renillareniformis或海肾Renillamulleri。海肾GFP包括来自海肾属生物体的天然GFP或其变体。在一种实施方式中，海肾属GFP是海肾RenillareniformisGFP本文称为“rGFP”），在进一步的实施方式中，海肾属GFP是海肾（RenillareniformisGFP的天然形式就氨基酸序列而言）。在一种实施方式中，rGFP包括实施例1中描述的序列（SEQIDNO=ID13GenBank登录号AAG54098.1中公开了天然海肾RenillamulleriGFP的氨基酸序列。海肾荧光素酶和或海肾属GFP的核酸序列可以是为在人细胞中表达而密码子优化的（即“人源化的”，见例如WO2002057451的海肾RenillamulleriGFP的人源化形式）。[0184]共振能量转移缩写为RET是描述具有重叠发射吸收谱的两个发色团之间的能量转移的机制。当两个发色团（“供体”和“受体”）彼此处于短距离例如10-100埃并且它们的跃迀偶极子适当地取向时，供体发色团能通过非辐射性的偶极子-偶极子偶联将供体发色团的激发态能量转移至受体发色团。生物发光共振能量转移BRET基于供体生物发光团生物发光酶例如海肾荧光素酶和受体发光团（例如海肾GFP之间能量的非辐射性转移。[0185]术语“细胞区室靶向部分”是指生物分子，优选为多肽或肽，当其与海肾GFP或海肾Luc连接时例如作为融合蛋白），其靶向于细胞内特别的区室、细胞器或定位例如质膜或质膜的特别的亚域如脂质後）、内体例如早期和或晚期内体）、溶酶体、吞噬体、核糖体、线粒体、内质网、高尔基体、细胞核等，由此提高海肾GFP或海肾Luc的有效浓度。这样的标记典型地是在靶向的特别区室中通常以高水平存在的蛋白（或其适当的片段）。使蛋白靶向于细胞内特别的区室、细胞器或定位的肽是本领域已知的，包括例如内质网（ER信号肽或ER滞留序列BR-retrievalsequence、核定位信号NLS肽和线粒体定位信号MLS肽。[0186]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是质膜PM靶向部分。任何能够募集海肾GFP或海肾Luc至PM的部分可以用于生物传感器。因此，海肾GFP或海肾Luc可以融合于质膜中存在的任何蛋白（例如PM中发现的受体或任何其他蛋白），或其片段。这样的蛋白的例子是小窝蛋白-1，其主要组件小窝（对应于质膜的小（50至IOOnm内陷的一类脂质筏存在于许多细胞类型中。已经鉴定了通过CAVl基因的替代剪接产生的小窝蛋白-1的两种同种型：小窝蛋白-Ia包括第2至178位残基和小窝蛋白-1β对应于第32至178位序列）。这样的部分的其他例子包括肽多肽，所述肽多肽包括用于蛋白脂质化脂肪酸酰化如豆蔻酰化、棕榈酰化和异戊二烯化的信号序列以及多碱域。几种蛋白已知是豆蔻酰化、棕榈酰化和或异戊二稀化的（例如蛋白激酶和磷酸酶如Yes、Fyn、Lyn、Lck、Hck、Fgr、Ga蛋白、一氧化氮合成酶、ADP核糖基化因子ARF、钙结合蛋白和膜或细胞骨架相关结构蛋白如MARCKS见例如Wright等人，JChemBiol.Mar2010;3l:19-35;Alcart-Ramos等人，BiochimicaetBiophysicaActaBBA-生物膜Biomembranes，第1808卷，第12期，2011年12月，第2981-2994页），因此来自任何这些蛋白的豆蔻酰化、棕榈酰化和异戊二烯化信号序列可以用于生物传感器。在一种实施方式中，豆蔻酰化和或棕榈酰化序列来自Lyn激酶。[0187]在一种实施方式中，PM膜靶向部分包括CAAX基序C是半胱氨酸残基，AA是两个脂族残基，X代表任何氨基酸）。在“CAAX蛋白”中发现了CAAX基序，所述CAAX蛋白定义为在C端具有指导其翻译后修饰的特定氨基酸序列的一组蛋白质。CAAX蛋白涵盖很多种分子，所述分子包括核纤层蛋白（中间丝）（如前核纤层蛋白A、核纤层蛋白Bl和核纤层蛋白B2、Ras和多种GTP-结合蛋白（G蛋白）（如Ras、Rho、Rac和Cdc42、几种蛋白激酶和磷酸酶等（见例如Gao等人，AmJTranslRes.2009;l3:312-325。在C端末端具有CAAX基序或盒的蛋白质在蛋白质迀移到质膜或核膜和发挥不同的功能之前，典型地需要异戊二烯化过程。在一种实施方式中，CAAX盒来源于人RAS家族蛋白，例如HRAS、NRAS、Ral-A、KRAS4ASKRAS4b^nT描述了RAS、NRAS、KRAS4A或KRAS4b的最后的C端残基被称为高度可变区或HVR，其中以斜体字表示推定的最小质膜革G向区，以下划线表示CAAX盒见例如Ahearn等人，自然综述分子细胞生物学（NatureReviewsMolecularCellBiology13:39-51,2012年1月）：HRAS:[0188]在一种实施方式中，PM祀向部分包括来自KRAS4b的序列GKKKKKKSKTKCVIMSEQIDN0:7。在另一种实施方式中，PM靶向部分包括来自hRas的质膜靶向棕榈酰化序列和来自Ral-ARall的异戊二烯化信号序列（序列：CMSCKCCIL，SEQIDN0:43。[0189]几种蛋白还含有革巴向PM的非脂质多碱域polybasicdomain，所述蛋白如Ras小GTP酶、磷酸酶PTEN、非受体酪氨酸激酶Src、肌动蛋白调节因子WASP和MARCKS、和G蛋白质-偶联受体激酶（GRK如GRK5。在一种实施方式中，多碱域来自GRK5,并且包括序列SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKSSEQIDN0:8〇[0190]在特别的方面，本发明提供了生物传感器，其包括:细胞或膜制剂，所述细胞或膜制剂包括：（i第一组件，所述第一组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的β-抑制蛋白；（ii第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的质膜PM靶向部分；以及GPCR;其中如果所述抑制蛋白用所述海肾GFP标记，则所述PM靶向部分用所述海肾Luc标记，以及如果所述β-抑制蛋白用所述海肾Luc标记，则所述PM靶向部分用所述海肾GFP标记。这样的生物传感器可以用于监测测量β-抑制蛋白至位于质膜中的GPCR的募集。[0191]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是内体靶向部分。几种内体靶向部分标记物是本领域已知的，包括蛋白的Rab家族RAB4、RAB5、RAB7、RAB9和RABl1、甘露糖6-磷酸受体M6PR、小窝蛋白-1和小窝蛋白-2、转铁蛋白和其受体、网格蛋白以及包括FYVE域的蛋白如早期内体自身抗原1ΦΕΑ1、Rabenosyn_5、用于受体激活的Smad锚（Smadanchorforreceptoractivation，SARA、Vps27p和内体相关蛋白（Endofin。某些标记物对于早期内体更特异例如RAB4、转铁蛋白和其受体以及包括FYVE域的蛋白），其他标记物对晚期内体更特异（例如RAB7、RAB9和M6PR，其他标记物对回收的内体更特异（例如RAB11、RAB4。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接靶向于内体定位。[0192]在一种实施方式中，内体靶向部分包括FYVE域。通过三个保守元件定义FYVE域:N端WxxD、中部RRKHHCR和C端RVC基序。在一种实施方式中，内体靶向部分包括内体相关蛋白的FYVE域，例如人内体相关蛋白的约第739至806位残基。[0193]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是溶酶体靶向部分，例如LAMPl和LAMP2。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接靶向于溶酶体定位。[0194]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是过氧化物酶体靶向部分，例如PMP70、PXMP2和触酶。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接革巴向于过氧化物酶定位。[0195]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是自噬体靶向部分，例如ATG自吞噬相关的）家族蛋白0了64、4了65了616了612，见1^11113等人，自然综述分子细胞生物学（他加代ReviewsMolecularCellBiology14,759-7742013、LC3AB和SQSTMlp62。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接靶向于自噬体定位。[0196]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是核糖体靶向部分。几种内体靶向部分标记物是本领域已知的，并且包括核糖体蛋白（L7a、S3和S6。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接靶向于核糖体定位。[0197]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是内质网ER靶向部分。几种ER靶向部分标记物是本领域已知的，并且包括ERp72、ERp29、蛋白二硫化物异构酶PDI、HSP70家族蛋白（如GRP78HSPA5、GRP94HSP90B1和GRP58PDIA3、钙连蛋白和钙网蛋白。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接靶向于ER定位。[0198]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是高尔基体靶向部分。多种高尔基体靶向部分标记物是本领域已知的，并且包括eN0S例如其N端部分，J.Liu等人，生物化学Biochemistry,351996，ρρ·13277-13281、GM130、高尔基蛋白-97、58K蛋白、反面高尔基体网膜蛋白2TG0LN2、TGN46、TGN38、甘露糖苷酶2、突触融合蛋白6、GM130G0LGA2、高尔基蛋白-160、16!111^111的327、6328、外被体蛋白、1«^^1和此厶31。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接靶向于高尔基体定位。在一种实施方式中，高尔基体靶向部分是人eNOS蛋白的N末端部分，例如人eNOSl的第1至73位残基（SEQIDN0:42。[0199]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是线粒体靶向部分。几种线粒体靶向部分标记物是本领域已知的，并且包括AIFXOXIV、细胞色素C、己糖激酶I、S0D1、SDHA、丙酮酸脱氢酶、VDAC、T0MM22、UCPl、UCP2、UCP3、PHBlGαl2或其N端部分；Andreeva等人，FASEBJ.2008Aug;22⑶：2821-31.Epub2008Mar26、Bcl家族成员的蛋白或其片段，例如Bcl-XL的片段（RKGQERFNRWFLTGMTVAGVVLLGSLFSRK，SEQIDN0:87，Mossalam等人，MolPharm.2012May7;95:1449-1458。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾rGFP以使其连接靶向于线粒体定位。细胞核靶向部分也可以包括线粒体靶向信号，其是指导新合成的蛋白至线粒体的10至70个氨基酸长度的肽。其在N端发现，并且由疏水氨基酸和带正电氨基酸交替形式组成以形成两亲性螺旋。线粒体靶向信号可以包含随后使蛋白靶向于线粒体的不同区域的额外信号，如线粒体基质。[0200]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是细胞核靶向部分。几种细胞核靶向部分标记物是本领域已知的，并且包括核纤层蛋白AC、核孔蛋白（NUP、ASHL2、ESET、组蛋白、1^01、0财修复酶（如?六1^和？841'!10：1。因此，这些蛋白或其适合的片段可以融合于海肾Luc或海肾GFP以使其连接靶向于细胞核定位。细胞核靶向部分也可以包括核定位信号或序列NLS，其是标记通过核运输输入细胞核内的蛋白的氨基酸序列。典型地，该信号由暴露在蛋白表面上的带正电的赖氨酸或精氨酸的一个或多个短序列组成。最佳表征的运输信号是用于核蛋白输入的经典的NLScNLS，其由碱性氨基酸的一个单向monopartite或两个（双向（bipartite伸长部分组成。单向（monopartitecNLS例如SV40大T抗原NLS126Pkkkrrv132SEQIDNO:38，双向（bipartitecNLS例如核质蛋白NLS155KRPAATKKAGQAKKKK17。）（SEQIDN0:39。[0201]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是核输出序列NES^ES是在蛋白中的短氨基酸序列（典型地为4个疏水残基），所述序列使蛋白靶向通过核孔复合物利用核运输从细胞核输出至胞浆。这样的NES的序列可以是例如LxxxLxxLxL，其中“L”是疏水残基通常是亮氨酸），“X”是任意其他氨基酸。在由胞质溶胶移位至细胞核的蛋白（如ERK或MDM2中，使用NES部分检测到BRET信号的减少。[0202]在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是细胞骨架靶向部分，例如肌动蛋白或其片段，或包括肌动蛋白结合域ABD如肌醇-1，4，5-三磷酸-3-激酶-AITPKA的N端F肌动蛋白结合域Johnson和Schell,Mol.Biol.Cell2009年12月15日20卷第245166-5180号）。在一种实施方式中，细胞骨架靶向部分是包括序列MGVADLIKKFESISKEESEQIDN0:88的肽“1^1^8。1:”1^611等人，他七]\161:11〇18.2008]\11;57:605〇[0203]在另一个方面，本发明提供了用于评价对第一和第二条件之间的细胞区室的生物分子的量的调节提高或降低）的生物传感器，所述生物传感器包括:第一组件，所述第一组件包括用结合域所述生物分子的蛋白标记来标记的海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP;以及第二组件，所述第二组件包括用所述蛋白标记物来标记的海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc。[0204]在另一个方面，本发明提供了用于评价对第一和第二条件之间的细胞区室的生物分子的量的调节提高或降低）的生物传感器，所述生物传感器包括:第一组件，所述第一组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的结合于所述生物分子的蛋白标记物；以及第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分;其中，如果用海肾GFP标记所述蛋白标记物，则用海肾Luc标记细胞区室靶向部分，反之亦然。[0205]这样的生物传感器可以用于评价对第一和第二条件例如在试剂存在和不存在的情况下之间的细胞区室中的生物分子的量的调节。如果试剂提高了细胞区室中的生物分子的量，则在存在试剂的情况下BRET信号应提高，反之亦然。[0206]蛋白标记物可以是结合于所述生物分子的任意蛋白或其片段，因此其在所述细胞区室中的浓度或密度取决于所述细胞区室中的所述生物分子例如第二信使，其包括环状核苷酸如〇41^和〇61奶、1?3、046、？1?3、02+离子的浓度或密度。例如，？1中的?^61定位取决于PIP2和或PIP3的存在。如果PM中的PI4,5P2*度降低其在磷脂酶CPLC被激活时发生，因为PI4，5P2被水解），ΡΙΧδ1扩散至胞质溶胶，减少其在PM中的浓度密度。因此，PM的ΡΙΧδΙ或其结合于PIP2和或PIP3的片段，如其PHi或的浓度密度可以用作PM中的生物分子的浓度或密度的指标，所述ΡΙΧδΙ的浓度密度可以通过BRET使用海肾Luc和海肾GFP标记的ΡΙΧδΙ或其片段，例如SEQIDΝ0:25，或使用海肾Luc或海肾GFP标记的ΡΙΧδΙ和海肾Luc或海肾GFP标记的PM祀向部分测量。相似地，某些蛋白的PH域和Phox同源域ΡΧ±或）（例如akt和PLDl与PIP3相互作用，因此，选择用于结合PIP3的包括PH或PX域的蛋白标记物可以用作PM中PIP3的浓度或密度的指标。另一个例子是Cl域也称为佛波酯二酰甘油结合域），其在例如蛋白激酶的N端部分中发现。而且PLCy1可以结合于不同的磷脂包括PIP3Xl域结合于二酰甘油DAG，因此包括Cl域的蛋白标记物可以用作PM中的DAG的浓度或密度的指标。因此，能够结合于生物分子如第二信使的任何蛋白或蛋白域和其在细胞区室中的浓度或密度取决于可以用于这样的生物传感器的所述生物分子的浓度或密度。[0207]术语“生物分子”是指可以由细胞产生或存在于细胞中的分子，例如蛋白、肽、氨基酸、核酸DNA或RNA、脂质或脂肪酸、磷脂、糖多糖或任何其他化合物如ATP、AMP、ADPJ1胺等。在一种实施方式中，生物分子是第二信使（即传递在细胞表面上的受体接收的信号以在胞质溶胶和或细胞核中使分子靶向的分子），例如环状AMP、环状GMP、三磷酸肌醇（IP3、磷脂酰肌醇例如4，5-二磷酸磷脂酰肌醇或PIP2、3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇或PIP3、二酰甘油DAG、Ca2+。在一种实施方式中，生物分子是平PM中发现的疏水分子例如磷脂），如二酰甘油和磷脂酰肌醇。[0208]本文使用的变体是指具有与参比（如天然序列至少60%的一致性或相似性的蛋白多肽，并且保持了其希望的活性，例如结合于靶蛋白和或移位至细胞区室的能力。在进一步的实施方式中，变体具有与参比（如天然序列至少65、70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的相似性或一致性，并且保持其希望的活性。“相似性”和“一致性”是指两个多肽分子之间的序列相似性一致性。可以通过比较比对的序列的每个位置确定相似性或一致性。氨基酸序列之间的相似性一致性的程度是在序列共有的位置处相同或匹配的氨基酸数目的函数。用于比较相似性或一致性的序列的最佳比对可以使用多种算法进行，如Smith和Waterman，1981，Adv·Appl·Math2:482的局部同源算法，Needleman和Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443的同源比对算法，Pearson和Lipman,1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:2444的寻找相似性方法，以及这些算法的计算机化执行（如美国威斯康星州遗传学计算机集团（GeneticsComputerGroup，Madison，Wis.,U.S.A.的威斯康星遗传学软件包中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA。使用Altschul等人，1990，J.Mol.Biol.215:403-10使用公开的默认设置）中描述的BLAST算法，也可以确定序列相似性或一致性。用于进行BLAST分析的软件可以通过国家生物技术信息中心网站http:www.ncbi.nlm.nih.gov获得。[0209]海肾Luc或海肾GFP可以融合于相对于细胞区室靶向部分的N端、内部或C端。在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是PM祀向部分，其融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端。在一种实施方式中，细胞区室靶向部分是内体靶向部分，其融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。[0210]海肾Luc或海肾GFP可以融合于相对于感兴趣的蛋白的N端、内部见例如实施例中描述的具有内在RlucII的Ga亚基）或C端。在一种实施方式中，海肾Luc或海肾GFP融合于感兴趣的蛋白的N端。在另一种实施方式中，海肾Luc或海肾GFP融合于感兴趣的蛋白的C端。[0211]在一种实施方式中，感兴趣的蛋白用海肾Luc标记，细胞区室标记物用海肾GFP标记。[0212]其他域或接头可以存在于上文说明的第一和或第二组件的N端、C端或内部。海肾Luc或海肾GFP可以直接地例如通过肽键或通过适当的接头部分“间接地”共价连接，所述接头部分例如一个或多个氨基酸的接头例如聚甘氨酸接头或另一种类型的化学接头例如糖类接头、脂质接头、脂肪酸接头、聚醚接头、PEG等）。在一种实施方式中，在上文定义的组件之前N端）、之间或之后C端可以插入一个或多个额外的域。在一种实施方式中，海肾Luc和或海肾GFP通过肽键共价连接于感兴趣的蛋白和或细胞区室靶向部分。在一种实施方式中，肽接头存在于海肾Luc或海肾GFP和感兴趣的蛋白或细胞区室靶向部分之间。在多种实施方式中，接头包括约4至约50个氨基酸，约4至约40、30或20个氨基酸，或约5至约15个氨基酸，例如4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸。在进一步的实施方式中，接头是以下实施例1和或图IlA至图IlD中描述的接头中的一种。[0213]在一种实施方式中，第一和第二组件连接在一起以提供单分子生物传感器。第一和第二组件通过接头，优选柔性多肽接头共价连接。在一种实施方式中，柔性多肽接头具有与约50至约500-1000个氨基酸的随机氨基酸序列的长度对应的长度，例如与约100至约400至500个氨基酸，优选约200至400个氨基酸，例如约300个氨基酸的随机氨基酸序列的长度对应的长度。在进一步的实施方式中，柔性接头包括约50至约500-1000个氨基酸的随机氨基酸序列，例如约100至约400至500个氨基酸的随机氨基酸序列，优选约200至400个氨基酸的随机氨基酸序列，例如约300个氨基酸的随机氨基酸序列。用于设计柔性氨基酸接头，更具体地具有最小球状和最大杂乱的接头的方法是本领域已知的。这可以通过例如使用Globplot2.3程序实现。可以进一步优化序列以消除推定的聚集热点（aggregationhotspots、定位域（localizationdomains和或互作基序和磷酸化基序。这样的单分子生物传感器允许在完整细胞中以及自膜制备物中评估BRET。[0214]在另一个方面，本发明提供了编码上文定义的第一和或第二组件的核酸。在一种实施方式中，核酸存在于载体质粒中，在进一步的实施方式中，核酸存在于表达载体质粒中。这样的载体包括能够编码上文定义的第一和第二组件的核酸序列，所述核酸序列可操作地连接于一个或多个转录调节序列如启动子、增强子和或其他调节序列。在一种实施方式中，核酸编码第一和第二组件多顺反子构建体）。[0215]术语“载体”是指能够运输已经与其连接的另一种核酸的核酸分子。一种优选的载体是游离体，即能在染色体外复制的核酸。优选的载体是能够自主复制和或表达它们连接的核酸的载体。能够指导它们可操作地连接的基因的表达的载体在本文中被称为“表达载体”。本发明的重组表达载体可以通过标准技术构建，所述标准技术是本领域技术人员已知的并且可以在例如Sambrook等人.（1989分子克隆：实验指南（MolecularCloning:ALaboratoryManual中找到。各种策略对于DNA片段的连接是可用的，对所述策略的选择取决于DNA片段末端的特性并且可以被本领域技术人员容易地确定。本发明的载体也可以包括促进载体在细菌和宿主细胞中增殖和选择的其他序列元件。此外，本发明的载体可以包括一个或多个限制性核酸内切酶位点的核苷酸序列。如用于选择性标记物和报告基因的编码序列是本领域技术人员熟知的。[0216]可以将包括本发明的核酸序列的重组表达载体导入细胞宿主细胞），所述细胞可以包括能够从定义的重组表达载体表达蛋白质编码区的活细胞。活细胞可以包括培养的细胞和活生物体内的细胞。因此，本发明也提供了包含本发明的重组表达载体的宿主细胞。术语“细胞”、“宿主细胞”和“重组宿主细胞”在本文中可交换地使用。这样的术语不仅是指特定的受试细胞subjectcell，而且是指这样的细胞的后代或潜在后代。因为某些修饰可以由于突变或环境影响而在随后的各代中发生，所以这样的后代事实上可能与亲本细胞不一致，但是其仍然被包括在如本文使用的术语的范围内。[0217]可以通过常规的转化或转染技术将载体DNA导入细胞。术语“转化”和“转染”是指将外来核酸导入宿主细胞的技术，包括磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、显微注射和病毒介导的转染。在例如Sambrook等人分子克隆:实验指南MolecularCloning:ALaboratoryManua1，第二版，冷泉港实验室出版社（1989和其他实验指南中可以找到用于转化或转染宿主细胞的适当的方法。“转录调节序列元件”是指诱导或控制与其可操作地连接的蛋白编码序列转录的DNA序列的通用术语，所述DNA序列如起始信号和终止信号、增强子和启动子、剪接信号、多聚腺苷酸化信号。当第一核酸序列以与第二核酸序列具有功能性关系设置时，第一核酸序列与第二核酸序列“可操作地连接”。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接于编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是连续的，并且在阅读框内在必要时连接两个蛋白编码区。然而，由于例如增强子一般在当增强子与启动子被几千个碱基分隔时起作用并且内含子序列具有可变长度，所以某些多核苷酸元件可操作地连接但是不连续。[0218]在另一个方面，本发明提供了包括编码第一组件的第一核酸和编码第二组件的第二核酸的试剂盒。[0219]在另一个方面，本发明提供了包括或表达上文定义的第一和或第二组件的细胞。在一种实施方式中，已经用编码上文定义的第一和或第二组件的核酸转染或转化细胞。本发明进一步提供了使用例如本领域熟知的培养基和试剂，表达本发明的第一和或第二组件的重组表达系统、载体和细胞，如上文所述的那些。细胞可以是能够表达上文定义的第一和第二组件的任何细胞。用于蛋白表达的适当的宿主细胞和方法是本领域熟知的。可以使用能表达上文定义的组件的任何细胞。例如，可以使用真核生物宿主细胞如哺乳动物细胞例如啮齿动物细胞如小鼠、大鼠和仓鼠细胞系，人细胞细胞系）。在另一种实施方式中，上文提及的细胞是人细胞系，例如胚肾细胞系例如HEK293或HEK293T细胞）。[0220]在一种实施方式中，上述的生物传感器包括含有或表达第一和第二组件的细胞。在另一种实施方式中，上述的生物传感器包括含有第一和第二组件的膜制备物。[0221]在另一个方面，本发明提供了用于在第一和第二条件下在细胞中比较感兴趣的蛋白的运输的方法，所述方法包括:测量在所述第一条件下本文定义的生物传感器中的BRET信号;测量在所述第二条件下本文定义的生物传感器中的BRET信号；其中所述第一和第二条件之间的所述BRET信号的差异表明在所述第一和第二条件下运输所述感兴趣的蛋白的差异。在一种实施方式中，第一条件是无激活，第二条件是激活例如使用激动剂），或反之亦然。在另一种实施方式中，第一条件是无抑制，第二条件是抑制（例如使用拮抗剂），或反之亦然。[0222]在另一个方面，本发明提供了用于确定试剂是否调节提高或降低在细胞区室中的感兴趣的蛋白的密度或浓度的方法，所述方法包括:测量在所述试剂存在和不存在的情况下本文定义的生物传感器中的BRET信号;其中相对于不存在所述试剂的情况下在存在所述试剂的情况下所述BRET信号的差异表明所述试剂调节提高或降低在细胞区室中的所述感兴趣的蛋白的密度或浓度。BRET信号的提高表明了试剂提高了在细胞区室中的所述感兴趣的蛋白的密度或浓度，而BRET信号的降低表明了试剂降低了在细胞区室中的所述感兴趣的蛋白的密度或浓度。[0223]用于测量BRET信号的方法和装置是本领域熟知的。例如通过确定海肾GFP信号的强度光强度和或通过计算由海肾GFP发射的信号或光强度与由海肾Luc发射的信号或光强度之比BRET比），可以测量BRET信号。使用具有用于检测海肾萤光素酶供体和^grGFP受体光发射的适当的滤光器组的酶标仪或显微镜可以测量BRET信号。[0224]通过选择适当的细胞区室靶向部分，评估监测感兴趣的蛋白向任何细胞区室PM、ER、高尔基体、线粒体、内体等）的运输是可能的。例如，为了确定给定条件或试剂是否影响感兴趣的蛋白向线粒体的运输，可以使用用海肾GFP或海肾Luc标记的包括线粒体靶向部分的生物传感器。在存在试剂的条件下或在给定的条件下（相对于不存在试剂的情况或相对于不同条件BRET信号的提高表明感兴趣的蛋白向线粒体的“募集”（即，在线粒体中感兴趣的蛋白的浓度密度增加）。相反，在存在试剂的条件下或在给定的条件下相对于不存在试剂的情况或相对于不同条件BRET信号的降低表明线粒体中感兴趣的蛋白的浓度密度的降低。使用适当的细胞区室靶向部分，可以使用相似的方法研究蛋白向不同细胞区室的运输。[0225]在一种实施方式中，所述方法包括确定试剂或条件是否诱导（即提高）内体区室中的感兴趣的细胞表面受体的运输即提高内体中感兴趣的蛋白的浓度密度）。[0226]因此，在另一个方面，本发明提供了用于比较内体区室中的感兴趣的细胞表面受体的运输的方法，所述方法包括:测量在所述第一条件下包括本文定义的内体靶向部分的生物传感器中的BRET信号；以及测量在所述第二条件下包括本文定义的内体靶向部分的生物传感器中的BRET信号;其中所述第一和第二条件之间的所述BRET信号的差异表明了在所述第一和第二条件下所述内体区室中所述感兴趣的蛋白的运输的差异。[0227]在另一个方面，本发明提供了用于确定试剂是否诱导（即提高细胞中内体区室中的感兴趣的细胞表面受体的运输的方法，所述方法包括:测量在存在和不存在所述试剂的情况下，包括内体靶向部分的生物传感器中的BRET信号，所述内体靶向部分优选为包括如本文定义的FYVE域例如内体相关蛋白的FYVE域的内体靶向部分;其中相对于不存在所述试剂的情况在存在所述试剂的情况下更高的BRET信号表明所述试剂诱导（即提高细胞中所述内体区室中的感兴趣的细胞表面受体的运输（即提高内体中的感兴趣的蛋白的浓度密度）。[0228]如本文描述的实验所显示的，评估监测蛋白通过内体途径运输是可能的，例如通过使用多种生物传感器，每种所述生物传感器包括不同的内体靶向部分例如第一生物传感器包括早期内体的靶向部分，第二生物传感器包括晚期内体的靶向部分）。[0229]在另一个方面，本发明提供了用于比较第一和第二条件下细胞中感兴趣的细胞表面受体的内化的方法，所述方法包括:测量在所述第一条件下包括本文定义的PM靶向部分的生物传感器中的BRET信号；以及测量在所述第二条件下包括本文定义的PM祀向部分的生物传感器中的BRET信号;其中所述第一和第二条件之间的所述BRET信号的差异表明在所述第一和第二条件下所述感兴趣的细胞表面受体的内化的差异。[0230]在另一个方面，本发明提供了用于确定试剂诱导细胞中感兴趣的细胞表面受体的内化和或分离的方法，所述方法包括:测量在存在和不存在所述试剂的情况下，包括如本文定义的PM靶向部分的生物传感器中的BRET信号；其中，相对于不存在所述试剂的情况在存在所述试剂的情况下较低的BRET信号表明所述试剂诱导感兴趣的细胞表面受体的内化和或分离。[0231]本文描述的生物传感器进一步允许确定内化的受体是否回收回细胞表面，如果是这样，则评估受体回收的动力学。[0232]在另一个方面，本发明提供了用于监测细胞表面感兴趣的内化受体的回收的方法，所述方法包括：（a在存在诱导所述受体内化的配体的情况下，接触包括本文定义的PM靶向部分的生物传感器；（b测量生物传感器中的第一BRET信号；（c洗涤所述生物传感器以去除所述配体；（d在所述洗涤后测量生物传感器中的第二BRET信号；（e通过比较第一和第二信号确定细胞表面感兴趣的内化受体的回收，其中相对于所述第一BRET信号更高的第二BRET信号表明了细胞表面感兴趣的内化受体的回收。[0233]在另一个方面，本发明提供了用于监测细胞表面感兴趣的内化受体的回收的方法，所述方法包括:在存在诱导所述受体内化的配体的情况下使包括如本文定义的PM靶向部分的第一和第二生物传感器接触；（b在所述接触后测量第一生物传感器中的BRET信号；c洗涤所述第二生物传感器以去除所述配体；（d在所述洗涤后测量第二生物传感器中的BRET信号；和e通过比较第一和第二生物传感器中的BRET信号确定细胞表面感兴趣的内化受体的回收，其中相对于所述第一生物传感器，所述第二生物传感器中更高的BRET信号表明了细胞表面感兴趣的内化受体的回收。[0234]在一种实施方式中，所述方法进一步包括在洗涤后以不同的时间重复步骤d和e，研究感兴趣的内化受体的回收的动力学。[0235]在另一个方面，本发明提供了用于监测第一条件和第二条件之间G蛋白和SGPCR活性的调节的方法，所述方法包括:测量在所述第一条件下用于监测如本文定义的G蛋白和或GPCR调节的生物传感器中的BRET信号；和测量在所述第二条件下用于监测如本文定义的G蛋白和或GPCR调节的生物传感器中的BRET信号；其中，所述第一和第二条件之间的BRET信号的差异表明所述第一和第二条件之间的G蛋白和或GPCR活性的调节。[0236]在一种实施方式中，第一条件是不存在测试化合物例如推定的抑制剂或激动剂）的情况，第二条件是存在测试化合物的情况，或反之亦然。在存在测试化合物的情况下较低的BRET信号表明测试化合物是激动剂。[0237]在另一个方面，本发明提供了用于确定GPCR配体是否调节感兴趣的G蛋白亚基的活性的方法，所述方法包括:测量在存在或不存在所述GPCR配体的情况下，用于监测本文定义的G蛋白和或GPCR调节的生物传感器中的BRET信号;其中在存在所述GPCR配体与不存在所述GPCR配体的情况下BRET信号的差异表明所述GPCR配体调节感兴趣的G蛋白亚基的活性。[0238]在另一个方面，本发明提供了用于监测第一条件和第二条件之间小GTP酶的活性的调节的方法，所述方法包括:测量在所述第一条件下用于评估如本文定义的小GTP酶的激活的生物传感器的BRET信号；和测量在所述第二条件下用于评估如本文定义的小GTP酶的激活的生物传感器的BRET信号;其中所述第一和第二条件之间BRET信号的差异表明所述第一和第二条件之间小GTP酶活性的调节。[0239]在一种实施方式中，第一条件是不存在测试化合物（例如推定的抑制剂和激动剂），第二条件是存在测试化合物，或反之亦然。在存在测试化合物的情况下较高的BRET信号表明测试化合物是激动剂PM或内体中小GTP酶的募集）。[0240]在另一个方面，本发明提供了用于确定测试试剂是否调节小GTP酶例如Rho蛋白）活性的方法，所述方法包括:测量在存在或不存在所述测试试剂的情况下，用于评估本文定义的小GTP酶的激活的生物传感器的BRET信号；其中在存在所述测试试剂的情况下与不存在所述测试试剂的情况下BRET信号的差异表明所述测试试剂调节所述小GTP酶的活性。[0241]使用本文描述的生物传感器，通过药物分子伴侣PC评估监测感兴趣的蛋白（例如不适当地从ER离开的缺陷蛋白）的“拯救”也是可能的。如本文使用的术语“药物分子伴侣”（“PC”）是指结合于蛋白（例如受体并且具有以下作用中的一种或多种的分子：⑴提高蛋白的稳定分子构象的形成；（ii提高蛋白从ER至其他细胞位置，优选天然细胞位置的适当运输，即防止蛋白的ER相关的降解；（iii防止构象不稳定地聚集，即错误折叠的蛋白；iv恢复或提高蛋白的至少部分野生型功能、稳定性和或活性和或V诱导蛋白的不同折叠。因此，用于蛋白的药物分子伴侣是结合于蛋白（导致蛋白的适当的折叠、运输、不聚集和或活性），和或调节蛋白折叠诱导不同于不存在分子伴侣情况下折叠的蛋白的折叠）的分子。[0242]之前已经显示了与溶酶体贮积病LSD相关的酶的小分子抑制剂可以拯救突变的酶的折叠和活性，以及提高野生型酶的折叠和活性见美国专利号6,274,597;6,583,158;6，589，964;6，599，919和6，916，829。尤其，发现施用葡萄糖和半乳糖的小分子衍生物有效地提高了突变酶的体外和体内稳定性，以及提高了突变酶的活性，所述小分子衍生物是与LSD相关的突变酶的特异性竞争性抑制剂。该策略背后的原有理论如下：因为ER中突变酶蛋白不适当地折叠（Ishii等人,Biochem.Biophys·Res·Comm.1996;220:812-815，酶蛋白在正常运输途径ER—高尔基体—内体—溶酶体）中阻滞和迅速降解。因此，使突变蛋白的正确折叠稳定的化合物会充当对突变蛋白活性位点特异性的分子伴侣，以促进其顺利从ER质量控制系统离开。酶抑制剂占据催化中心，导致细胞中和动物中的酶构象的稳定。这些特定的分子伴侣指定为“活性位点特异性分子伴侣ASSC”，这是由于它们结合于酶的活性位点。[0243]除了拯救突变酶，ASSC提高重组野生型酶的ER分泌和活性。ASSC促进过表达野生型酶的折叠，其另外在ER质量控制系统中被阻滞，因为酶的过表达和过度产生超过了ER的能力，导致蛋白聚集和降解。因此，在折叠期间诱导酶的稳定分子构象的化合物充当“分子伴侣”，使酶稳定在适当的构象用于从ER离开。正如上文说明的，对于酶，一种这样的化合物意料不到地成为了酶的竞争性抑制剂。[0244]除了LSD，大量和不同的疾病目前被认为是由采用了非天然蛋白构象导致的“构象疾病”，其会引起ER中的蛋白阻滞和蛋白的最终降解Kuznetsov等人，N.Engl.J.Med.1998;339:1688-1695;Thoma等人，TrendsBiochem.Set1995;20:456-459;Bychkova等人，FEBSLett·1995;359:6-8;Brooks，FEBSLett·1997;409:115-120。例如，发现小的合成化合物使突变形式的肿瘤抑制蛋白p53的DNA结合域稳定，由此使蛋白保持活性构象Foster等人，Science1999;286:2507-10。显示受体的合成被小分子受体拮抗剂和配体拯救Morello等人，JClin.Invest.2000;105:887-95;Petaja-Repo等人·，EMB0J.2002;21:1628-37。甚至使用通道阻断药物或底物证明了膜通道蛋白和其他质膜运输蛋白的药理学拯救Rajamani等人，CircuIation2002;105:2830-5;Zhou等人·，JBiol·Chem.1999;274:31123_26;Loo等人，J.Biol.Chem.1997;272:709_12;Pedemonte等人，J.Clin.Invest.2005;115:2564-71。因此，本文描述的生物传感器可以用于鉴定拯救蛋白的表达和或适当成熟的分子伴侣，反过来其可以用于治疗与如上文描述的一种或多种蛋白的表达和或适当成熟缺陷相关的疾病。[0245]在另一个方面，本发明提供了用于确定试剂是否充当感兴趣的受体的药物分子伴侣的方法，所述方法包括：[0246]提供生物传感器，所述生物传感器包括：细胞，所述细胞包括：用海肾GFP或海肾Luc标记优选用海肾Luc标记的感兴趣的受体；用海肾GFP或海肾Luc标记优选用海肾GFP标记的质膜PM靶向部分;其中如果所述受体用海肾GFP标记，则所述PM靶向部分用海肾Luc标记，如果所述受体用海肾Luc标记，则所述PM祀向部分用海肾GFP标记；以及[0247]测量在存在和不存在所述试剂的情况下BRET受体信号；[0248]其中，相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下，BRET信号的提高表明所述试剂充当所述受体的药物分子伴侣。[0249]在另一个方面，本发明提供了用于确定试剂是否充当感兴趣的蛋白的药物分子伴侣的方法，所述方法包括：[0250]提供生物传感器，所述生物传感器包括：细胞，所述细胞包括：用海肾GFP或海肾Luc标记的感兴趣的蛋白；用海肾rGFP或海肾Luc标记的内质网ER靶向部分;其中如果所述蛋白用海肾GFP标记，则所述ER靶向部分用海肾Luc标记，如果所述蛋白用海肾Luc标记，则所述ER靶向部分用海肾GFP标记；以及[0251]测量在存在和不存在所述试剂的情况下BRET受体信号；[0252]其中，相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下，BRET信号的降低表明明所述试剂充当所述受体的药物分子伴侣。[0253]可以使用如本文描述的实验中的天然蛋白受体或突变的受体进行上述的方法。本文描述的实验进一步显示了生物传感器适合于测量GPCR以及非GPCR受体（电压依赖型钾通道）的拯救，提供了它们可以用于监测任何蛋白或受体的拯救的证据。在一种实施方式中，蛋白是天然GPCR或突变的GPCR。在进一步的实施方式中，GPCR是天然黑皮质素4受体MC4R或突变的MC4R。在一种实施方式中，突变的MC4R包含导致MC4R多肽的胞内折叠减少或不正确的一个或多个突变。示例性的突变如下：密码子211处的？781^、1?165〇、1?1651I125K、C271Y、A175T、I316L、I316S、I317T、N97D、G98R、N62S、C271R、S58C、N62S、N97D、Y157S、I102S、L106P、L250Q、Y287X、P299H、S58C、CTCT和密码子244处的TGAT插入。在另一种实施方式中，GPCR是天然V2R或突变的V2R。在进一步的实施方式中，突变的V2R包括Y128S或W164S置换。在另一种实施方式中，蛋白是离子通道，天然离子通道或突变的离子通道，在进一步的实施方式中，所述蛋白是电压门控钾通道如hERG。[0254]在一种实施方式中，用于确定试剂是否充当药物分子伴侣的以上方法进一步包括确定拯救的蛋白受体是否是功能性的，例如使用配体确定拯救的蛋白受体是否是功能性的。[0255]在另一个方面，本发明提供了用于确定试剂是否诱导在质膜PM中β-抑制蛋白的募集的方法，所述方法包括：[0256]提供生物传感器，所述生物传感器包括:细胞或膜制备物，所述细胞或膜制备物包括：用海肾GFP或海肾Luc标记，优选用海肾Luc标记的所述β-抑制蛋白；用海肾GFP或海肾Luc标记，优选用海肾GFP标记的质膜PM靶向部分；以及GPCR;其中如果所述β-抑制蛋白用海肾GFP标记，则所述PM靶向部分用海肾Luc标记，如果所述β-抑制蛋白用海肾Luc标记，则所述PM祀向部分用海肾GFP标记；以及[0257]测量在存在和不存在所述试剂的情况下的BRET受体信号；[0258]其中相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下所述BRET信号的提高表明所述试剂诱导PM中所述β-抑制蛋白的募集。[0259]上述的方法包括使生物传感器与海肾Luc的底物如荧光素接触，以产生将由rGFP接受激发rGFP的能量（以光的形式）。荧光素的非限制性的例子包括D-荧光素、基于咪唑并吡嗪酮的化合物如腔肠素腔肠素400ADeepBlueC™、腔肠素H和e-腔肠素的类似物如来自Nanolight™的ProlumePurple™、ViviRen™来自Promega、Latia焚光素（E-2_甲基-4-2,6,6_三甲基-1-环己-1-基-1-丁-1-醇甲酸酯）、细菌荧光素、腰鞭毛虫荧光素等。在一种实施方式中，底物是腔肠素400A、腔肠素H或ProlumePurple™。[0260]如本文使用的，术语“试剂”用于指用于测试生物活性的任何分子，例如蛋白、寡肽、小有机分子、多糖、多核苷酸等。这样的试剂可以从包括合成化合物或天然化合物的文库的任意数目的来源中获得。例如，很多手段对于随机和定向合成多种有机化合物和生物分子是可用的，包括随机化寡核苷酸的表达。供选择地，细菌、真菌、植物和动物提取物形式的天然化合物的文库是可用的或容易生产的。此外，通过常规的化学、物理和生物手段，容易改性天然或合成生产的文库和化合物。[0261]阳性对照和阴性对照可以用于方法测定。对照和测试样本可以进行多次以获得统计学上显著的结果。[0262]在一种实施方式中，上文提及的方法是高通量方法（高通量筛选，HTS。本文使用的术语“高通量筛选”（HTS是指允许快速地和平行地筛选对靶分子具有结合活性或生物活性的大量化合物数百、数千）的方法。这样的HTS方法典型地在具有数个孔，例如384、1536、或3456个孔的微量滴定板上进行。对于HTS重要的是以高敏感性、精确性和重现性检测读出信号。[0263]实施本发明的方式[0264]通过以下非限制性实施例更详细地说明本发明。[0265]实施例1:材料与方法[0266]材料·血管紧张素11AngII;[Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe]，SEQIDNO:、聚鸟氨酸、聚D-赖氨酸、异丙肾上腺素、精氨酸-血管升压素（AVP、缓激肽来自Sigma®。前列腺素F2aPGF2a、前列腺素E2和u46619来自Cayman0ieKlical®AnnArbor,MI〇[Sar1Ule8]-AngIISI和[Asp1Jal^Gly8]-AngIIDVG[Sarl-Val5-D-Phe8]AngIISVdF和[Sarl-D-Ala8]AngIITRV120027合成于舍布鲁克大学（加拿大，QCWBO-QK^i得自波恩大学药物生物学研究所（InstituteforPharmaceuticalBiologyoftheUniversityofBonn德国）。碘-125获得自PerkinE丨merK。杜氏改良伊戈尔培养基DMEM、胎牛血清、ΟΡΤΙ-ΜΈΜ®和其他细胞培养试剂购买自1脾itogen气腔肠素400a、腔肠素H和ProlumePurpleI购买自Go丨dbi〇K或Nan〇light〖Technology^Z烯亚胺（PEI;25kDa线性型；购买自Polysciences沃灵顿，PA，USA。鲑鱼精子DNA购买自LifetechnologiesThermoFisherePhusionDNA聚合酶来自ThermoScientificκ。限制酶和T4DNA连接酶获得自ΝΕΒ®。[0267]质粒和构建.对于Iyn-GFPlO的构建，人Lyn激酶的前11个残基MGCIKSKGKDS，SEQIDN0:1的编码序列和GFPlO的完整编码区在GeneScript®Piscataway，NJ合成，并且使用融合（CI〇ntech®,CA被亚克隆至pcDNA3.1zeo-。通过用PCR扩增产生的人源化rGFP替换Iyn-rGFP构建体中的GFP10的编码序列来产生Iyn-rGFP。Str印tagII融合的GFP10在GenScript®合成，并且被亚克隆至pCDNA3.1ze〇㈠（STII-GFP10。人内体相关蛋白的FYVE域第739-806位氨基酸在BioB职ic®公司（安大略，加拿大合成，并且被框内亚克隆至STII-GFP10构建体GFP10-内体相关蛋白FYVE。通过将GFPlO-内体相关蛋白FYVE的FYVE域框内插入含有人源化rGFP的载体pcDNA3.1+来产生rGFP-内体相关蛋白FYVE。通过将rGFP-内体相关蛋白FYVE中的FYVE域替换为PCR扩增的rab4和rabll编码序列来分别产生rGFP-rab4和rGFP-rabll。为了产生RlucII融合的AT1R，将含有信号肽和Flag序列的人ATlR编码序列PCR扩增并且通过NheI和HindIII位点框内亚克隆至还含有RlucII的pcDNA3.1hygro+中。之前已经描述了编码人0arr2-RlucII的质粒Quoyer，Janz等人2013。通过PCR使用公开的MC4R_Venus构建体（P.Ren6等人.JPharmacolExpTher.2010Dec;3353:520-32和hV2RwtMorello，J.P·，等人，JClinInvest,2000.1057:ρ·887-95获得RlucII标记的受体。通过PCR使用由D.Deblois蒙特利尔大学Universit6deMontreal，蒙特利尔，加拿大馈赠的编码hERG的质粒获得RlucII标记的受体。通过PCR由合成的编码序列（来自GenScript,USA获得海肾GFPrGFP构建体。PH域标记的RlucII和rGFP:使用PLCδ1成像克隆（MAGE:5769665作为模板PCR扩增ΡΙΧδ1的PHi或。通过亚克隆至XbaI和HindIII位点使用PCR产物替换GFPlO-内体相关蛋白FYVE中的内体相关蛋白FYVE域。将GFPlO-PHΡΙΧδ的PH域框内插入含有人源化rGFP的载体pcDNA3.1+或含有HA-RlucII的载体口。0嫩3.1+分别为“卩卩-卩!1?〇^1和似-此11。11-?!1?1^^1。11]^41?-1?111。11:通过从MC4R-venus构建体PCR扩增MC4R获得编码融合蛋白hMC4Rwt-RlucII、hMC4RR165Q-RlucII和hMC4R-P299H-RlucII的质粒，并且框内亚克隆至pcDNA3.IRIucII载体（接头序列：VGGGGSKLPAT，SEQIDN0:2中人源化海肾荧光素酶IIhRlucII序列（之前报告的hRluc变体（Leduc，Breton等人2009的N端。hV2R-RluclI:使用QuickChange™突变试剂盒AgilentTechnologies，Santa-Clara，USA，以定点突变生产Y128S置换的V2R。通过PCR扩增V2R编码序列获得编码融合蛋白hV2RWt-RlucIIandhV2RY128S-RlucII的质粒，并框内亚克隆至pcDNA3.1RlucII载体接头序列：GGSGLKLPAT，SEQIDN0:3中hRlucII序列的N端。hERG-RlucII:通过PCR扩增编码hERG的第1-379位残基、hERG的第373-1159位残基和RlucII的3个片段，获得编码融合蛋白hERGWt-RlucII和hERGG601S-RlucII的质粒，并且通过Gibson组装（NewEnglandBiolabspcDNA3.1+载体亚克隆（接头在RlucII的N端：NAAIRSGG，SEQIDN0:4和在RlucII的C端：GGNAAIRS，SEQIDNOAhrGFP-CAAX:通过用编码接头的反向引物序列:GSAGTMASNNTASG，SEQIDN0:6PCR扩增rGFP编码序列，以及通过PCR扩增来自KRAS剪接变体b的质膜靶向多碱序列和异戊二烯化信号序列（-GKKKKKKSKTKCVIM，命名：CAAX，SEQIDN0:7获得编码融合蛋白rGFP-CAAX的质粒。CAAX质膜靶向序列框内融合于rGFP编码序列的C端。将PCR片段亚克隆至pcDNA3.1+载体。rGFP-PB:使用PCR扩增和Gibson组装，通过用GRK5质膜靶向域PB;序列：SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKS，SEQIDN0:8替换rGFP-CAAX的CAAX基序获得编码融合蛋白rGFP-PB的质粒。使用编码PB的寡核苷酸通过PCR扩增完整载体p⑶NA3.1+rGFP-CAAX。用DpnI消化PCR反应产物，将其纯化和在Gibson组装反应中再循环。RlucII-GRB2的克隆：PCR扩增人GRB2变体1的编码序列，并将其亚克隆在载体PCDNA3.1+RlucII的RlucII的C端，其中在GRB2和RlucII之间具有小柔性结构序列:GSAGT，SEQIDN0:9。通过使用PhUSioiliiDNA聚合酶进行所有PCR。在使用前通过DNA测序验证所有构建体。[0268]细胞培养和瞬时转染.在37°C下，在具有5%⑶2的加湿气氛中将人胚肾293HEK293细胞保持在补充了10%胎牛血清、100个单位ml青霉素链霉素的杜氏改良伊戈尔培养基（DMEM中。在补充了5%胎牛血清和20ygml庆大霉素的DMEM中培养HEK293SL细胞。在37°C下在5%CO2和90%湿度中使细胞生长。[0269]使用磷酸钙转染:使用磷酸钙法Fessart,Simaan等人·2005转染HEK293SL细胞。在转染前一天以每IOOmm皿约7.5XIO5的密度接种细胞，如之前描述地进行转染Fessart，Simaan等人.2005。转染18小时后，更换培养基，分离细胞用于后续实验。所有测定在转染后48小时进行。[0270]使用聚（乙烯亚胺）（PEI转染:在实验前两天，用不含有钙或镁的PBS洗涤来自6孔板的HEK293细胞，使细胞分离detach并使用PEI作为转染试剂（以PEIDNA为3:1的比例）用指定的质粒转染，然后将其以每孔35000个细胞的密度直接接种于用聚L-鸟氨酸氢溴酸盐预处理的96孔板中。[0271]稳定的rGFP-CAAX细胞系.用磷酸盐缓冲盐水PBS洗涤来自6孔板的HEK293细胞，使用聚乙烯亚胺25-kDa线性（PEI作为转染试剂（以PEIDNA为3:1的比例）用1.2ug编码rGFP-CAAX的构建体孔转染HEK293细胞Hamdan,Rochdi等人.2007。rGFP-CAAX构建体还编码潮霉素抗性，将转染的细胞接种于T75皿，保持选择100ygml的潮霉素4周，在表达不同水平的rGFP-CAAX的群体中对GFP荧光FACS分选潮霉素抗性细胞。[0272]图IB至图9D和图25D至图25F的BRET测量.转染的第二天，使细胞分离并以约25，000个细胞孔的密度重新铺在聚鸟氨酸包被的白色96孔板中。第三天，用预热的台氏缓冲液（140mMNaCl，2.7mMKCl，lmMCaCl2，12mMNaHC03,5.6mMD-葡萄糖，0.5mMMgCl2,0.37mMNaH2P〇4,25mMHEPES，pH7.4洗涤细胞一次，然后在37°：下用各种浓度的配体在台氏缓冲液中的溶液刺激指定的时间，或用单个浓度的配体刺激各种次数。对于回收实验，在37°C下用配体刺激细胞30分钟后，将其用冰冷的台氏缓冲液洗涤三次，或用台氏缓冲液洗涤一次用酸50mM柠檬酸纳，pH4.0洗涤三次用台氏缓冲液洗涤两次。所有洗涤步骤在冰上进行。然后在37°C下在水浴中进一步与台氏缓冲液进一步温育细胞45分钟。在BRET测量之前3〜4分钟，以5μΜ的终浓度在台氏缓冲液中添加细胞可透过性底物腔肠素400a。通过使用具有分别用于检测RlucII海肾荧光素酶供体和GFPlO或rGFP受体光发射的410土80nm和515±30nm滤光器套件的Synergy2BioTek:®:酶标仪进行测量。通过计算由GFPlO或rGFP发射的光强度与RlucII发射的光强度的比确定BRET信号。所有BRET测量在37°C下一式三份地进行。[0273]用于评价细胞表面表达和功能性的PC拯救的BRET测定（分离测定）.在图12A至图18E中，使用如本部分描述的PEI瞬时转染HEK293细胞。96孔板的每孔中转染的DNA如下：图12A和图12B中，转染了2.4ng编码hMC4R-RlucII的构建体，以及图12A中的提高量的高至9.61^的冗??-04六乂1^18，图128中提高的量的高至9.6即的冗??-?8;图134至图13：中，转染了0·6、1·2或2.4nghMC4R-RlucII，以及4.8ngofrGFP-CAAXKras;图13D中，转染了2.4ng多顺反子rGFP-CAAXKrasMC4R-RlucII构建体；图13E中，转染了1.2nghV2R-RlucII和4.8ngrGFP-CAAXKras;图14A至图16B中，转染了2.4nghMC4R-RlucII和7.2ngrGFP-CAAXKras;用0.6、1.2或2.4nghMC4R-RlucII转染了稳定表达rGFP-CAAXKras的HEK293细胞;在图17A中，或转染了0.6、1.2或2.4nghV2R_Y128S-RlucII;在图17B中；在图18八和图188中转染了0.6、1.2或2.4即1^1«-1?111311和4.8即冗??-0厶厶乂1瓜8;在图18：至图18E中转染了0.6nghERG-RlucII和7.2ngrGFP-CAAXKras。在转染后2天进行BRET测定之前，用如每幅图所指出的药物分子伴侣对于MC4R:DCPMPN-2R-32,4-二氯苯基-Ια-2-1-甲氧基丙-2-基氨基）甲基苯基哌嗪-1-基-1-氧代丙-2-基丙酰胺或化合物1;对于V2R:SR121463;对于hERG:阿司咪唑、西沙必利、奎尼丁、多西他赛、胺碘酮和对乙酰氨基酚或载体处理接种于96孔板中的转染的细胞16至18小时。对于BRET测定，用I3BS洗涤细胞一次，然后置于台氏缓冲液中。然后在37°C下任选地用ΙΟμΜα-MSH针对MC4R处理细胞1小时，以评价作为细胞表面表达的受体的激动剂诱导的分离的函数的功能的PC拯救（图13。以2.5μΜ的终浓度添加Rluc底物Coel-400a对于BRET2实验或腔肠素H对于BRETl实验，图13E和15B和15D，进一步温育细胞额外的5分钟。然后使用配备有以下滤镜的MithrasLB940多模式酶标仪收集BRET值：对于BRET2:400nm±70nm能量供体）和515nm±20nm能量受体），以及对于BRETl:480nm±20nm能量供体）和530nm±20nm能量受体）。通过计算由受体发射的光与RlucII发射的光的比来确定BRET值。[0274]使用rGFP标记物募集财φ制蛋白至质膜:对于图19B至图19D，用如之前描述的PEI，以96孔板的每孔3ng0抑制蛋白I-RlucII图19B和图19D或β抑制蛋白2-RlucII图19C和图19E+4.8ngPM标记物（rGFP-CAAX=红色三角形、GFPIO-CAAX=圆圈、rGFP-PB=绿色三角形和Lyn-rGFP=正方形）+IOngV2R图19D和图19E或4Ong02AR图19B和图19C转染HEK293细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下用指定的剂量洗涤并刺激细胞10分钟。然后以2.5以1的终浓度添加：〇61-400，温育额外的5分钟。使用1^^以每标仪BertholdTechnologies，在37°C下测量BRET。使数据标准化为用GFPlO-CAAXKras构建体获得的最大响应的比。对于图19F，将2OOng02AR、2Ong0-抑制蛋白2-RlucII、800ngrGFP-CAAX的转染混合物，用PEI:DNA比为3:1的ssDNA和PEI补充至2yg，添加至3mlHek293SL350,000个细胞ml。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育2分钟，然后在37°C下用指定剂量的异丙肾上腺素处理2分钟。然后以2.5μΜ的终浓度添加Coel-400a，温育额外的6分钟。使用Tristar酶标仪BertholdTechnologies，在37°C下测量BRET。对于图19C、图19E、图19H和图191，用如之前描述的PEI，以96孔板中的每孔3ng0抑制蛋白2-RlucII图19C和图19E+4.8ngrGFP-CAAXKras+IOngV2R图191或4Ong02AR图19H转染HEK293细胞。转染后48小时，洗涤细胞，在37°C下，96孔板的一半用IOOnMAVP图19H或用ΙμΜ的异丙肾上腺素刺激细胞10分钟，板的另一半用载体刺激。然后以2.5μΜ的终浓度添加CoeI-400a，温育额外的5分钟。使用Tristar酶标仪（BertholdTechnologies，在37°C下测量BRET。如Zhang等人（Zhang,Chung等人.1999描述的计算Z’因子。对于图19J和图19G，在IOOmrn皿中接种HEK293SL细胞，然后第二天用9Ong0抑制蛋白2-RlucII和480rGFP-CAAXKras以及600ngATlR以如之前描述的磷酸钙法转染细胞。转染后24小时，在测量BRET之前，在室温下将细胞重新铺于96孔板上，然后第二天洗涤细胞，96孔板的一半用IOOnMAngII图19J，板的另一半用载体刺激（图19G。在IOOmm皿中，用ATlR600ng和β抑制蛋白2-RlucII90ng以及Lyn-rGFP480ng、rGFP-CAAX480ng或GFP10-CAAX480ng转染HEK293SL细胞。第二天，将细胞重新铺在96孔板上。转染后48小时，在测量BRET之前，用各种浓度的AngII刺激细胞6分钟。AngII刺激2分钟后，添加腔肠素400a终浓度为5μΜ。使用Synergy2Bi〇TekK酶标仪在室温下测量BRET。如Zhang等人Zhang,Chung等人.1999的描述计算Z’因子值。[0275]财Φ制蛋白募集单分子传感器:对于图21B，将具有不同接头的用PEI:DNA比为3:1的ssDNA和PEI补充至Iyg的200ngV2R-pRK5、5Ong02AR单分子传感器添加至I.2mlHEK293SL。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育60分钟，然后在37°C下用AVPIOOnM处理10分钟。以2.5μΜ的终浓度添加腔肠素400acoel-400aBiotium，温育额外的5分钟。使用MithrasLB940多模式酶标仪BertholdTechnologies，在37°C下测量BRET比。对于图21C，IX转染:将用PEI:DNA比为3:l的ssDNA和PEI补充至4μg的400ngsphATlR、具有200个残基长度的接头的200ngf32AR单分子传感器添加至7mlmlHEK293SL。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育60分钟，然后在37°C下用不同浓度的配体处理5分钟。以2.5μΜ的终浓度添加腔肠素400acoel-400aBiotium，温育额外的5分钟。在37°C下使用MithrasLB940多模式酶标仪（BertholdTechnologies测量BRET比。[0276]单分子DAG传感器.对于图22B和图22C，在补充了10%FBS和20ygml庆大霉素的01^]«中培养稳定表达1^七141?约50加〇111^的册129331^细胞，并且以75,000个细胞100111111皿的密度接种，第二天使用之前描述的磷酸钙方法用150ng编码DAG单分子传感器的构建体瞬时转染。转染后48小时，洗涤细胞，添加Coel-400a至终浓度为5μΜ，温育3分钟。对于图22Β，每4秒测量BRET，然后在64秒时添加AngII至终浓度为100ηΜ，评价激动剂促进的刺激的动力学。数据为代表性实验的一式三份的平均值土S.E.。对于图22C，在BRET测量之前用指定浓度的AngII刺激细胞。数据为六次独立实验的平均值土S.E.。对于图22D和图22E，根据Roche的方案，以2:1的fugene:DNA比用FuGENEHD转染Hek293SL细胞。6孔板的每孔转染用ssDNA补充至Iug的IOng编码单分子传感器的构建体和对于受体为400ng编码单分子传感器的构建体（图22D的FP和图22E中的GPR14。转染后48小时，洗涤细胞，在台氏缓冲液中温育1小时。然后用指定的剂量的其各自的配体刺激细胞（图22D中用PGF2a和PGE2，图22E中用硬骨鱼紧张肽111分钟，然后以2.5μΜ的终浓度添加Coel-400a额外的5分钟。对于图22F，如图22D转染细胞，但仅用编码单分子DAG传感器的构建体转染细胞。转染后48小时，洗涤细胞，在台氏缓冲液中温育1小时。以2.5μΜ的终浓度添加Coel-400a额外的5分钟。然后用5μΜm-3m3FBS或仅用载体刺激细胞指定的时间。对于图22G和图22H，分别如图22D和图22E转染细胞。转染后48小时，洗涤细胞，在台氏缓冲液中温育1小时。96孔板的一半用IOOnM配体刺激图22H中用PGF2a，图22G中用硬骨鱼紧张肽II1分钟，另一半用载体刺激。然后以2.5μΜ的终浓度添加Coel-400a，温育额外的5分钟。对于图22D至图22Η，在37°C下使用MithrasLB940多模式酶标仪BertholdTechnologies测量BRET比。[0277]基于Clb募集至rGFP标记物的DAG传感器.对于图23B至图23D，如已经描述的使用PEI，用以ssDNA补充至Iyg的IOOngRlucII-Clb、500ngrGFP-CAAXKras和IOOng人组胺1型受体（HlR，Gq偶联受体）、人缓激肽2型受体（BKRB2，Gq偶联受体）或人多巴胺2型受体D2R，用作阴性对照的Gi偶联受体转染HEK293细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在室温下在台氏缓冲液中温育1小时。用指定剂量的其各自的激动剂（组胺用于H1R，胰激肽用于BKRB2以及多巴胺用于D2R温育细胞5分钟。然后以2μΜ的终浓度添加ProlumePurpleTM额外的5分钟。使用SynergyNeo多模式酶标仪BioTekInstruments公司）进行BRET测量。对于图23E，将以PEI:DNA为3:1的比例补充了ssDNA和PEI至Iyg的1〇〇叫02六1?、2〇1^1?111311-Clb、400ngrGFP-CAAXKras和IOOngWTGal5或IOOng空载体（模拟）添加至1.2mlHek293SL350000个细胞ml。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育60分钟。然后以2.5μΜ的终浓度添加腔肠素400a，温育6分钟。然后用指定剂量的异丙肾上腺素处理细胞1分钟。在37°C下使用Tristar多模式酶标仪BertholdTechnologies测量BRET0[0278]基于G蛋白移位的传感器:对于图24B至图24D，将以PEI=DNA为3:1的比的ssDNA和PEI补充至Iyg的IOOngHA-mAR或HA-02AR、5ng指定的RlucII-Gy、100ngWTGal5、100ngWTGm、200ngrGFP-CAAXKras添加至1.2mlHek293SL350,000个细胞ml图24B和图24C，或以2x的量添加至3mlHEK293SL350,000个细胞ml图24D。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育60分钟。然后以2.5μΜ的终浓度添加腔肠素400a，并且温育6分钟。用ΙμΜ图24B和图24C或指定的浓度（图24D的异丙肾上腺素处理细胞2分钟。在37°C下使用Tristar®酶标仪BertholdTechnologies测量BRET。对于图24E至图24G，将以PEI:DNA的比为3:1的ssDNA和PEI补充至Iyg的IOOngHA-mAR、30ngGaspos67RlucII或Gal2pos84RlucII、100ngWTGy5、100ngWTGm、400ngrGFP-CAAX或高尔基体标记物（eN0Sl-73-rGFP以2x的量添加至3mlHEK293SL350,000个细胞ml。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育60分钟。然后以2μΜ的终浓度添加ProlumePurple™，并且温育6分钟。用ΙμΜ异丙肾上腺素在指定时间内（图24F或用指定剂量的异丙肾上腺素在4分钟内（图24Ε和图24G处理细胞或不处理细胞。在37°C下使用Tristar®酶标仪（BertholdTechnologies测量BRET。对于图24H，将以PEI:DNA为3:1的ssDNA和PEI补充至Iyg的200ngTPaR、30ngGaqp〇sll8RlucII、100ngWTGy5、100ngWTGm、400ngrGFP-CAAX或高尔基体标记物（eNOS1-73-rGFP添加至1.2mlHek293SL350，000个细胞ml。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育细胞60分钟。与IOOnMofUbo-Qic温育20分钟，或不温育。然后用指定剂量的U46619处理细胞6分钟。然后以2.5μΜ的终浓度添加Coel-400a，温育额外的5分钟。使用Tristar酶标仪BertholdTechnologies，在37°C下测量BRET。[0279]基于PKN的RhoA激活测定.对于图25B至图25D，使HEK293SL细胞在37°C下生长于补充了6%胎牛血清和20ygml庆大霉素的DMEM中。以每IOOmrn皿7.5xl05个细胞的密度接种细胞，第二天使用如之前描述的磷酸钙方法用编码ATlR的构建体3yg以及编码PKN-crib-RlucII的构建体90ng和编码rGFP-CAAX的构建体480ng瞬时转染细胞。24小时后，使细胞分离，以培养基中每孔25000个细胞的密度接种在聚鸟氨酸包被的96孔白板上。第二天，用台氏缓冲液洗涤细胞一次，在37°C下静置于80μ1台氏缓冲液中。当温育时，在37°C下，用IOOnMUbo-Qic处理细胞30分钟，或用3ygmlC3毒素处理细胞4小时（图251。在室温下完成细胞刺激和BRET测量。通过将Coel-400a添加至终浓度为5μΜ，使用SynergySBitTerI:酶标仪监测BRET信号。滤光器组为410±80nm和515±30nm，用于检测RlucII海肾荧光素酶供体和rGFP受体）的光发射。对于图25B，将用PEI:DNA比为3:1的ssDNA和PEI补充至2yg的200ngTPaR、20ngPKN-RlucII、600ngCAAX-rGFP的转染混合物添加至3mlHek293SL350000个细胞ml。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育30分钟，然后与终浓度2.5μΜ的Coel-400a温育6分钟。用指定剂量的U46619刺激细胞2分钟。在37°C下，使用配备有BRET400-GFP210滤光器组（受体，515±20nm;供体，400±70nm滤光器）的Tristar酶标仪BertholdTechnologies测量BRET。对于图251和图25J，将用PEI:DNA比为3:1的ssDNA和PEI补充至2yg的200ngTPaR、20ngPKN-RlucII、600ngCAAX-rGFP的转染混合物添加至3mlHek293SL350000个细胞ml。在聚D-赖氨酸预处理的板上接种细胞。转染后24小时，需要时以2ygml的终浓度过夜添加Rho抑制剂CT04;CytoskeIeton公司）。转染后48小时，洗涤细胞，并且在37°C下在台氏液+ImMCaCl2中预温育60分钟，然后在37°C下用IOOnMU46619或lygmlRho激活剂IICN03;Cytoskeleton公司）如指定的处理1分钟。然后以2·5μΜ的终浓度添加Coel-400a，温育额外的5分钟。使用Tristar酶标仪BertholdTechnologies，在37°C下测量BRET。[0280]完整细胞[125I]-AngII结合.用氯甘脲方法制备[125I]-AngII，如之前描述的由自置换和饱和实验确定其比放射性Zimmerman，Beautrait等人·2012。在4°C下使用[125I]-AngII作为示踪物用结合测定评价细胞表面受体的密度。在转染后1天将表达ATlR或ATlR-RlucII的HEK293SL细胞以每孔约120，000个细胞的密度接种于聚鸟氨酸包被的24孔板。第二天，用具有20mMHEPES的预热的DMEMDMEM-H洗涤细胞一次，然后在37°C下在不存在或存在10OnMAngII的情况下在DMEM-H中温育30分钟。将板用冰冷的酸（5OmM柠檬酸钠，pH4.0在冰上快速洗涤3次，每次5分钟，以停止刺激，移除剩余的表面结合和未结合的AngII配体。为了移除和中和残余的酸，进一步用冰冷的台氏缓冲液洗涤细胞2次。然后在4°C下用结合缓冲液（〇.2%BSA，50mMTris，100mMNaCl2,5mMMgCl2，pH7.4中的0.5ml[125I]_AngII〜250，OOOcpm温育细胞过夜。在存在ΙμΜAngII的情况下确定非特异性结合。第二天，用具有钙和镁的冰冷PBS洗涤细胞3次，然后添加0.5ml0.5ΝNa0H0.05%SDS。使用PerkinElmerWizard®1470自动γ计数器计数放射性。通过Biorad®蛋白测定试剂盒根据制造商的指示并进行一些修改，测量蛋白的量。简单来说，如上相同地处理细胞，除了不用放射性标记的AngII温育，然后在洗涤后，添加2ml稀释的蛋白测定试剂而不是NaOHSDS。通过移液混合后，将样品转移至塑料比色皿，并且在595nm下测量吸光度。[0281]共聚焦显微镜.转染前一天，将HEK293SL细胞以100,000个细胞皿的密度接种于35mm玻璃底皿。用B2R-CFP、LYN-rGFP和mCherry-内体相关蛋白FYVE转染细胞。转染后48小时，使细胞血清饥饿30分钟，不处理未处理或用缓激肽处理（IyM15分钟。使用氩514nm和HeNeI543nm激光器在ZeissLSM-510Meta激光扫描显微镜上分析样品，使用63X油浸镜采集图像（2048\2048像素）。为了检测0??和6??，分别以405腹和514腹的激发光，8?420-480nm或BP505-550nm发射滤光器使用UV和氩激光器。对于mCherry检测，以543nm激发光和LP560nm发射滤光器组使用HeNeI激光器。[0282]BRET显微镜成像.将HEK293S细胞培养在补充了10%FBS、100个单位ml青霉素和0.1mgml链霉素的DMEM中，并且以1-2XIO5个细胞皿的密度铺在聚D-赖氨酸包被的玻璃底35mm培养皿中。在第二天，根据制造商方案以每皿IygDNA和3μ1试剂使用X-tremeGENEHP试剂Roche用RlucII融合的构建体BRET供体和rGFP融合的构建体BRET受体转染细胞。对于图26A和图26B发光光谱测量），用IOOg皿N端融合Venus、GFP2或rGFP的RlucII转染细胞。通过添加补充了5mMEDTA的ImlPBS，使细胞从培养基表面分离，并且重悬于I3BS。作为焚光素酶底物，添加1處紫色腔肠素ProlumepurpleNanolightTechnology，添加底物后2分钟用SynergyNeo酶标仪BioTek获取发光光谱。对于图26C发光显微镜术），用IOOng皿HA-02AR、5Ong皿β抑制蛋白2-RlucII和500ng皿rGFP-CAAX转染。用Iml改性汉克斯平衡盐溶液（138mMNaCl，5.33mMKCl，0.44mMKH2P〇4,0.33mMNa2HP〇4,4.16mMNaHCO3,l.OmMCaCl2，1.0mMMgCl2，10mMHEPES，pH7.4洗涤细胞一次，并且进行显微镜观察。将10μΜ腔肠素（ProlumepurpleNanolightTechnology添加至皿中。使用装备有60X物镜ApochromatTIRF，NA1.49,Nikon和具有滤光器转换器（Lambda10-2,Sutter仪器）成像照相机PIXIS1024，Princet〇n仪器）的Nik〇n®Ti-U显微镜获得BRET图像。添加腔肠素后不久，关闭相机快门，获取空白图像90秒。然后用与BRET供体41080nm和BRET受体480LP或51040nm波长相对应的滤光器各自获得图像90秒。每5分钟捕获图像，为了去除来自相机暗电流和取样噪声的光子数量，使BRET供体和受体图像的相应像素减去空白图像值。对于每个时间点，使用MetaMorph软件7.8版MolecularDevices的像素算法功能生成BRET比图像，如下;像素色调:通过用供体图像的数量除以受体图像的数量计算BRET水平，分配至默认的彩虹色调（紫色为最低典型地为〇.〇，红色为最高典型地为2.0。像素亮度:供体图像的值具有自动亮度。[0283]Z’因子确定.对用rGFP-CAAX构建体和hMC4RWt-RlucII或hMC4RR165Q-RlucII构建体如图15A至图1®说明的共转染的细胞进行BRETl和BRET2测定，其中96孔板的一半用药物分子伴侣（1〇μΜDCPMP处理，板的另一半用对应的载体DMSO处理。如Zhang等人Zhang,Chung等人.1999描述的计算Ζ’因子值。Ζ’因子超过0.4被认为是稳健测定。[0284]DMSO抗性的评价.通常将配体和化合物库溶解于DMS0。为了评价对细胞表面评价的基于BRET的测定是否对DMSO的浓度敏感，所述DMSO的浓度通常用选自化合物库的配体的剂量响应曲线获得，在含有不同浓度的DMSO的孔中以ΙΟμΜ的DCOMP或载体DMSO处理转染的细胞，如图16所示。然后如之前描述的获得BRET值。[0285]数据分析.使用GraphPad®Prism曲线拟合程序计算配体介导的胞吞作用的t12和EC5q值的估计值。贯穿本研究提供的曲线代表了最佳拟合，其也使用GmphPad®prism程序产生。[0286]序列:下文描述了本文使用的多肽的氨基酸序列和构建体。[0287]RLucII[0288]MTSKVYDPEQRKRMITGPQffffARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNATSSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAWFELLNLPKKIIFVGHDWGAALAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESffDEffPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQSEQIDNO:10[0289]rGFP:海肾Renillareniformis绿色焚光蛋白[0290]MDLAKLGLKEVMPTKINLEGLVGDHAFSMEGVGEGNILEGTQEVKISVTKGAPLPFAFDIVSVAFSYGNRAYTGYPEEISDYFLQSFPEGFTYERNIRYQDGGTAIVKSDISLEDGKFIVNVDFKAKDLRRMGPVMQQDIVGMQPSYESMYTNVTSVIGECIIAFKLQTGKHFTYHMRTVYKSKKPVETMPLYHFIQHRLVKTNVDTASGYVVQHETAIAAHSTIKKIEGSLPSEQIDNO:11[0291]GFPlO[0292]MVSKGEELFTGWPILVELD⑶VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVTTLSYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFE⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNPHNVYmADKQKNGIKVNFKIRHNIEDGSVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLFTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKSEQIDNO:12[0293]hMC4RFT:人野生型黑皮质素4受体[0294]MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLENILVIVAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLASICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKRVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLALMASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNPYCVCFMSHFNLYLILIMCNSIIDPLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRYSEQIDNO:13[0295]hMC4RR165Q:在胞内保留和PC可拯救的突变的R165Q-hMC4R[0296]MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLENILVIVAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLASICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKQVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLALMASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNPYCVCFMSHFNLYLILIMCNSIIDPLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRYSEQIDN0:14[0297]hMC4RP299H:在胞内保留和最可不PC拯救的突变的P299H-hMC4R[0298]MVNSTHRGMHTSLHLWNRSSYRLHSNASESLGKGYSDGGCYEQLFVSPEVFVTLGVISLLENILVIVAIAKNKNLHSPMYFFICSLAVADMLVSVSNGSETIVITLLNSTDTDAQSFTVNIDNVIDSVICSSLLASICSLLSIAVDRYFTIFYALQYHNIMTVKRVGIIISCIWAACTVSGILFIIYSDSSAVIICLITMFFTMLALMASLYVHMFLMARLHIKRIAVLPGTGAIRQGANMKGAITLTILIGVFVVCWAPFFLHLIFYISCPQNPYCVCFMSHFNLYLILIMCNSIIDHLIYALRSQELRKTFKEIICCYPLGGLCDLSSRYSEQIDN0:15[0299]hV2RFT:人野生型血管升压素2受体[0300]MLMASTTSAVPGHPSLPSLPSNSSQERPLDTRDPLLARAELALLSIVFVAVALSNGLVLAALARRGRRGHffAPIHVFIGHLCLADLAVALFQVLPQLAWKATDRFRGPDALCRAVKYLQMVGMYASSYMILAMTLDRHRAICRPMLAYRHGSGAHffNRPVLVAWAFSLLLSLPQLFIFAQRNVEGGSGVTDCWACFAEPffGRRTYVTfflALMVFVAPTLGIAACQVLIFREIHASLVPGPSERPGGRRRGRRTGSPGEGAHVSAAVAKTVRMTLVIVVVYVLCWAPFFLVQLWAAffDPEAPLEGAPFVLLMLLASLNSCTNPWIYASFSSSVSSELRSLLCCARGRTPPSLGPQDESCTTASSSLAKDTSSSEQIDNO:16[0301]hV2RY128S:在胞内保留和PC可拯救的突变的Y128S-hV2R[0302]MLMASTTSAVPGHPSLPSLPSNSSQERPLDTRDPLLARAELALLSIVFVAVALSNGLVLAALARRGRRGHffAPIHVF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HMKQHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVKFE⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYITADKQKNGIKANFKIRHNIEDGGVQLADHYQQNTPIGDGPVLLPDNHYLSYQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAAGITLGMDELYKGGGGGDIEFLQPGGSGGGGMTSKVYDPEQRKRMITGPQffffARCKQMNVLDSFINYYDSEKHAENAVIFLHGNAASSYLWRHVVPHIEPVARCIIPDLIGMGKSGKSGNGSYRLLDHYKYLTAffFELLNLPKKIIFVGHDffGAALAFHYSYEHQDKIKAIVHAESVVDVIESWDEWPDIEEDIALIKSEEGEKMVLENNFFVETVLPSKIMRKLEPEEFAAYLEPFKEKGEVRRPTLSWPREIPLVKGGKPDVVQIVRNYNAYLRASDDLPKMFIESDPGFFSNAIVEGAKKFPNTEFVKVKGLHFSQEDAPDEMGKYIKSFVERVLKNEQSEQIDNO:83[0437]β抑制蛋白（I和2和RlucII之间的接头[0438]KLPATSEQIDNO:84[0439]人β抑制蛋白1[0440]MGDKGTRVFKKASPNGKLTVYLGKRDFVDHIDLVDPVDGVVLVDPEYLKERRVYVTLTCAFRYGREDLDVLGLTFRKDLFVANVQSFPPAPEDKKPLTRLQERLIKKLGEHAYPFTFEIPPNLPCSVTLQPGPEDTGKACGVDYEVKAFCAENLEEKIHKRNSVRLVIRKVQYAPERPGPQPTAETTRQFLMSDKPLHLEASLDKEIYYHGEPISVNVHVTNNTNKTVKKIKISVRQYADICLFNTAQYKCPVAMEEADDTVAPSSTFCKVYTLTPFLANNREKRGLALDGKLKHEDTNLASSTLLREGANREILGIIVSYKVKVKLVVSRGGLLGDLASSDVAVELPFTLMHPKPKEEPPHREVPENETPVDTNLIELDTNDDDIVFEDFARQRLKGMKDDKEEEEDGTGSPQLNNRSEQIDNO:85[0441]人β抑制蛋白2[0442]MGEKPGTRVFKKSSPNCKLTVYLGKRDFVDHLDKVDPVDGVVLVDPDYLKDRKVFVTLTCAFRYGREDLDVLGLSFRKDLFIATYQAFPPVPNPPRPPTRLQDRLLRKLGQHAHPFFFTIPQNLPCSVTLQPGPEDTGKACGVDFEIRAFCAKSLEEKSHKRNSVRLVIRKVQFAPEKPGPQPSAETTRHFLMSDRSLHLEASLDKELYYHGEPLNVNVHVTNNSTKTVKKIKVSVRQYADICLFSTAQYKCPVAQLEQDDQVSPSSTFCKVYTITPLLSDNREKRGLALDGKLKHEDTNLASSTIVKEGANKEVLGILVSYRVKVKLVVSRGGDVSVELPFVLMHPKPHDHIPLPRPQSAAPETDVPVDTNLIEFDTNYATDDDIVFEDFARLRLKGMKDDDYDDQLCSEQIDNO:86[0443]实施例2:用于GPCR运输的新BRET传感器的产生和确认[0444]产生基于海肾RenillareniformisGFPrGFP的新BRET受体用于评估受体内化作用和其以抑制蛋白至内体的靶向。使这些BRET受体进行工程化以用于在质膜或内体中特异性表达以及用于与RET供体RLucII标记的GPCR和β-抑制蛋白）使用（图IA至图1C。本文公开的BRET测定基于供体相对于受体的局部浓度变化而不是特异性蛋白-蛋白相互作用；因此不受限于蛋白相互作用的需要和其复合体的亲和性。对于其质膜定位，rGFP首先用Iyn域标记。当Lyn-rGFP在HEK293细胞中表达时，其主要定位于质膜（图ID和图1F。此外，将内体相关蛋白FYVE域添加至rGFPrGFP-内体相关蛋白FYVE显示了清楚和排他的内体定位图1E，左图）mCherry标记的内体相关蛋白FYVE的变体mCherry-FYVE传感器也与位于EE的小G蛋白Rab5共定位（图1G。尤其，使用渥曼青霉素阻断PI3K使rGFP-内体相关蛋白FYVE离开原位进入胞质溶胶内，增大了内体小泡（图1E，右图），与其通过PI3P结合连接于内体是一致的。为了可视化GPCR运输，使用了用CFP标记的缓激肽B2受体B2R-CFP，同时表达了lyn-rGFP和mCherry-内体相关蛋白FYVE图1F。在基础状态，B2R-CFP与lyn-rGFP定位于质膜上图）。在激动剂刺激时，B2R-CFP与lyn-rGFP分离，并且移动至与mCherry-内体相关蛋白FYVE共定位的内体内（下图）。仅受体在激动剂的情况下从一个细胞区室向另一个细胞区室重分布，因为质膜和内体标记物（即分别为lyn-rGFP和GFP-内体相关蛋白FYVE在其各自的区室中保持，使该系统适合于使用BRET动态追踪受体运输。[0445]实施例3:评估ATlR内化作用和其与β-抑制蛋白运输至内体[0446]进行BRET实验监测受体的胞吞作用。RlucII融合于血管紧张素1型受体的C端域ATIR-RlucII，所述血管紧张素1型受体是另一种GPCR，其通过网格蛋白途径与β-抑制蛋白运输（traffic，并且被革巴向于内体Hein,Meinel等人1997;Zhang,Barak等人·1999;Anborgh,Seachrist等人·2000;Oakley,Laporte等人·2000;Gaborik,Szaszak等人·2001。使用放射性配体结合，首先确认的是工程化ATIR-RlucII内化至与未标记的受体相同的程度（图7AJTIR-RlucII和lyn-rGFP的共表达不能防止有效的激动剂介导的受体从质膜的移除（图7A，所述质膜的内化通过β-抑制蛋白2的表达进一步提高，或被显性阴性的动力蛋白Κ44ΑDynK44A;图7Β抑制。与其在质膜的共定位一致，表达ATIR-RlucII和lyn-rGFP显示基础状态的高BRET比（图2A。在用AngII激发活细胞和来自质膜的受体的移除后，信号迅速以浓度依赖方式降低。另一方面，表达Iyn-GFPlO产生了较低的基础BRET比和AngII诱导的BRET比改变。显著地，表达ATIR-RlucII与rGFP-内体相关蛋白FYVE而不是GFPlO-内体相关蛋白FYVE导致了AngII介导的BRET的改变（ΔBRET7.7倍的提高（图2B。相似地，表达具有β-抑制蛋白2-RlucII的ATlR和rGFP-内体相关蛋白FYVE而不是GFPlO-内体相关蛋白FYVE导致了ΔBRET4.5倍的提高（图2C。然后使用具有质膜或内体BRET受体传感器例如分别为lyn-rGFP和rGFP-内体相关蛋白FYVE的ATIR-RlucII解决了来自质膜的受体胞吞和其靶向于内体的暂时过程。ATlR从质膜中消失ti2〜3分钟快于其在内体中的积累（ti2〜9分钟）图2D至图2F。[0447]接下来研究ATlR内化和其与β-抑制蛋白靶向于内体的可调节的程度。动力蛋白K44ADynK44A是显性阴性的动力蛋白，其对披网格蛋白小窝内陷是关键的，蔗糖被用作胞吞作用阻断剂（Zhang,Ferguson等人·1996。质膜和内体中的AngII介导的BRET响应分别是ATIR-RlucII1yn-rGFP和ATIR-RlucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE由DynK44A的表达有效抑制（图3A和图3B。与存在DynK44A的情况下缺乏内体中ATlRβ-抑制蛋白复合体的积累一致，在β-抑制蛋白2-RlucII和rGFP-内体相关蛋白FYVE之间观察到AngII介导的BRET比非常小的改变。相似地，蔗糖有效阻断了质膜中的ATIR-RlucII和lyn-rGFP之间和内体中ATlR-RlucII和β-抑制蛋白2-RlucII或rGFP-内体相关蛋白FYVE之间的AngII诱导的BRET响应（图3A-图3C。惊人地，DynK44A的过表达或蔗糖处理降低了质膜中的基础BRET比（其具有Lyn-rGFP图3A，但是没有降低内体中的基础BRET比（其具有rGFP-内体相关蛋白FYVE。0_抑制蛋白表达促进ATlR胞吞作用Gaborik,Szaszak等人.2001。防止受体降解和ATlR回收的小泡酸化抑制剂巴弗洛霉素ABaf和氯喹CQHeinz等人，MolEndocrinol.1997Aug;11⑶：1266-77均提高了内体中激动剂介导的ATlR的积累（图3F。与其在激动剂介导的GPCR胞吞作用中的重要作用一致，β抑制蛋白2的过表达对于受体内化ATIR-RlucII和lyn-rGFP和其靶向于内体ATIR-RlucII和rGFP-内体相关蛋白FYVE两者均使AngII介导的ΔBRET提高超过50%图3D和图3E。还通过配体结合实验验证了DynK44A或β-抑制蛋白2对AngII介导的ATlR胞吞作用的作用，发现其与BRET测定中观察到的一致（图7Β。总的来说，这些结果突出了基于BRET的测定以剂量依赖性和时间依赖性方式来监测ATlR胞吞作用和其与β-抑制蛋白至内体的运输的功用。[0448]实施例4:胞吞作用和各种受体至内体的运输的测量[0449]用RlucII标记不同的GPCR，以便检验其运输。当血管升压素V2受体-RlucIIV2R-RlucII与lyn-rGFP表达时，AVP剂量依赖性地减少了BRET比响应。与AngII刺激的ATlR相似，AVP促进V2R的内化，其中EC5q为nM级范围（分别为l.lnM和7.8nM图4A。在另一方面，与V2R具有低亲和性的催产素Barberis,Audigier等人.1992促进具有更低效力的受体内化图4A，EC5〇=2.2yMDB2R-R1UCII和β2-肾上腺素能受体®2AR-RlucII也分别显示了BRET比通过其同源配体、缓激肽和异丙肾上腺素的剂量依赖性减少。然而，我们发现受体之间的基础BRET比的差异。当检验受体至内体的运输时，B2R-RlucII和02AR-RlucII还显示了激动剂介导的BRET比提高的不同效力（图4B。尤其，与B2R和其他受体相比，V2R-RlucII和rGFP内体相关蛋白FYVE显示了高基础BRET比（图4B，虽然我们仍然可以在AVP刺激时检测到BRET比的稳健增加。更高的基础信号可能是由如显微镜检查法说明的V2R的高基础的内体定位导致的（图8。确实，与B2R相反，在不存在激动剂刺激的情况下，V2R与mCherry-内体相关蛋白FYVE的共定位更多地存在（图1和图8。然后，使用具有不同GPCR的ferr2-RlucII和rGFP内体相关蛋白FYVE检测激动剂介导的受体β-抑制蛋白向内体的靶向。激动剂刺激时，AT1R、V2R和B2R促进BRET比增加至基础BRET比的6〜8倍，其与B类GPCR的运输一致Oakley,Laporte等人.2000，B类GPCR运输至具有β-抑制蛋白的内体。然而，02AR的异丙肾上腺素刺激不能产生BRET信号，这与不具有β-抑制蛋白的内体中A类GPCR内化一致Oakley，Laporte等人.2000。催产素显示了V2R0-抑制蛋白复合体至内体的非常边界运输，而对于没有内化的PGF2a受体FPGoupil,Wisehart等人.2012，当激动剂刺激时，没有检测到高于BRET比的基础值的增加（图4C。这些结果支持这些质膜和内体BRET传感器用于研究不同类型GPCR的配体介导的运输的用途。图4D显示了质膜和内体BRET传感器也可以用于研究其他类型受体如非GPCR如表皮生长因子受体EGFR，受体酪氨酸激酶RTK的胞吞作用和运输。图4E显示了AngII刺激后ATIR-RLucIIrGFP-内体相关蛋白FYVE生物传感器的Z’因子超过0.73,这说明其是用于内体中受体内化的稳健和适合HTS的测定。[0450]实施例5:使用BRET研究受体回收[0451]GPCR内化之后，许多受体显示了回收至质膜或运输至其他胞内区室（Tsao，Cao等人.2001。使用不同的rGFPRlucIIBRET传感器对来评估激动剂移除后的受体运输动力学。对于质膜的受体回收，表达ATIR-RlucII和lyn-rGFP的细胞用AngII激发30分钟，洗涤以去除激动剂，静置恢复另外的45分钟，然后测量BRET。结果显示与对照相比，用AngII预处理的细胞中BRET比减少了约50%，激动剂去除45分钟后，信号恢复至约90%的对照（即约80%受体回收至质膜；图5A。相同的范例应用于RlucII标记的B2R、f32AR和V2R。这些发现揭示了多于80%的胞吞的B2R和02AR被回收至细胞表面，而仅约30%的胞吞的V2R被回收至质膜图5B。这些结果与之前的研究良好地吻合（Innamorati,Sadeghi等人·1998;Tsao和vonZastrow2000；Zimmerman，Simaan等人·2011。接下来使用ATIR-Rluc11和rGFP-内体相关蛋白FYVE监测用于早期内体的受体的消失。与未刺激的细胞相比（对照，图5C，AngII处理30分钟提高BRET比3倍。移除AngII后45分钟，BRET比是基础BRET比的1.5倍，意味着通过回收至细胞表面或其他胞吞分选，75%AT1R从早期内体消失。这些结果提供了以下证据:胞吞作用BRET测定可以应用于监测受体至质膜的回收和内体分选的动力学。[0452]图26A至图26C显示了由β抑制蛋白移位募集至不同区室导致的BRET信号的改变可以通过BRET显微镜检查法测量，与其他BRET受体如Venus和GFP2相比，rGFP用作BRET受体导致更强的BRET信号。基于BRET的显微镜成像提供了用于监测响应于不同刺激物的Rluc标记的蛋白至不同亚细胞区室的移位的基于图像的多路技术的可能性。[0453]实施例6:通过血管紧张素类似物差异地分选ATlR[°454]接下来使用之前显示具有明显偏向的信号传导特征Zimmerman,Beautrait等人.2012的不同ATlR配体:AngII、SI和DVG检测配体介导的受体胞吞作用。首先使用rGFP-内体相关蛋白FYVE评价ATlR配体暂时调节ATIR-RlucII至内体的运输的效力。结果揭示了ATIR运输至内体的初始速率与配体温育时相似（例如0〜5分钟；图6A。然而，DVG结合的ATlR在10分钟时达到了最大内化，同时仅20分钟后SI使其产生最大效果，在早期内体中在促进ATlR浓度下，两种配体分别比AngII有效性减少40%和20%。以最大内化的时间40分钟作为参照，比较了不同AngII配体促进ATIR内化的效力和效果。如图6B所示，AngII、SI和DVG在最大浓度的配体下使ATIR-RlucII和lyn-rGFP之间的BRET比相同程度地减少。虽然AngII和SI对于促进ATIR内化具有相同的倾向（分别为1.3nM和1.5nM，但DVG的有效性较差75nM。与AngII相比，SI和DVG促进了内体中更少的受体积累（图6C，虽然其效力的相对顺序保持与促进ATIR内化相同。有趣的是，与AngII相比，SI和DVG微弱地促进了β-抑制蛋白2至具有受体的内体的运输（图6D。总的来说，这些发现提供了以下证据:不同的AngII配体导致明显的ATlRβ-抑制蛋白2复合体分选。[0455]为了测试ATlR的潜在差别的胞内运输，通过用rGFP标记Rab蛋白（Rab产生内体的其他基于BRET的传感器。Rab协调小泡在多个胞内区室之间的运输，以及已经用于鉴别GPCR运输后的途径（Seachrist和Ferguson2003AabS被发现于胞吞和短周期的回收小泡上，而rab4被发现于短周期和长周期的回收小泡上，rabll被发现于长周期的回收小泡上和指向溶酶体的小泡上（Seachrist和Ferguson2003。由于rGFP-内体相关蛋白FYVE标记的内体主要是Rab5阳性的，所以产生了rGFP标记的Rab4rGFP-rab4和rabllrGFP-Rabll。当rGFP-rab4和rGFP-Rabll在HEK293细胞中表达时，两者均显示了良好的小泡的定位（图9A。当表达ATlR-RlucIIrGFP-rab4的细胞与AngII、SI或DVG温育时，BRET比随时间提高（图6E。有趣地，SI和DVG刺激产生了比AngII显著更高的BRET信号（5分钟和10分钟，图6E。在10分钟时，SI和DVG提高的BRET比是AngII的两倍。SI和DVG的信号在10分钟后达到稳定期，而AngII在30分钟时达到稳定期。与rGFP-rab4相似，rGFP-rabll还揭示了SI和DVG具有比AngII全部更高的信号（图6F。与rGFP-rab4相比，来自ATIR-RlucIIrGFP-rabll的信号随时间缓慢提高，这与之前的有关rab4和rabll分别处于快回收和慢回收的发现良好地吻合Hunyady,Baukal等人·2002;Li,Li等人·2008。在rGFP_rab4和rGFP-rablIBRET测定中，SI和DVG显示没有显著的差异。这些结果提供了以下证据：SI和DVG使ATlR进入rab4阳性或rab11阳性的小泡，并且相对于AngII较少进入rab5阳性的小泡。[0456]最近的证据表明G蛋白在膜运输中起一些作用，但是ATIR运输中Gaq的作用缺少研究。基于BRET的传感器用于评估抑制Gaq如何影响受体内化。用Ubo-QIC—种将Gaq特异地锁定在其非激活状态的抑制剂处理细胞不阻止AngII依赖性ATlR内化，如通过PMEsBRET测定评估的（图9B。然而，有趣的是，抑制Gaq减少多于25%的AngII结合的ATlR至含有Rab5的内体的靶向（图9C。与激活Gaq中缺少DVG和SI—致，Ubo-QIC对这些内体中配体介导的受体积累没有作用。抑制Gaq，提高了Rab4和Rabl1小泡中的AngII结合的AT1R，然而，其对DVG或SI促进的受体至内体的分选具有很小的作用（图9D。这些发现说明ATlR分选可以由不同配体偏向。[0457]实施例7:基于BRET的药物分子伴侣PC测定和评估功能性拯救的分离测定[0458]为了测量细胞表面表达，基于RlucII标记的蛋白的细胞质密度plasmadensity的测定（图10中，受体），根据通过亚细胞定位标记物在位于质膜的RlucII标记的蛋白和能量受体rGFP之间的BRET中检测的，开发了测定。在图IOA中，用于rGFP定位的标记物的例子:来自KRAS剪接变体b的多碱序列和异戊二烯化信号序列CAAX，来自Lyn激酶的棕榈酰化和豆蔻酰化信号序列Lyn，以及来自人GRK5质膜靶向多碱序列PB。图IOA中提供和描述了用于评价用RlucII标记的另外的ER保留蛋白的细胞表面表达PC拯救的测定示意图。用于评价细胞表面表达的基于BRET的测定也可以用于评价受体的激动剂诱导的分离，如图IOB中所图示和描述。在激动剂刺激时，多数GPCR和其他受体内化或分离至质膜的亚域。受体的细胞表面表达的PC拯救后的分离测定可以用于评价受体激活，其反映了激动剂结合，因此反映了功能性。用于该研究中的不同构建体描述于图11;图11A:MC4R-Rlucll的描述；图IIB:V2R-RlucII的描述；图IIC:用作非GPCR的实例的电压门控钾通道hERG的描述。如图IlD中描述的，测试了具有明显的质膜靶向序列的三种不同的rGFP构建体。如通过使用MC4R激动剂α-MSH诱导激动剂促进的分离所评价的，对于提供的多数测定，rGFP-CAAX和MC4R-RlucII构建体用于说明测定的稳健性、对DMSO的抗性和功能性拯救。[0459]为了优化细胞表面表达测定，测试了rGFP的两种不同的质膜靶向序列（图IlD描述了构建体和标记物）；KRAS片段标记物通过脂质化组合rGFP-CAAX;异戊二烯化靶向于质膜和多碱域，以及GRK5片段标记物通过多碱域rGFP-PB靶向于质膜，而不需要rGFP融合蛋白的脂质化。在图12中，由瞬时表达突变hMC4RΦ165Φ-RlucII的细胞获得两种rGFP构建体图12A=rGFP-CAAX和图12B=rGFP-PB的滴定。如图12A所显示的，DCPMP处理导致了对rGFP-CAAX的饱和BRET响应，选择该构建体用于后续实验。[0460]为了优化和验证细胞表面表达的PC介导的拯救和MC4R的功能性，在PC处理和1小时的激动剂处理以诱导激动剂介导的分离之后，针对细胞表面表达测试了瞬时表达rGFP-CAAX和3种形式的hMC4Rwt受体（hMC4Rwt-RlucII、PC可拯救突变MC4RhMC4R-R165Q-rlucll和已知耐DCPMP处理的突变MC4R非PC可拯救的）的细胞。测试了三种不同的受体与rGFP-CAAX的比。如显示的，DCPMP处理导致了WT和R165QMC4R的BRET信号的提高，但是没有导致P299H-突变MC4R的BRET信号提高。DCPMP处理后在细胞表面表达的Wt和R165Q突变MC4R两者均显示了如图13A至图13C中描述的激动剂诱导的分离。选择等价于96孔板每10个孔中24ng质粒DNA的条件用于后续测定。图13D显示了生物传感器的不同组件可以由相同的mRNA多顺反子构建体编码和共表达。编码rGFP-CAAXKras和WT或突变hMC4R的多顺反子构建体用于显示细胞表面表达的PC拯救。多顺反子构建体提供了供体与受体的固定比的优势和仅使用用于病毒感染或建立稳定细胞系一个构建体的可能性。图13E显示了已知由分子伴侣SR121463在胞内保留的V2R突变体Y128S和W164S的PC介导的拯救。[0461]实施例8:基于BRET的细胞表面表达测定可以用于分子伴侣效力和效果的药理学评价[0462]为了证实该测定是否可以用于表征具有PC特性的药物，用共表达rGFP-CAAX和hMC4Rwt-RlucII构建体或hMC4RR165Q-rlucll构建体的细胞的两种不同的PC处理DCPMP和化合物1获得剂量响应曲线（图14。剂量响应曲线的特征与用之前描述的基于FACS的测定（P.Ren6等人JPharmacolExpTher.2010Dec;335⑶：520-32获得的数据一致，说明基于BRET的测定可以用于表征配体。[0463]确定MC4R细胞表面表达的PC介导的拯救的Z’因子，评价开发的基于BRET的测定的稳健性。获得hMC4RWt-RlucII图15A和图15B和hMC4RR165Q-RlucII图15C和图15D两者的Z’因子。使用腔肠素400a在图15A和图15C中的BRET2中评价细胞表面表达，以及在用10μΜDCPMP相对于载体处理16小时后使用腔肠素H在BRETl中评价细胞的表达（图15B和图15D。用hMC4Rwt受体的Ζ’因子评价高于0.63,用突变R165Q突变hMC4R的Ζ’因子评价高于0.82。结果显示了该测定的稳健性与筛选应用的需要一致，甚至与WTMC4R—致。[0464]实施例9:评价对DMSO的耐受性[0465]配体库和化合物通常溶解于DMSO中。为了评价用于细胞表面评价的基于BRET的测定是否对DMSO浓度灵敏，所述DMSO浓度通常用选自化合物库的配体的剂量响应曲线获得，在含有不同浓度的DMSO的孔中用ΙΟμΜDCPMP或载体（DMSO处理表达hMC4RWt-RlucII和hMC4RR165Q-RlucII的细胞。如图16说明的，该测定对至少3%的DMSO是耐受的，这与剂量响应曲线中化合物的高通量筛选HTS应用和表征一致。[0466]实施例10:稳定细胞系的产生[0467]稳定表达生物传感器的细胞通常优选用于筛选目的。然后，为了确定稳定细胞系中达到的rGFP-CAAX的水平是否与用于筛选应用的稳健测定一致，在瞬时表达rGFP-CAAX的细胞和稳定rGFP-CAAX细胞系中评价了MC4R和V2R表达的PC介导的拯救。为了测试BRET供体与受体的不同比，将3种不同量（如图所示：6、12和24ng用于10个孔）的hMC4RR165Q_RlucII图16A或hV2RY128S-RlucII图16B在表达不同水平rGFP-CAAX低、中和高）的稳定系中转染或在HEK293细胞中与rGFP-CAAX构建体共转染。如图17说明的，在BRET2中评价MC4R的细胞表面表达的PC介导的拯救。提供的数据说明用表达更高水平的rGFP的稳定细胞系可以获得更好的响应。这些稳定细胞系可以用于可以用于建立同时表达受体-RlucII和rGFP-CAAX的细胞系，其可以用于筛选应用。[0468]实施例11:用于检测离子通道的PC介导的细胞表面拯救的生物传感器[0469]为了证实基于BRET的PC介导的细胞表面表达测定是否可以用于鉴别和表征会结合hERG的药物，使用hERG的WT序列和已知的在胞内保留的突变G601S建立了RlucII标记的构建体，并且对所述构建体测试了细胞表面表达的阿司咪唑介导的拯救（图18A和图18B。用wt-hERG图18C和突变（图18D构建体获得剂量响应曲线，用于已知以不同效果和效力对hERG充当配体和药物分子伴侣的药物。剂量响应曲线的特征与用基于ELISA的测定获得数据（HERG-Lite:WibleBA等人JPharmacolToxicolMethods.2005,52l:136-45相一致。使用hERG-G601S获得的Z’因子（图18E说明了基于BRET的测定是稳健的，并且可以用于高通量应用如HTS以鉴定能够拯救不同天然存在的突变hERG的细胞表面表达的hERG分子伴侣或鉴定可以具有通过hERG结合介导的脱靶作用的药物。[0470]实施例12:用于监测β-抑制蛋白至GPCR的募集的生物传感器[0471]接下来测试使用依赖于质膜中供体相对于受体的浓度密度变化的BRET生物传感器监测β-抑制蛋白（β-arr至GPCR即至GPCR所定位的质膜的募集是否是可能的。如图19Α所示，BRET受体（例如GFP用PM靶向部分标记（因此在PM中连接BRET受体），β-抑制蛋白用BRET供体例如RlucII标记。在GPCR激动剂存在的情况下，β-arr被募集至GPCR，因此提高了质膜中RlucII-i3-arr的浓度，这转而导致RlucII和PM标记的GFP之间能量转移BRET的提尚。[0472]图19B和图19C显示了在分别用提高剂量的异丙肾上腺素（iso和AVP刺激后，使用两种不同的受体抑制蛋白1图19B和图19D和β-抑制蛋白2图19C和图19E的BRET比的提尚，所述两种不同的受体:具有对抑制蛋白feAR更低未和性的A类受体（图19Β和图19C和对β-抑制蛋白V2R具有更高亲和性的B类受体图19D和图19Ε。结果显示使用不同的PM革巴向部分包括基于非脂质的靶向部分如GRK5的多碱域和不同的BRET受体获得适当的BRET信号，使用CAAXKrasPM靶向部分和rGFP作为BRET受体三角形获得最佳信号。图19F显示了使用具有rGFP-CAAX、lyn或PB的ferr-RlucII，均产生了比传统的RlucII:GFP10BRET对如GFP10-CAAX更大的BRET响应。用于监测β-抑制蛋白募集的该测定有利地不需要受体的修饰，还提供了适于对A类受体和B类受体筛选应用（包括HTS的稳健的测定（Ζ’因子为至少0.74;图19G和图19Η。图21Α至21Ε显示了使用单分子生物传感器对β-抑制蛋白移位的评估，例如其允许在膜提取物中进行实验。相对于较短的多肽接头，300个氨基酸的柔性多肽接头提供了更好的BRET信号（图21。[0473]实施例13:用于监测质膜中PI4,5P2的量的生物传感器[0474]应用生物传感器使用？^61-?!1域检测膜？14,5?2的产生。在基础状态，？^61-ΡΗ-RlucII和ΡΙΧδΙ-ΡΗ-rGFP或lyn-rGFP或rGFP-CAAX位于PI4,5P2所定位的PM中，因此它们的局部浓度密度足够高以产生可检测的BRET信号。当通过由配体AngII激活ATlR来激活磷脂酶CPLC时（因此诱导PI4，5P2水解），用RlucII和rGFP标记的ΡΙΧδΙ-ΡΗ域分散至胞质溶胶，由此减少rGFP和RlucII的局部浓度，并且因此以剂量依赖性的方式减少BRET信号（图20A和图20B。[0475]实施例14:用于监测质膜中二酰甘油DAG的生物传感器[0476]当PLC激活时，膜PIP2被水解为IP3和DAG。虽然三磷酸肌醇分散至胞质溶胶，但是由于DAG的疏水特性，DAG域保持在质膜内。图22A和图23A显示了用于测量PKCS的二酰甘油DAG结合域Clb至质膜的移位的生物传感器的示意图。生物传感器包括连接于BRET受体例如rGFP、GFP10的PM靶向域部分和连接于I3KCδ的DAG结合域CIb的BRET供体（例如RLucIIJIP2后的DAG在膜中的富集导致Clb域结合于膜，使BRET受体例如rGFP和BRET供体（例如RLucII相互更接近，诱导更高的BRET信号。在如图22A中描述的生物传感器中，BRET受体和BRET供体组件连接在一起单分子生物传感器），例如其允许以膜提取物进行实验，而在图23A描述的生物传感器中缺乏表达这些组件。图22B至图22H和图23B至图23E中描述的结果显示了质膜中的DAG积累可以使用两种生物传感器监测。图22F显示了使用N-3-三氟甲基苯基-2，4，6-三甲基苯磺酰胺m-3M3FBS直接激活PLC，这诱导膜PIP2水解为IP3和DAG因此提高了质膜中DAG的量），导致使用单分子生物传感器检测到的BRET信号的提尚。[0477]实施例15:用于监测G蛋白亚基分离的生物传感器[0478]在不存在激动剂的情况下，G蛋白亚基位于质膜中。使用激动剂㈧激活GPCR时，G蛋白亚基从质膜释放。使用连接于BRET受体例如rGFP、GFPl0的PM祀向域部分和连接于G蛋白亚基的BRET供体，通过测量由G蛋白亚基从PM中释放导致的BRET信号的降低监测GPCR激活是可能的（图24A。图24B和图24C显不了使用不同的RLucII标记的Gγ亚基在用异丙肾上腺素分别激活mAR和02AR后的BRET比的变化，这提供了以下证据:Gγ1和Gγ11主要与βIAR的信号传导有关，Gy1主要与i32AR的信号传导有关。图24D至图24H显示了可以使用生物传感器监测GPCR的激动剂刺激后，不同的G蛋白亚基至不同的细胞区室的分离移位。[0479]实施例16:用于监测RhoA激活的生物传感器[0480]通过监测使用BRET使PKN的CRIB域募集至质膜设计了Rho激活的生物传感器，所述PKN的CRIB域结合于定位在质膜的RhoRho-GTP的活性形式。BRET对是作为BRET供体的RlucII标记的PKN的CRIB域和作为受体的质膜结合的rGFPrGFP-CAAX图25A。图25B至图25G显示了在激动剂刺激偶联于Gq1213的GPCR时，PKNCRIB域移位至质膜并且在存在特异性Gq抑制剂的情况下，移位减少。图25H至图25J显示了Rho调节剂对使用Rho生物传感器测量的BRET比的作用。在存在Rho激活剂的情况下提高了BRET比，在存在Rho抑制剂的情况下则减少BRET比，证实了该测定的特异性。[0481]实施例17:使用定位运输生物传感器通过高通量筛选鉴定ATlR的调节剂[0482]使用ATIR以及ferr2-RLucII和rGFP-FYVE，通过BRET测定对115，000种化合物筛选来鉴定加强或抑制内体中ATlR的AngII介导的内化的化合物。鉴定出30种增强剂和42种抑制剂（图27A。图27B显示了与未处理的、激动剂刺激的细胞相比，筛选中鉴定出的化合物#21Traf21阻断B2R-YFP或ferr2-YFP对内体的靶向，图27C显示了与未处理的、激动剂刺激的细胞相比，筛选中鉴定的化合物#10Traf10和#29Traf29增强了B2R-YFP或βarr2-YFP对内体的靶向。这些结果显示了本文描述的生物传感器可以通过高通量筛选用于鉴定蛋白定位运输的调节剂例如激动剂、诘抗剂）。[0483]虽然在上文中已经通过具体实施方式描述了本发明，但是可以在不背离所附的权利要求中限定的本发明的精神和性质的情况下修改本发明。在权利要求中，词语“包括comprising”用作开放性术语，基本上等价于短语“包括但不限于”。除非上下文另有明确规定，单数形式“一个一种a”、“一个一种an”和“所述该（the”包括相应的复数引用。[0484]参考文献[0485]Claing，A.，S.A.Laporte等人.（2002.〃G蛋白偶联受体的胞吞作用:G蛋白偶联受体激酶和0抑制蛋白的作用（EndocytosisofGprotein-coupledreceptors:rolesofGprotein-coupledreceptorkinasesandbeta-arrestinproteins.^ProgNeurobiol662:61-79.[0486]Hanyaloglu，A.C.和M.vonZastrow2008·〃通过胞吞膜运输和其有潜力的暗示来调节GPCRegulationofGPCRsbyendocyticmembranetraffickinganditspotentialimplications·〃AnnuRevPharmacolToxicol48:537-568.[0487]Hunyady，L.和K.J.Catt2006·〃多向性ATI受体信号传导途径介导血管紧张素II的生理和病理活动（PleiotropicATlreceptorsignalingpathwaysmediatingphysiologicalandpathogenicactionsofangiotensinΙΙ·〃Μο1Endocrinol205:953-970.[0488]Molinari，P.,I.Casella等人·（2008·〃高效共振转移的功能性互补：用于研究活细胞中蛋白结合作用的新工具（Functionalcomplementationofhigh-efficiencyresonanceenergytransfer:anewtoolforthestudyofproteinbindinginteractionsinlivingcells·’’BiochemJ409I:251-261.[0489]P〇sner，B.I.和S.A.Laporte2010.〃细胞信号传导：肽激素和生长因子Cellularsignalling:Peptidehormonesandgrowthfactors.^ProgBrainRes181:1-16.[0490]1'〇让，0.1.，1.1'.1'〇让等人.（2012.〃质膜磷脂酰肌醇4,5-二磷酸的剧烈消耗对6蛋白偶联受体胞吞作用的特定步骤有害（Acutedepletionofplasmamembranephosphatidylinositol4，5—bisphosphateimpairsspecificstepsinendocytosisoftheG-protein-coupledreceptor.CellSci125Pt9:2185-2197.[0491]Ward，W.W.andH.H.Seliger1976.〃用于使来自栉水母属的生物发光光蛋白栉水母蛋白光失活的光谱和量子产率（Actionspectrumandquantumyieldforthephotoinactivationofmnemiopsin,abioluminescentphotoproteinfromtheCtenophoremnemiopsisSP."PhotochemPhotobi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权利要求：1.一种用于评估感兴趣的蛋白的运输和或定位的生物传感器，其包括：第一组件，所述第一组件包括用海肾（Renilla绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾Renilla荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的所述感兴趣的蛋白；第二组件，所述第二组件包括用海肾GFP或海肾Luc标记的细胞区室靶向部分；其中，如果所述第一蛋白用所述海肾GFP标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述第一蛋白用所述海肾Luc标记，则所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP记D2.权利要求1所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白用所述海肾Luc标记，所述细胞区室靶向部分用所述海肾GFP标记。3.权利要求1或2所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽、β-抑制蛋白多肽、细胞表面受体或G蛋白亚基多肽。4.权利要求3所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白是Rho结合多肽。5.权利要求3所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白是细胞表面受体。6.权利要求5所述的生物传感器，其中，所述细胞表面受体是G蛋白偶联受体GPCR。7.权利要求1至6中任一项所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是质膜PM靶向部分、内体靶向部分、高尔基体靶向部分、溶酶体靶向部分、过氧化物酶体靶向部分、自噬体靶向部分、核糖体靶向部分、线粒体靶向部分、细胞骨架靶向部分或细胞核靶向部分。8.权利要求7所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是质膜PM靶向部分。9.权利要求8所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分是定位于所述PM的PM蛋白或其片段。10.权利要求9所述的生物传感器，其中，所述PM蛋白或其片段包括a棕榈酰化信号序列、豆蔻酰化信号序列和或异戊二烯化信号序列，和或b多碱序列。11.权利要求10所述的生物传感器，其中，所述棕榈酰化信号序列和或豆蔻酰化信号序列来自人Src家族激酶Lyn。12.权利要求11所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列MGCIKSKGKDSSEQIDΝ0：1〇13.权利要求12所述的生物传感器，其中，所述多碱序列和异戊二烯化信号序列来自人KRAS剪接变体b。14.权利要求13所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列GKKKKKKSKTKCVIMSEQIDN0：7〇15.权利要求10所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和异戊二烯化信号序列。16.权利要求15所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCVLSSEQIDN0:47。17.权利要求10所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括来自hRas的棕榈酰化序列和来自Rail的异戊二烯化信号序列。18.权利要求17所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列CMSCKCCILSEQIDN0:43。19.权利要求9所述的生物传感器，其中，所述PM蛋白或其片段是小窝蛋白Ια。20.权利要求IO所述的生物传感器，其中，所述PM祀向多碱序列来自人GRK5。21.权利要求20所述的生物传感器，其中，所述PM靶向部分包括氨基酸序列SPKKGLLQRLFKRQHQNNSKSSEQIDNO：8〇22.权利要求8至21所述的生物传感器，其中，（i所述PM靶向部分包括来自人Src家族激酶Lyn的棕榈酰化信号序列和或豆蔻酰化信号序列，并且所述PM祀向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端;或（ii所述PM靶向部分包括：（a来自人KRAS剪接变体I^HRAS的多碱序列和异戊二烯化信号序列；（b来自HRAS的棕榈酰化序列和来自Rail的异戊二烯化信号序列；（c小窝蛋白Ia或其片段;或⑹来自人GRK5的多碱序列，并且所述PM祀向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。23.权利要求7所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是内体靶向部分。24.权利要求23所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分是定位于内体的内体蛋白或其片段。25.权利要求24所述的生物传感器，其中，所述内体蛋白或其片段包括FYVE域。26.权利要求23至25中任一项所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白的FYVE域。27.权利要求26所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分包括人内体相关蛋白的第739〜806位残基（SEQIDNO:20。28.权利要求23所述的生物传感器，其中，所述内体蛋白或其片段是Rab蛋白或其片段。29.权利要求28所述的生物传感器，其中，所述Rab蛋白是Rab4或Rabl1。30.权利要求23至29中任一项所述的生物传感器，其中，所述内体靶向部分融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的C端。31.权利要求23至30中任一项所述的生物传感器，其中，所述感兴趣的蛋白融合于所述海肾Luc或所述海肾GFP的N端。32.权利要求7所述的生物传感器，其中，所述细胞区室靶向部分是高尔基体靶向部分。33.权利要求32所述的生物传感器，其中，所述高尔基体靶向部分是定位于高尔基体的高尔基体蛋白或其片段。34.权利要求33所述的生物传感器，其中，所述高尔基体靶向部分是定位于高尔基体的eNOSl或其片段。35.权利要求34所述的生物传感器，其中，所述高尔基体靶向部分包括人eNOSl的第1〜73位残基（SEQIDN0:42。36.权利要求1至35中任一项所述的生物传感器，其中，所述第一组件和第二组件通过柔性接头共价连接。37.权利要求36所述的生物传感器，其中，所述柔性接头是约50〜约500个氨基酸的多肽。38.权利要求37所述的生物传感器，其中，所述柔性接头是约300个氨基酸的多肽。39.—种核酸，编码权利要求1至38中任一项所述的生物传感器的第一组件和或第二组件。40.—种载体，包括权利要求39所述的核酸。41.一种宿主细胞，表达权利要求1至38中任一项所述的生物传感器。42.—种用于确定试剂是否调节细胞中感兴趣的蛋白的运输的方法，所述方法包括:测量在存在和不存在所述试剂的情况下权利要求1至38中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；其中，存在所述试剂的情况下与不存在所述试剂的情况下的所述BRET信号的差异表明所述试剂调节细胞中所述感兴趣的蛋白的运输。43.—种用于确定试剂是否诱导细胞中感兴趣的细胞表面受体的内化的方法，所述方法包括：测量在存在和不存在所述试剂的情况下权利要求8至22中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；其中，相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下更低的BRET信号表明所述试剂诱导感兴趣的细胞表面受体的内化。44.一种用于评估在细胞表面的感兴趣的内化受体的回收的方法，所述方法包括：a在诱导所述受体的内化的配体存在的情况下，使如权利要求8至22中任一项所限定的包括PM祀向部分的第一生物传感器和第二生物传感器接触；⑹在所述接触之后，测量第一生物传感器中的BRET信号；c洗涤所述第二生物传感器以移除所述配体；⑹在所述洗涤之后，测量第二生物传感器中的BRET信号;和e通过比较第一生物传感器和第二生物传感器中的BRET，确定细胞表面的感兴趣的内化受体的回收，其中，相对于所述第一生物传感器，所述第二生物传感器中更高的BRET信号表明在细胞表面的感兴趣的内化受体的回收。45.权利要求44所述的方法，进一步包括在洗涤之后的不同时间重复步骤d和e，以研究感兴趣的内化受体的回收的动力学。46.—种用于确定试剂是否诱导内体区室的感兴趣的细胞表面受体的运输的方法，所述方法包括：测量在所述试剂存在和不存在的情况下权利要求23至31中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；其中，相对于不存在所述试剂的情况在存在所述试剂的情况下更高的BRET信号表明所述试剂诱导所述内体区室中的所述感兴趣的细胞表面受体的运输。47.权利要求46所述的方法，其中，所述方法使用多种生物传感器进行，并且其中，所述生物传感器中的每一种包括不同的内体靶向部分。48.—种用于确定试剂是否充当感兴趣的受体的药物分子伴侣的方法，所述方法包括：测量在存在和不存在所述试剂的情况下权利要求7至22中任一项所述的生物传感器中的BRET信号；其中，相对于不存在所述试剂的情况在存在所述试剂的情况下更高的BRET信号表明所述试剂充当所述感兴趣的受体的药物分子伴侣。49.一种用于确定试剂是否充当感兴趣的受体的药物分子伴侣的方法，所述方法包括：提供生物传感器，所述生物传感器包括：用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的所述感兴趣的受体;和用海肾GFP或海肾Luc标记的内质网ER靶向部分；其中，如果所述受体用所述海肾GFP标记，则所述ER靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述受体用所述海肾Luc标记，则所述ER靶向部分用所述海肾GFP标记；以及测量在存在和不存在所述试剂的情况下的BRET受体信号；其中，相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下BRET信号的降低表明所述试剂充当所述受体的药物分子伴侣。50.权利要求48或49所述的方法，其中，所述受体是突变的受体。51.权利要求48至50中任一项所述的方法，其中，所述受体是G蛋白偶联受体GPCR。52.权利要求51所述的方法，其中，所述GPCR是黑皮质素4受体MC4R或血管升压素2受体V2R。53.权利要求48至52中任一项所述的方法，其中，所述受体是离子通道。54.权利要求53所述的方法，其中，所述离子通道是电压门控钾通道。55.权利要求54所述的方法，其中，所述电压门控钾通道是hERG。56.权利要求48至55中任一项所述的方法，其中，所述受体用所述海肾Luc标记，所述PM靶向部分或ER靶向部分用所述海肾GFP标记。57.权利要求48至56中任一项所述的方法，其中，所述PM靶向是权利要求9至22中任一项所限定的PM祀向部分。58.—种用于确定试剂是否诱导β-抑制蛋白募集至质膜的方法，所述方法包括：提供生物传感器，所述生物传感器包括：细胞或膜制备物，所述细胞或膜制备物包括：用海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP或海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc标记的所述β-抑制蛋白；用海肾GFP或海肾Luc标记的质膜PM靶向部分;和GPCR；其中，如果所述β-抑制蛋白用所述海肾GFP标记，则所述PM靶向部分用所述海肾Luc标记，如果所述β-抑制蛋白用所述海肾Luc标记，则所述PM祀向部分用所述海肾GFP标记；以及测量在存在和不存在所述试剂的情况下的BRET受体信号；其中，相对于不存在所述试剂的情况，在存在所述试剂的情况下BRET信号的提高表明所述试剂诱导抑制蛋白募集至质膜。59.权利要求58所述的方法，其中，所述β-抑制蛋白用所述海肾Luc标记。60.权利要求58或59所述的方法，其中，所述PM靶向部分PM靶向是权利要求9至22中任一项所限定的PM祀向部分。61.—种用于评估调节在第一条件和第二条件之间细胞区室的生物分子的量的方法，所述方法包括：提供生物传感器，所述生物传感器包括：第一组件，所述第一组件包括用结合于所述生物分子的蛋白标记物标记的海肾绿色荧光蛋白（海肾GFP;以及第二组件，所述第二组件包括用所述蛋白标记物标记的海肾荧光素酶蛋白（海肾Luc;测量所述第一条件和第二条件下的BRET受体信号；其中，在所述第一条件和第二条件之间的BRET信号的差异表明调节在所述第一条件和第二条件之间所述细胞区室的所述生物分子的量。62.权利要求61所述的方法，其中，所述第一条件是存在试剂，所述第二条件是不存在所述试剂。63.权利要求61或62所述的方法，其中，所述生物分子是磷脂。64.权利要求63所述的方法，其中，所述磷脂是4，5-二磷酸磷脂酰肌醇PIP2。65.权利要求64所述的方法，其中，所述蛋白标记物包括普列克底物蛋白同源PH域。66.权利要求65所述的方法，其中，所述PH域是ΡΙΧδ1的PH域。67.权利要求61或62所述的方法，其中，所述生物分子是第二信使。68.权利要求67所述的方法，其中，所述第二信使是二酰甘油DAG。69.权利要求68所述的方法，其中，所述蛋白标记物包括佛波酯二酰甘油结合域。70.权利要求69所述的方法，其中，所述蛋白标记物包括佛波酯PKC的二酰甘油结合域Clb〇71.权利要求70所述的方法，其中，所述蛋白标记物包括SEQIDΝΟ:72的氨基酸序列。72.权利要求42至71中任一项所述的方法，其中，所述BRET信号使用酶标仪或通过显微镜检查法测量。73.权利要求1至38中任一项所述的生物传感器或权利要求42至72中任一项所述的方法，其中，所述海肾RenillaLuc是海肾Renillareniformis焚光素酶IIRlucII和或所述海肾（Reni11aGFP是海肾（RenillareniformisGFPrGFP〇

百度查询： 皇家学习促进会/麦吉尔大学;蒙特利尔大学 用于监测细胞中生物分子的定位和运输的生物传感器

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