申请/专利权人：中国科学院分子植物科学卓越创新中心;扬州大学

申请日：2016-03-18

公开（公告）日：2020-11-27

公开（公告）号：CN107201396B

主分类号：C12Q1/6895(20180101)

分类号：C12Q1/6895(20180101);C12Q1/6858(20180101);C12N15/11(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2024.03.26#未缴年费专利权终止;2020.11.27#授权;2017.10.27#实质审查的生效;2017.09.26#公开

摘要：本发明涉及检测水稻半矮杆基因sd‑1等位基因用的CAPS标记。具体而言，本发明涉及选自SEQIDNO:1－4所示的寡核苷酸序列。本发明还涉及限制性内切酶AflIII在鉴定水稻sd‑1j基因型中的应用，以及限制性内切酶Bsp1286I在鉴定水稻sd‑1r基因型中的应用。本发明能够以简单的方式快速地、低成本地鉴定水稻半矮杆基因sd‑1基因的等位基因sd‑1j和sd‑1r。

主权项：1.一种检测试剂盒，该检测试剂盒含有：限制性内切酶AflIII，以及引物5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’；或限制性内切酶Bsp1286I，以及引物5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’；或限制性内切酶AflIII和Bsp1286I，引物5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’，以及引物5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’；和任选的扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。

全文数据：检测水稻半矮杆基因sd-1等位基因用的CAPS标记技术领域[0001]本发明涉及检测水稻半矮杆基因Sd-I等位基因用的CAPS标记。背景技术[0002]国际水稻研究所培育水稻品种IR8后，对其矮源供体DGWG进行研究，发现其矮生性受单隐性基因控制以及微效基因修饰，就将单隐性基因命名为sd-1。[0003]研究表明Sd-I编码水稻生物GA合成过程中的GA20氧化酶-2GA20ox-2，GA20ox-2是赤霉素合成途径中的关键酶，催化GA53转换为GA20WolfgangSpielmeyer、MarcH.Ellis和PeterM.Chandler，Semidwarfsd-l，〃greenrevolution^rice,containsadefectivegibberellin2〇-〇xidasegene,ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences，2002，9913:9043-9048〇[0005]sd-1控制水稻的株高，该位点的突变导致水稻不同程度的矮化，因此目前水稻矮化育种中大规模运用的半矮杆基因位点为sd-1。[0006]研究者发现sd-1基因除了野生型外还有4个等位基因（A.Sasaki、M.Ashikari、M.Ueguchi-Tanaka、H.Itoh等，AmutantgibbereIIin-synthesisgeneinrice,Nature,2002，4166882:701-702:矮杆品种Deo-geo-woo-gen及其衍生种的基因型是sd-ld，在第一到第二外显子上缺失383bp，包含103bp的内含子;矮杆品种Jikkoku为sd-1j，编码第94氨基酸的GGG变为GTG，导致甘氨酸变为缬氨酸;矮杆品种Calrose76为sd-lc，编码第266氨基酸的CTC突变为TTC，导致亮氨酸突变为苯丙氨酸;矮杆品种Remei为sd-lr，编码第349氨基酸的GAC变为CAC，导致天冬氨酸变为组氨酸。见图1。[0007]目前，常用的鉴定Sd-I基因突变的方法为克隆测序（SasakiA，AshikariM，Ueguchi—TanakaM，ItohH,NishimuraA，SwapanD,IshiyamaK,SaitoT,KobayashiM，KhushGS,KitanoH,MatsuokaM.,Greenrevolution:mutantgibbereIIin-synthesisgeneinrice，Nature，2002Apr18;4166882:701-2，但该方法耗时长、花费大、操作复杂。[0008]因此，本领域仍然需要一种能以简单的方式快速、低成本地鉴定水稻半矮杆基因sd-1基因的等位基因的方法。发明内容[0009]本发明开发了可以快速鉴定水稻半矮杆基因Sd-I第一和第三外显子上突变位点sd-1j和sd-lr的CAPS标记。[0010]具体而言，本发明第一方面提供选自下组的寡核苷酸序列：[0011][0012][0013][0014][0015]本发明第二方面提供一种引物试剂，该试剂含有：[0016]5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和或5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’。[0017]本发明第三方面提供另一种引物试剂，该试剂含有：[0018]5，-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3，和或5，-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3，。[0019]本发明第四方面提供一种PCR反应体系，该反应体系中含有：[0020]5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和或5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’；和或[0021]5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和或5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’。[0022]在一个或多个实施方案中，所述PCR反应体系还含有:扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。[0023]本发明第五方面提供一种检测试剂盒，该检测试剂盒含有：[0024]用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι第一外显子和或第三外显子的引物，和[0025]限制性内切酶AFIII和或Bspl286I。[0026]在一个或多个实施方案中，所述引物为：[0027]5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和或5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’。[0028]在一个或多个实施方案中，所述引物为：[0029]5，-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3，和或5，-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3，。[0030]在一个或多个实施方案中，所述引物为：[0031][0032]；[0033];和[0034]。[0035]在一个或多个实施方案中，所述试剂盒还含有实施PCR所用的其它试剂，包括但不限于缓冲液、DNA聚合酶和dNTP。[0036]在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有用于扩增水稻半矮杆基因sd-1的第一外显子的引物和限制性内切酶AFIII。[0037]在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有引物5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’，以及限制性内切酶AFIII。[0038]在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι的第三外显子的引物和限制性内切酶Bspl286I。[0039]在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有引物5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-611^61701；1'1'1^61701；-3’，以及限制性内切酶88口12861。[0040]在一个或多个实施方案中，所述试剂盒含有：[0041]引物5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’，以及限制性内切酶AFIII;以及[0042]引物5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’，以及限制性内切酶Bsp12861。[0043]本发明第六方面提供一种鉴定水稻sd-lj基因型的方法，所述方法包括：[0044]1使用引物扩增该水稻的半矮杆基因sd-1基因的第一外显子；[0045]2使用酶AFin酶切步骤1获得的扩增产物;和[0046]3对酶切产物进行电泳；[0047]其中，若电泳条带存在三个条带，则将该水稻鉴定为sd-1j基因型。[0048]在一个或多个实施方案中，所述引物为5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’。[0049]在一个或多个实施方案中，所述三个条带分别对应于约364bp、286bp和147bp。[0050]本发明第七方面提供一种鉴定水稻sd-lr基因型的方法，所述方法包括：[0051]1使用引物扩增水稻半矮杆基因sd-1基因的第三外显子；[0052]2使用酶Bspl286頂每切步骤1获得的扩增产物;和[0053]3对酶切产物进行电泳；[0054]其中，若电泳条带存在三个条带，则将该水稻鉴定为sd-lr基因型。[0055]在一个或多个实施方案中，所述引物为5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’。[0056]在一个或多个实施方案中，所述三个条带分别对应于约204bp、155bp和74bp。[0057]本发明第八方面还提供限制性内切酶AFIII及任选的用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第一外显子的引物在鉴定水稻sd-lj基因型中的应用，或在制备用于鉴定水稻sd-lj基因型的试剂盒中的应用。[0058]在一个或多个实施方案中，所述用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第一外显子的引物为：[0059]5，-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3，，和或[0060]5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’。[0061]本发明第九方面还提供限制性内切酶Bspl286I及任选的用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第三外显子的引物在鉴定水稻sd-lr基因型中的应用，或在制备用于鉴定水稻sd-lr基因型的试剂盒中的应用。[0062]在一个或多个实施方案中，所述用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第三外显子的引物为：[0063]5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’，和或[0064]5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’。附图说明[0065]图1显示sd-Ι等位基因及其突变位点（Sasaki等，2002。[0066]图2显示sd-Ι等位基因酶切鉴定结果。具体实施方式[0067]CAPS技术又称为PCR-RFLP，它实质上是PCR技术与RFLP技术结合的一种方法。CAPS的基本原理是利用己知位点的DNA序列资源设计出一套特异性的PCR引物（19-27bp，然后用这些引物扩增该位点上的某一DNA片段，接着用一种专一性的限制性内切酶切割所得扩增产物，凝胶电泳分离酶切片段，染色并进行RFLP分析。[0068]本发明利用CAPS技术来快速鉴定水稻半矮杆基因sd-Ι基因的等位基因，尤其是sd-1j和sd-lr等位基因。[0069]更具体而言，本发明使用限制性内切酶AFIII来快速鉴定水稻半矮杆基因sd-Ι基因第一外显子编码第94位氨基酸的碱基是否存在突变，具体是G—T的突变即鉴定sd-lj基因型）；使用限制性内切酶Bspl286I快速鉴定水稻半矮杆基因sd-Ι基因第三外显子编码第349位氨基酸的碱基是否存在突变，具体是G—C的突变即鉴定sd-lr基因型）。[0070]如本文所用，水稻Sd-Ij基因型指水稻Sd-I基因第一外显子编码第94位氨基酸的GGG突变成GTG。水稻sd-lr基因型指水稻sd-Ι基因第三外显子编码第349位氨基酸的GAC突变成CAC。[0071]本发明中，限制性内切酶AFIII和Bspl286I可从市售途径获得，例如从NewEnglandBiolabsNEB公司获得。[0072]本发明鉴定水稻sd-lj基因型的方法通常包括：[0073]1使用引物扩增水稻的半矮杆基因sd-Ι基因的第一外显子；[0074]2使用酶AFin酶切扩增产物;和[0075]3对酶切产物进行电泳。[0076]通常，若电泳条带存在三个条带，则将该水稻鉴定为sd-lj基因型。[0077]通常，三个电泳条带分别通常对应于约364bp、286bp和147bp。[0078]引物通常是能特异性扩增半矮杆基因sd-Ι基因第一外显子的引物。作为示范性的例子，本发明使用的能特异性扩增半矮杆基因sd-Ι基因第一外显子的引物包括：[0079]5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’（SEQIDN0:1，和[0080]5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’（SEQIDN0:2。[0081]本发明还提供一种鉴定水稻sd-lr基因型的方法，所述方法包括：[0082]1使用引物扩增水稻的半矮杆基因sd-Ι基因的第三外显子；[0083]2使用酶Bspl286頂每切扩增产物；和[0084]3对酶切产物进行电泳；[0085]其中，若电泳条带存在三个条带，则将该水稻鉴定为sd-lr基因型。[0086]通常，三个电泳条带分别对应于约204bp、155bp和74bp。[0087]引物通常是能特异性扩增半矮杆基因sd-Ι基因第三外显子的引物。作为示范性的例子，本发明使用的能特异性扩增半矮杆基因sd-Ι基因第三外显子的引物包括：[0088]5，-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3，（SEQIDN0:3，^P[0089]5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’（SEQIDN0:4。[0090]通常，可采用常规的技术手段提取水稻叶片的基因组DNAgDNA。例如，可使用市售的试剂盒并按其说明书进行提取。作为一个例子，可使用天根生化科技北京有限公司的新型植物基因组提取试剂盒DP320并按其操作手册进行。[0091]扩增可按本领域常规的条件进行。例如，可先配制PCR反应体系。应理解，PCR反应体系为一混合物，其中可含有用于扩增水稻sd-Ι基因第一外显子和或第三外显子的引物、DNA聚合酶、dNTP和缓冲液等。[0092]PCR反应体系中的各成分的用量可由本领域技术人员根据实际情况容易地确定。[0093]PCR反应可采用PCR仪自动完成。PCR反应程序可为常规的反应程序。作为示范性的例子，本发明一个PCR反应程序如下：[0095]扩增结束后，对扩增产物进行电泳分离。通常可通过琼脂糖凝胶电泳分离出扩增产物。例如，在一个具体实施方式中，配置1.5%的琼脂糖胶，取反应产物上样。在IXTAE电泳缓冲液中，120V电压下，电泳15min。[0096]可采用本领域常规的技术手段回收PCR产物。例如，在本发明的一个实施例中，使用天根生化科技北京有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒DP209根据其操作手册进行。[0097]可按所使用的限制性内切酶的性质进行扩增产物的酶切。例如，通常，可将扩增产物、酶切缓冲液、限制性内切酶和IdH2O混合后，在约37°C下保温一段时间（例如约2小时），从而完成酶切。[0098]酶切混合物中各成分的用量可由本领域技术人员根据实际情况容易地确定。[0099]酶切结束后，对酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳。例如，配置2%的琼脂糖胶，取酶切反应产物上样。在IXTAE电泳缓冲液中，120V电压下，电泳30min。[0100]凝胶电泳的结果可在紫外光下观察到。[0101]基于酶切产物的电泳结果，可如前文所述鉴定水稻为sd-lj基因型、sd-lr基因型，或两者都不是。[0102]通常，本发明的方法还包括检测对照的步骤。具体而言，采用相同的引物扩增对照水稻例如，“老来青”）的sd-Ι基因的第一外显子和或第三外显子，并使用相同的酶酶切扩增产物，对酶切产物进行电泳。对于第一外显子，对照酶切扩增产物获得的电泳条带为两条，分别对应于650bp和147bp;对于第三外显子，对照酶切扩增产物获得的电泳条带为两条，分别对应于229bp和204bp。[0103]在具体实施本发明所述的鉴定时，PCR反应体系中可同时包括扩增第一外显子的弓丨物和扩增第三外显子的引物。获得PCR反应产物后，可用AFIII和Bspl286I分别酶切所述反应产物。由此可同时判断该水稻是否为sd-lj基因型或sd-lr基因型。当然，对于同一品种的水稻，也可用第一外显子的引物和第三外显子的引物分别进行PCR扩增，然后分别用AFIII和Bspl286頂每切。由此也能判断该水稻是否为sd-lj基因型或sd-lr基因型。[0104]在一些具体实施方案中，为鉴定sd-lj等位基因，本发明具体使用以下引物：[0105]5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’（SEQIDN0:1，和[0106]5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’（SEQIDN0:2。[0107]在一些具体实施方案中，为鉴定sd-lr等位基因，本发明具体使用以下引物：[0108]5，-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3，（SEQIDN0:3，^P[0109]5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’（SEQIDN0:4。[0110]因此，如前文所述，本发明包括SEQIDNO:1—4中的任意一条引物，或者SEQIDNO:1和2,以及SEQIDNO:3和4的引物组合。[0111]可采用本领域常规的技术手段制备本发明的引物。例如，可采用固相亚磷酰胺三酯法，该法将DNA固定在固相载体上而完成DNA链的合成，合成的方向是由待合成引物的3’端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3’—5’磷酸二酯键连接。可采用本领域已知的DNA合成仪来合成本发明的引物，例如使用ABIPE公司生产的DNA合成仪。[0112]可采用常规的方法，例如通过氨水高温处理，将连接在CPG上的引物切下来，通过0PC、PAGE等手段纯化引物，成品引物可用C18浓缩、脱盐、沉淀。[0113]可将制备得到的引物序列配制成PCR用的引物试剂，例如将其溶解在常规的溶剂中。[0114]可将本发明的引物序列配制在试剂盒中，用于进行PCR。试剂盒中还可含有实施PCR时常用的其它试剂，包括但不限于DNA聚合酶、缓冲液、dNTP等。这些试剂的用量可根据实际用途容易地确定。[0115]因此，如前文所述，本申请包括限制性内切酶AFIII及任选的用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第一外显子的引物在鉴定水稻sd-lj基因型中的应用，或在制备用于鉴定水稻sd-lj基因型的试剂盒中的应用；以及限制性内切酶Bspl286I及任选的用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第三外显子的引物在鉴定水稻sd-lr基因型中的应用，或在制备用于鉴定水稻sd-lr基因型的试剂盒中的应用。[0116]下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的保护范围。除非另有说明，实施例中所用到的方法、试剂等均为本领域常规的方法、试剂。[0117]实施例[0118]—、实验材料[0119]1、实验材料为水稻苗期的叶片，水稻品种为“秀水09”、“秀水11”、和“老来青”。[0120]2、由上海铂尚生物技术有限公司合成以下引物：[0121]上游引物1:[0122]下游引物1:[0123]上游引物2:[0124]下游引物2:[0125]3、实验试剂：[0126]2XTaqMasterMix:购自北京康为世纪科技有限公司。[0127]新型植物基因组提取试剂盒DP320:购自天根生化科技北京有限公司。[0128]琼脂糖凝胶回收试剂盒DP209:购自天根生化科技北京有限公司。[0129]限制性内切酶AFIII和Bspl286I及其缓冲液：购自NewEnglandBiolabsNEB公司。[0130]4、实验设备:PCR仪、PCR板、电泳仪购自Bio-rad公司）、移液器Eppendorf公司）、电泳槽购自上海复日科技有限公司）。[0131]二、实验步骤[0132]一）提取水稻叶片基因组DNAgDNA:按天根生化科技北京）有限公司的新型植物基因组提取试剂盒DP320操作手册进行。[0133]二PCR扩增与鉴定[0134]1、配制20yLPCR反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：[0136]2、PCR仪设置反应程序[0138]将PCR板盖上封膜，放入PCR仪，开始扩增。[0139]3、配置1.5%的琼脂糖胶，待反应结束后，取20yL反应产物上样。在IXTAE电泳缓冲液中，120V电压下，电泳15min。即可在紫外下观察结果。[0140]三PCR产物回收：按天根生化科技（北京）有限公司的琼脂糖凝胶回收试剂盒DP209操作手册进行。[0141]四）酶切鉴定[0142]1、配制20yL反应体系，在Ep管中依次加入下列溶液：[0144]2、混匀后将Ep管放入37°C水浴锅中，保温2h。[0145]3、配置2%的琼脂糖胶，待反应结束后，取所有反应产物上样。在IXTAE电泳缓冲液中，120V电压下，电泳30min。即可在紫外下观察结果。[0146]三、实验结果[0147]图2显示了实验结果。其中图A显示，酶切后野生型（“老来青”）有650bp和147bp两条带而突变型（“秀水11”）有364bp、286bp和147bp三条带。图B显示，酶切后野生型（“老来青”）有229bp和204bp两条带而突变型（“秀水09”）有204bp、155bp和74bp三条带。[0148]综上，由于sd-Ι的等位基因上有点突变，可以用CAPS标记来快速准确的检测其基因型。具体而言，选用限制性内切酶BsP1286I来鉴定sd-lr基因上G—C的突变，用限制性内切酶AFIII来鉴定sd-lj基因上G—T的突变。

权利要求：1.选自下组的寡核苷酸序列：5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’（SEQIDN0:1;5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’（SEQIDN0:2;5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’（SEQIDN0:3jP5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’（SEQIDN0:4。2.—种引物试剂，所述引物试剂含有：5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和或5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’；和或5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和或5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’。3.—种PCR反应体系，该反应体系中含有：引物5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和或5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’；和或引物5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和或5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’；和，任选的扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。4·一种检测试剂盒，该检测试剂盒含有：用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因第一外显子和或三外显子的引物，限制性内切酶六?111和或88?12861，以及任选的扩增缓冲液、dNTP和DNA聚合酶。5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述引物选自权利要求1所述的寡核苷酸序列或权利要求2所述的引物试剂；优选地，所述试剂盒含有：引物5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-〇6〇六了6六176六60'6^61'：-3’，以及限制性内切酶六？111;或所述试剂盒含有：引物5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’，以及限制性内切酶Bspl2861;或所述试剂盒含有：引物5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’，以及限制性内切酶AFIII;以及引物5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’，以及限制性内切酶Bsp12861。6.—种鉴定水稻sd-lj基因型的方法，所述方法包括：1使用引物扩增该水稻的半矮杆基因sd-1基因的第一外显子；2使用酶AFIII酶切步骤1获得的扩增产物;和3对酶切产物进行电泳；其中，若电泳条带存在三个条带，则将该水稻鉴定为sd-lj基因型；优选地，所述三个条带分别对应于约364bp、286bp和147bp;优选地，所述引物为5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’和5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’。7.—种鉴定水稻sd-lr基因型的方法，所述方法包括：1使用引物扩增水稻半矮杆基因sd-1基因的第三外显子；2使用酶Bspl286I酶切步骤（1获得的扩增产物;和3对酶切产物进行电泳；其中，若电泳条带存在三个条带，则将该水稻鉴定为sd-lr基因型；优选地，所述三个条带分别对应于约204bp、155bp和74bp;和优选地，所述引物为5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’和5’-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3’。8.如权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对对照水稻的sd-1基因的第一外显子和或第三外显子进行扩增、对扩增产物进行相同的酶切、以及对酶切产物进行电泳的步骤。9.限制性内切酶AFIII及任选的用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第一外显子的引物在鉴定水稻sd-lj基因型中的应用，或在制备用于鉴定水稻sd-lj基因型的试剂盒中的应用；优选地，所述用于扩增水稻半矮杆基因sd-1基因的第一外显子的引物为：5’-AATCTCATGGTGGCCGAGC-3’，和或5’-CGCATGATTGAGCTGCTGTC-3’。10.限制性内切酶Bspl286I及任选的用于扩增水稻半矮杆基因sd-Ι基因的第三外显子的引物在鉴定水稻sd-lr基因型中的应用，或在制备用于鉴定水稻sd-lr基因型的试剂盒中的应用；优选地，所述用于扩增水稻半矮杆基因sd-1基因的第三外显子的引物为：5’-GACATTGGCGATGTAGCCCT-3’，和或5，-GTTCGTTCCGTTTCGTTCCG-3，。

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