申请/专利权人：深圳先进技术研究院

申请日：2017-12-19

公开（公告）日：2020-11-27

公开（公告）号：CN109942672B

主分类号：C07K7/06(20060101)

分类号：C07K7/06(20060101);C12N15/11(20060101);A61K38/09(20060101);A61P35/00(20060101);A61P1/16(20060101);A61P3/10(20060101);A61P29/00(20060101);A61P15/00(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.11.27#授权;2019.07.23#实质审查的生效;2019.06.28#公开

摘要：本发明公开了一种GPR1拮抗多肽及其衍生物与应用，具体涉及一种GPR1拮如序列SEQIDNo.1‑4及其衍生物与应用。该结合肽的衍生物为GPR1结合肽氨基酸侧链基团上、GPR1拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为GPR1拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；该结合肽及其衍生物在体外能结合GPR1，通过阻断chemerin与GPR1的结合而促进cAMP浓度增加、抑制chemerin引起的钙Ca2+内流，为高表达GPR1受体疾病如乳腺癌等提供有效的治疗小分子药物，能够在医学与生物学领域得到广泛的应用。

主权项：1.一种GPR1拮抗多肽，其特征在于，其氨基酸残基序列为Ser-DIle-Leu-Pro-Val-Thr-Arg-NH2。

全文数据：一种GPR1拮抗多肽及其衍生物与应用技术领域本发明涉及生物技术和生物医药领域，具体而言，本发明是雌性生殖疾病靶点GPR1受体拮抗多肽LRH7-G6及其衍生物与应用。背景技术乳腺癌Breastcancer是仅次于肺癌的全球第2高死亡率的致命性癌症，它持续性破坏着全世界数以百万计的妇女及其家庭的生命健康。据世界卫生组织国际癌症研究中心最新统计，2012年全球女性乳腺癌新发病例达167万，占全部女性恶性肿瘤发病的22.9％；46万女性因乳腺癌死亡，占所有女性恶性肿瘤死亡的13.7％，占所有女性死亡的1.7％，大约有4个患癌妇女中就有1个患有乳腺癌。中国女性乳腺癌年龄标化发病率为21.610万，居女性癌症发病的第1位；死亡率为5.710万，居女性癌症死亡的第6位。4％～6％乳腺癌诊断时即为转移性乳腺癌，而接受辅助治疗的早期患者30％～40％可发展为转移性乳腺癌，患者5年生存率约20％。而手术、放疗和化疗等传统治疗方式，作用的特异性和专一性不佳，不可避免的会对正常细胞和组织产生杀伤性作用，给患者带来极大的副作用。因此，寻找高效特异性的靶向药物，将极大提高乳腺癌的治疗效果！临床研究发现，早期乳腺癌往往不具备典型的症状和体征，不易引起重视，常通过体检或乳腺癌筛查才能发现。虽然乳腺癌的早期诊断可以为乳腺癌的治疗赢得宝贵的时间，可以极大提高乳腺癌的治疗效果，但是我国目前进行早期乳腺癌诊断的人员比例很少。乳腺癌术后转移至淋巴，是乳腺癌常见的一种转移症状。一般地说，乳房外侧病变向腋窝淋巴结转移的机会占23，向胸骨旁转移的机会为13。在乳房内侧和中央部的肿瘤，向内侧和外侧乳腺癌淋巴转移的机会各占12，乳腺癌容易发生肺转移和淋巴转移。肿瘤微环境对肿瘤的形成至关重要，决定了肿瘤的发生和发展。最先是正常的乳腺干细胞发生致癌突变转化为乳腺癌干细胞，产生预后不良的肿瘤，然后这些具有转移性的不良预后的肿瘤，在基质纤维母细胞的影响下，一部分乳腺癌干细胞发生转移，转移到脑部、肺部、肝脏以及骨髓。有研究表明，趋化因子受体CXCR4在乳腺癌组织中呈现异常高表达，其配体基质细胞衍生因子－1CXCL12也高表达于乳腺癌转移部位，如骨髓、淋巴结、肺部以及肝脏中，CXCR4CXCL12信号系统在乳腺癌的归巢向远处其他器官转移中发挥着重要的作用，因此也成为了乳腺癌骨转移潜在的治疗靶标，其中CXCR4拮抗多肽—CTCE-9908，已经进入临床前试验阶段，在乳腺癌动物模型中能够很好的抑制乳腺癌的骨转移。因此，趋化因子在乳腺癌发生发展和转移中发挥着重要的作用，以趋化因子为靶标治疗乳腺癌的靶向药物具有广阔的市场前景以及应用价值。乳腺癌起源于乳腺各级别导管和腺泡上皮，由腺上皮增生到不典型增生而逐步发展为原位癌、早期浸润癌至浸润性癌。不同级别的导管发生的癌变，其组织类型常常不同。乳腺癌中95％以上是恶性上皮性肿瘤，乳腺肉瘤十分少见。组织病理学上最常见的两种侵润性乳腺癌分别为：侵润性导管癌也被称为“普通型，NOS”和小叶癌。这两种乳腺癌是由前侵润性导管和小叶瘤形成的。侵润性导管癌和小叶癌以及其它类型的乳腺癌的不同之处主要是由细胞之间的形态差异引起的。乳腺癌分子靶向治疗是指针对乳腺癌发生、发展有关的信号通路及其癌基因相关表达产物进行治疗。受恶性肿瘤发病率居高不下的影响，全球抗肿瘤药物市场呈现持续增长之势，2010年抗肿瘤类药物的销售额达459.7亿美元，占世界药物销售额的5.8％，居世界第一，比2009年增长8％。其中，分子靶向抗肿瘤药物销售额为311.9亿美元，增长率达到23％。1997年美国食品和药物管理局FoodandDrugAdministration，FDA批准抗人表皮生长因子受体2HER-2的分子靶向治疗药物—曲妥珠单克隆抗体的应用，开始了乳腺癌分子靶向治疗的新时代。据全球畅销药数据统计，2015年全球乳腺癌药物市场规模已超过100亿美元，其中销售额最高的是曲妥珠单抗Trastuzumab，销售额为67.9亿美元，较同期增长4.2％。许多研究发现，表皮生长因子受体EGFR是调控乳腺癌发生和发展的关键分子，通过激活下游RasRafMEKERK和PI3KAKT信号通路，EGFR促进了乳腺癌的增殖、迁移和侵袭；另外，表皮生长因子受体2HER-2高表达于乳腺癌细胞，通过形成同源二聚体或异源二聚体，激活下游PI3KAkt和RasMAPK信号通路促进乳腺癌增殖、血管生成、迁移和侵袭。目前，针对乳腺癌治疗的分子靶向药物主要有：针对表皮生长因子受体-2治疗的曲妥珠单抗；针对PI3KAKTmTOR通路中的抑制剂依维莫司；针对抗血管生成药物的贝伐珠单抗；针对BRCA12突变的iniparib；以及针对CDK46抑制剂palbociclib。这些靶向药物的问世及应用为乳腺癌患者带来了新的曙光，使乳腺癌的治疗变得更加精确，极大地减轻了传统治疗带来的损伤副作用！趋化因子及其受体在乳腺癌的发展过程中，不但与肿瘤微环境的建立及肿瘤转移密切相关，还可以介导肿瘤细胞的恶化，以及促进肿瘤细胞的生长及增殖。研究指出，CXCL8、CXCL12、CCL2、CCL5、CCL18等趋化因子具有促乳腺癌作用，而另外一些趋化因子如XCL1、CXCL9、CXCL10、CXCL14、CCL16、CCL19等则可能有抗乳腺癌作用。肿瘤相关成纤维细胞CAFs和癌细胞可以活化并分泌大量CCL2，促进肿瘤干细胞CSC的自我更新，进而强化肿瘤细胞对化、放疗的抵抗性并促进病灶的转移。CXCR4在乳腺癌中的阳性率高达60％，CXCL12CXCR4作用网络在包括乳腺癌在内的多种实体瘤的生长、转移中发挥重要作用，阻断这一生物学轴可抑制血管生成和肿瘤扩散，增加肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性。在4T1小鼠乳腺癌模型，用携带CXCR4拮抗剂的溶瘤病毒治疗可抑制血管生成和肿瘤转移。TNBC中CXCR4的表达71％高于HER-2阳性乳腺癌44％和Luminal型乳腺癌37％，CXCR4+TNBC患者肿瘤大，易发生肝、肺、脑转移，预后差。趋化因子及其受体拮抗剂或抑制剂具有广阔的市场前景。有统计表明，约30％的小分子药物是以G蛋白偶联受体为靶向的。CXCR4多肽类拮抗剂CTCE-9908已被证实可抑制小鼠骨肉瘤和黑色素瘤的肺转移。CXCR1CXCR2拮抗剂—Repertaxin在动物模型中可抑制肿瘤的生长和转移，已用于中晚期乳腺癌患者临床试验。因此，研究趋化因子在肿瘤发展中的作用，寻找趋化因子治疗乳腺癌的新靶点，不仅对阐释肿瘤转移有着重要的意义，而且有广阔的药物市场前景。肥胖与乳腺癌的相关性研究最早见于20世纪60年代，病例对照研究最早提出乳腺癌的发病倾向于绝经后肥胖及高血压病的女性。在动物实验研究中也发现，与对照组相比，肥胖的小鼠肿瘤生长速度明显增加。世界癌症研究基金会和美国癌症研究所以流行病学证据进行回顾性分析，动物模型的研究结果证明超重和肥胖可显著增加患乳腺癌的危险性。Meta分析显示，患乳腺癌的危险性随BMI增加而增加，BMI＞30kgm2的患者患乳腺癌的风险是正常人的1.3～2倍，肥胖可显著增加女性患乳腺癌的风险。肥胖促进乳腺癌发生、发展的可能机制包括以下几个方面:1雌激素。肥胖会增加雌激素的合成，降低血清雌二醇与性激素结合球蛋白SHBG水平，血清雌激素过量，竞争靶器官上的雌激素受体，引起下丘脑-垂体-卵巢性腺轴功能紊乱，打破乳腺组织增生与复旧的平衡，促进乳腺癌细胞的异常增殖与转化；2慢性炎症。肥胖患者脂肪组织中活化的巨噬细胞可分泌大量促炎介质，引起慢性炎症反应，大量炎性因子和体内各种细胞为肿瘤形成了肿瘤微环境，从而促进乳腺癌细胞的发生、发展。当血液中TG浓度过高时，乳腺血管脂质沉积导致慢性炎症的发生，炎症细胞分泌的炎症因子与间质成纤维细胞、淋巴细胞、巨噬细胞、血管及淋巴管网络和细胞外基质形成肿瘤微环境，干扰DNA的复制和转录，导致恶性肿瘤发生；3胰岛素和胰岛素样生长因子-1IGF-1。肥胖易出现胰岛素抵抗，使胰岛素及IGF-1的水平升高，有助于癌细胞的增殖和血管再生。一项来自瑞士数据库的研究收集了2005年接受胰岛素治疗的115000例患者的资料，发现在接下来的2年时间里单用甘精胰岛素治疗的患者乳腺癌发病风险明显较使用其他胰岛素类似物高RR＝1.99。4脂肪细胞因子。肥胖会影响脂肪细胞因子的产生，降低脂联素，升高瘦素、PAI-1等的水平，促进细胞增殖、抗凋亡及加速血管生成，从而促进癌细胞的增殖及生长。脂联素不仅可以抑制胰岛素与雌激素协同促进的有丝分裂作用，还可以通过促进Bax和p53促凋亡基因的表达，降低癌细胞的转移和浸润能力。瘦素能够通过激活JAKSTAT3，MAPK-ERK12或者PI3K通路，从而促进乳腺癌的生长；另外，瘦素还能通过诱导血管生成素的表达促进肿瘤相关血管的生成，并且瘦素还能诱导人表皮生长因子受体2ErbB-2的转录，并且参与三阴性乳腺癌细胞中胰岛素样生长受体1IGF-1的反应，激活表皮生长因子受体EGFR从而促进细胞的侵袭与转移。肥胖是绝经后乳腺癌的危险因素，肥胖与乳腺癌发生、发展的关系密切且复杂，大量研究表明肥胖对乳腺癌的发生、发展、诊断、肿瘤特点及预后均可产生一定的负向调控。因此，通过对肥胖、脂肪组织以及其分泌的脂肪因子与乳腺癌关系的进一步探索和研究，可为今后制定降低乳腺癌发病率和改善疾病预后的相应措施提供非常重要的参考依据。脂肪因子Chemerin脂肪因子Chemerin也称为他扎罗汀诱导基因2TIG2或视黄醇受体反应蛋白2。在1997年被Nagpal等克隆发现后，在2003年，Wittamer等在卵巢癌继发的腹水中通过反相高压液相层析分离得到其活性蛋白。Chemerin蛋白前体全长163个氨基酸，具有6个半胱氨酸残基，形成3个二硫键，去掉N端信号肽和C端的几个氨基酸，才具有生物活性，其血液中的chemerin活化形式含有134个氨基酸约16kDa，在结构上属于杀菌肽半胱氨酸蛋白酶抑制剂家族，当发生炎症反应时，在几种蛋白酶作用下chemerin能迅速转变成活化形式。Chemerin在人体的多种组织广泛表达，主要表达于白色脂肪组织、胎盘和肝脏，与3个受体相结合：①G蛋白偶联受体CMKLR1；②G蛋白偶联受体GPR1；③CCRL-2。Chemerin结合GPR1后，一方面可以使GPR1阳性细胞内的钙离子释放，抑制cAMP的聚集，使MAP激酶磷酸化；另外一方面对细胞内钙离子内流具有促进作用。Chemerin一方面作为趋化因子，趋化树突状细胞和巨噬细胞，在免疫和适应性免疫之间起桥梁作用，趋化天然杀伤细胞到达炎症部位参与炎症反应；另一方面作为新的脂肪因子，由脂肪组织分泌产生，调节脂肪细胞的分化、脂解，可促进脂肪细胞内胰岛素信号传导途径等生物学效应。Chemerin在肥胖和代谢综合征的病理生理机制中占重要的地位。GPR1受体GPR1是CMKLR1最接近的同系物，与CMKLR1共享超过40％的序列同一性。它是一种在真核细胞中起关键作用的G蛋白偶联受体，通常对葡萄糖刺激，脂质积累以及将营养信号传递给cAMP途径。许多信号转导通过真核生物中的G蛋白→偶联受体GPCR介导。G蛋白β偶联受体存在于一些真核生物中，包括酵母，双鞭毛虫和动物。GPR1最初是在人类中发现的G蛋白偶联受体GPCR，其通过体外实验被鉴定为chemerin的受体。虽然没有报道Chemerin与GPR1结合的生理功能，但据报道，GPR1在鼠动物棕色脂肪组织，白色脂肪组织和骨骼肌中高度表达，并且GPR1主要在白色脂肪组织的血管细胞中表达。在喂食高脂肪饮食的GPR1敲除小鼠中，发现其葡萄糖不耐受比WT小鼠更严重。此外，在丙酮酸耐受试验中，GPR1敲除小鼠能够抑制葡萄糖α刺激的胰岛素水平升高，引起血糖升高。这些结果表明，GPR1是Chemerin的活性受体，可以调节肥胖期间葡萄糖体内的平衡。使用Tango生物测定，测量在增加Chemerin剂量治疗后CMKLR1和GPR1在HTLA细胞中的活性。发现Chemerin以相似的功效激活CMKLR1和GPR1，达到效果为265.3±182.2-和185.6±26.5-倍变化的最大反应Emax。此外，Chemerin激活GPR1比激活CMKLR1EC50,54.6±30.7nM具有显著更高的效力EC50,18.2±2.9nM，这证明Chemerin激活了GPR1，同时GPR1也是高度敏感的Chemerin受体。GPR1表达细胞系通过弱Ca2+动员和ERK12激活对chemerin作出反应，但其由于激动剂结合而有效地内化。因此，GPR1可能作为chemerin的诱饵受体，而迄今为止，在主要细胞内或体内尚未有对GPR1介导的活性的描述。并且GPR1在中枢神经系统，骨骼肌，皮肤和脂肪组织中表达，可能调节chemerin的活性。G蛋白偶联受体超家族GPCRs在胞外信号向胞内转导过程中起到重要的作用，调控着细胞运动、生长和基因转录—这三个癌症生物学中至关重要的因素。过去的十几年中，介导的信号通路已经被证明是原癌基因信号的关键调控者，并且是很好的药物靶点，目前市面上出售的药物60％都是针对该受体设计的。而GPR1作为GPCRs成员之一，目前仍然没有任何药物是直接针对GPR1来治疗临床癌症的。因此，以GPR1为靶标，筛选抗癌的新型多肽药物和人源化抗体具有重要的社会意义和广阔的经济市场。噬菌体展示技术PhageDisplayTechnology是一项特异性多肽或蛋白的筛选技术，此技术可将目的基因编码的多肽以融合蛋白的形式展示于噬菌体表面，被展示的多肽或蛋白可以保持相对独立的空间结构和生物活性，使大量随机多肽与其DNA编码序列之间建立了直接联系，使得各种靶分子如抗体、酶和细胞表面受体等的多肽配体通过体外亲和淘选程序得以快速鉴定。自从问噬菌体展示技术世以来，因其高库容、高效方便以及灵活筛选等优势，噬菌体抗体库技术在近几十年内进展非常迅速，在生命科学的许多领域得到广泛应用，尤其在肿瘤诊断和肿瘤抗体药物制备等领域正越来越受到的重视。目前多肽药物的主要作用靶点是G蛋白偶联受体GPCRs，在临床研究中有39％多肽药物靶向GPCRs。多肽药物具有许多优点：⑴成药性高于一般化学药物，其生物活性高，特异性强；⑵毒性反应相对较弱，在体内不易产生蓄积；⑶与其他药物的相互作用比较少，与体内受体的亲和性比较好。人源化单克隆抗体具有灵敏度高、特异性强、高效、血清交叉反应少或无、制备成本低等优点。利用噬菌体展示技术筛选多肽药物和人源化抗体，可以实现基因型和表型的统一，是一种制备抗体高效、实用的技术方法，该技术利用表达蛋白与配体的亲和力，将所需要的蛋白或多肽筛选出来，广泛用于疾病标志物的识别筛选和抗体药物的筛选和制备之中。发明内容为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种由噬菌体展示库筛选得到的GPR1拮抗多肽，该拮抗多肽与Chemerin受体GPR1具有特异性高亲和力，能够通过抑制Chemerin与GPR1的结合来阻断ChemerinGPR1的信号通路，其在高表达GPR1受体的疾病的靶向治疗方面具有巨大的应用价值。本发明的另一目的在于提供上述GPR1受体拮抗多肽的衍生物，该衍生物也能够与GPR1受体具有特异性高亲和力，且特异性竞争Chemerin与GPR1的结合位点，能够抑制Chemerin结合GPR1。本发明的再一目的在于提供上述GPR1拮抗多肽及其衍生物的应用。为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：GPR1拮抗多肽，其特征在于，其氨基酸序列为:Ser-DIle-Leu-Pro-Val-Thr-Arg-NH2，SEQIDNo.1，即LRH7-G6。上述GPR1拮抗多肽的筛选方法，该方法利用噬菌体随机肽库，首先采用GPR1质粒转染293T细胞，获得永久高表达GPR1的稳定细胞系，以野生型293T细胞为对照吸附细胞，进行5轮全细胞消减筛选，随机挑取50个阳性噬菌体扩增，提取克隆单链DNA测序。分析多肽的氨基酸序列的基本特征，多肽同源性比较，检索出现频率高的多肽基序。BLAST检索蛋白质数据库，检测多肽基序同源性较高的蛋白质，发现含有大量该多肽的生物物种，及可能结合的细胞表面受体和配体，有利于后续大量提取和纯化获得多肽。亲水性分析表明，LRH7-G6为疏水性多肽；高效液相色谱法HPLC和质谱MS检测LRH7-G6合成的纯度达到了99.85％。本发明另一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽的衍生物为GPR1受体拮抗多肽氨基酸侧链基团上、GPR1受体拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为GPR1受体拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；优选地，所述的常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰等；优选地，所述的标签为His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1拮抗多肽的生物活性片段或类似物，其如SEQIDNo.2-4所示：SILPX1TRSEQIDNo.2,其中：⑴X1为异亮氨酸I。SILPVTRSEQIDNo.3SILPVTR-NH2SEQIDNo.4。本发明还提供了GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物的衍生物，所述GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物的衍生物的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；优选地，所述的常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、硫酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰等；优选地，所述的标签为His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。在本发明的技术方案中，所述的GPR1拮抗多肽及其衍生物可以应用于制备预防和或治疗雌性生殖疾病方面的药物，其存在形式由7个氨基酸组成。所述的GPR1拮抗多肽的衍生物为GPR1拮抗多肽氨基酸侧链基团上、GPR1拮抗多肽片段的氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为GPR1拮抗多肽上连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；所述的常规修饰优选为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰等；所述的标签优选为His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact等；所述的GPR1拮抗多肽及其衍生物可以来源于细菌、真菌、病毒、昆虫、植物、鱼类、哺乳类动物或者鸟类，例如灵长类动物人类；啮齿类动物，包括小鼠，大鼠，仓鼠，兔，马，牛，犬类，猫等。所述的GPR1拮抗多肽的衍生物优选为：上述GPR1拮抗多肽第二个氨基酸残基为D构型异亮氨酸，末端进行酰胺化修饰，即为Ser-DIle-Leu-Pro-Val-Thr-Arg-NH2，SEQIDNo.1。所述的GPR1拮抗多肽及其衍生物的获得，采用现有技术中的公知方法进行，既可以用多肽自动合成仪进行化学合成；通过将短肽序列推导出核苷酸序列，然后克隆到载体中进行生物合成；也可以从现有存在的生物体内进行大量提取和纯化。具体来说，GPR1拮抗多肽LRH7-G6及其衍生物具有以下序列：SILPX1TRSEQIDNo.2,其中：⑴X1为异亮氨酸I。SILPVTRSEQIDNo.3真菌、细菌、甲虫SILPVTR-NH2SEQIDNo.4真菌、细菌、甲虫本发明再一个方面提供了一种多聚核苷酸，其编码SEQIDNo.1-4任一项所述多肽。本发明再一个方面提供了一种载体，其包含了本发明所述的核苷酸，可以通过基因技术手段与启动子序列链接。本发明再一个方面提供了一种宿主细胞，其转染了本发明所述的载体。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在制备治疗chemerin-GPR1介导疾病的药物中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在治疗chemerin-GPR1介导疾病中的用途。在本发明的技术方案中，所述chemerin-GPR1介导疾病选自乳腺癌、脂肪肝、糖尿病、炎症反应、多囊卵巢综合症。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在制备抑制chemerin造成的cAMP浓度的降低的药物中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在抑制chemerin造成的cAMP浓度的降低中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在制备抑制chemerin引起的钙Ca2+内流作用的药物中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在抑制chemerin引起的钙Ca2+内流作用中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在制备抑制chemerin引起的细胞趋化作用的药物中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在抑制chemerin引起的细胞趋化作用中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在制备治疗乳腺癌、脂肪肝、糖尿病、炎症反应、多囊卵巢综合症的药物中的用途。本发明再一个方面提供了本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物在治疗乳腺癌、脂肪肝、糖尿病、炎症反应、多囊卵巢综合症中的用途。本发明再一个方面提供了一种药物组合物，其中包含本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物中的一种或多种作为活性成分。所述的药物组合物可以含有一种或者是多种药学上可以接受的载体；所述药学上可以接受的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；所述的药物组合物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备；一种预防和或治疗高表达GPR1受体的疾病方面的药物，包含GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物SEQIDNo.1～4中的至少一种。一种预防和或治疗雌性生殖疾病或肿瘤方面的药物，包含本发明所述的GPR1受体拮抗多肽、GPR1受体拮抗多肽的衍生物、GPR1受体拮抗多肽的生物活性片段或类似物及其衍生物中的至少一种。在本发明的一具体实验中，本发明利用所获得的GPR1拮抗多肽LRH7-G6可以有效的缓解chemerin对cAMP信号通路的抑制作用。其中，GPR1拮抗多肽LRH7-G6衍生物SEQIDNo.1～4具有相同作用。在本发明的另一具体实验中，利用GPR1拮抗多肽LRH7-G6可以有效的抑制chemerin引起的钙Ca2+内流作用。其中，GPR1拮抗多肽LRH7-G6衍生物SEQIDNo.1～4具有相同作用。本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果:1本发明提供了一种GPR1拮抗多肽LRH7-G6及其衍生物SEQIDNo.1～4，所述的拮抗多肽及其衍生物能够专一性与GPR1结合，并特异性竞争Chemerin与GPR1结合位点，能够抑制ChemerinGPR1信号通路。可以作为ChemerinGPR1结合位点的生物类多肽药物，可用于制备预防和或治疗高表达GPR1受体的疾病方面的药物，例如：乳腺癌、脂肪肝、糖尿病以及炎症反应、多囊卵巢综合症。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。附图说明图1：LRH7-G6高效液相HPLC检测图。图2：LRH7-G6质谱MS检测图。图3：GPR1，chemerin以及LRH7-G6多肽疏水轮廓比较分析。其中：A：GPR1疏水轮廓图；B：chemerin疏水轮廓图；C：LRH7-G6多肽疏水轮廓图；D：GPR1，chemerin以及LRH7-G6多肽疏水轮廓比较图。GPR1轮廓为红色，chemerin轮廓为蓝色，LRH7-G6轮廓为绿色；图4：LRH7-G6缓解chemerin对cAMP信号通路的抑制作用。其中，A，LRH7-G6与Forsklin和Chemerin在293T野生型细胞中的作用；B，LRH7-G6单独在293TGPR1++中的作用；C，LRH7-G6与Forsklin和Chemerin在293TGPR1++中的作用；图5：LRH7-G6抑制chemerin引起的钙Ca2+内流作用。具体实施方式为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。实施例1：进行GPR1拮抗多肽LRH7-G6的淘选、扩增、纯化、测序及合成。本实施例主要是为了筛选获得与GPR1特异性结合的阳性噬菌体，再通过将阳性噬菌体扩增、纯化，提取噬菌体单链DNAssDNA进行测序，将所获得的序列分析对比，最后合成高纯度的拮抗多肽LRH7-G6。具体如下：1.建立永久高表达GPR1的293T细胞系：293T-GPR1++LRH①选取生长旺盛的可发光的人293T细胞，在转染前一天以5×105个孔，接种于6孔板中，培养至第二日后，细胞融合度为60％；②第二日进行转染，以6孔板的一个培养孔为单位，用200μL的opti-MEM培养基稀释3μg质粒，另以200μL的opti-MEM培养基稀释6μL脂质体Lipofectamine2000，分别轻轻混匀后，室温放置5分钟；③将两管稀释液轻轻混合，室温静置20分钟后，向混合后的稀释液中轻轻加入600μL的opti-MEM培养基；④将待转染的细胞用PBS轻轻漂洗一次，然后将混合好的稀释液轻轻加入培养孔中，置于二氧化碳培养箱中培养；⑤培养4～6小时后弃尽转染所用培养基，向孔中加入3mL完全培养基；⑥48小时后选用含有1μgmL嘌呤霉素puromycin的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达GPR1的293T细胞系。⑦用TRIzol提取总RNA，定量2μgRNA进行逆转录逆转录试剂盒，购于Promega公司，并用特异引物序列进行qPCR。所用特异引物序列为Hu-GPR1引物序列：Fw5’-AATGCCATCGTCATTTGGTT-3’SEQIDNo.5Rv5’-CAACTGGGCAGTGAAGGAAT-3’SEQIDNo.6⑧与转染了pSM2c-Hu-scrambleRNA的做比较，检测GPR1的高表达水平，并命名为：293T-GPR1++LRH，即可以用于阳性噬菌体筛选。2.进行GPR1拮抗多肽的淘选、扩增、纯化、测序及合成。①ER2738宿主菌液的制备：无菌技术操作，先取200μlLB-Tet液体培养基于1.5ml灭菌离心管中，再从E.coliER2738的甘油冻存物中取0.2μl菌液与之充分混匀，全部吸取涂布于LB-Tet平板上，标记平板，室温放置3min，然后置于37℃恒温培养箱倒置过夜培养。次日观察，长出克隆后用封口膜封口，4℃避光保存备用。用灭菌枪头以无菌技术挑取单菌落，放入已预先加有3mlLB-Tet液体培养基的10ml灭菌离心管中，标记后于恒温摇床37℃，300rpmmin振荡培养过夜。次日，细菌扩增液于4℃储存备用。取10ml灭菌离心管，无菌操作加入3mlLB-Tet液体培养基，取30μl过夜培养的细菌接种其中，恒温摇床37℃，300rpmmin振荡培养2～3h，细菌处于指数生长期，肉眼观察呈雾状OD600～0.5。②GPR1拮抗肽的淘选：将高表达GPR1细胞按105个培养皿接种于预先包被多聚赖氨酸的60×15mm2培养皿中，常规培养至细胞密度80％～90％时，用于淘洗同时用不表达GPR1的细胞系作为空白对照每轮洗脱液先取1μl测滴度，剩下的将其加入到20mlLB培养液中扩增，再纯化、最后再测扩增后的滴度，扩增物于4℃短期保存，并取相等数量级用于下一轮淘选，剩下的扩增物用50％的甘油于-20℃保存。③测定噬菌体的滴度:取4支灭菌的10ml离心管，每个噬菌体稀释度准备1个灭菌离心管，微波炉熔化顶层琼脂AgaroseTop，每管加入3ml顶层琼脂，45℃水浴备用。每个噬菌体稀释度准备1块LBIPTGXgal平板，37℃恒温培养箱预热备用。将OD600～0.5的E.coliER2738大肠杆菌按照噬菌体稀释度200μl管分装，4℃保存备用。取4支灭菌的1.5ml离心管，分别盛有100μl、90μl、90μl、90μlLB-Tet培养基，将待测噬菌体吸取1μl入100μlLB-Tet培养基中，按10倍梯度稀释，分别标记为10-1、10-2、10-3、10-4，每个稀释度轻轻振荡混匀，瞬间离心。取10μl待滴定的各稀释度的噬菌体与200μlE.coliER2738混合，轻轻振荡混匀，瞬间离心，室温孵育5min。将混合菌液迅速加入顶层琼脂中，快速振荡混匀，立即倒入预热的LBIPTGXgal平板，将其均匀展平，室温冷却5min，37℃恒温培养箱中，倒置平板培养过夜。④洗脱噬菌体的扩增及纯化：取250ml的锥形瓶，按1:100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至20mlLB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；然后将待扩增的噬菌体液加入到锥形瓶中，37℃，250rpm剧烈振荡培养4.5h；将培养物转入50ml离心管中，4℃10,000rpm离心10min。上清液转入另一干净离心管中，4℃10,000rpm再次离心10min；取上清的80％转入另一干净离心管中，加入14体积的PEGNaCl，颠倒混匀后于4℃沉淀过夜；第二天，将沉淀于4℃,12,000rpm离心20min。用干净枪头小心吸取上清液，再4℃12,000rpm离心1min，去掉残留上清液；然后用1mlTBS重悬沉淀物，轻轻吹打100次。然后将悬液转入2ml离心管中，4℃10,000rpm离心5min除去残余细胞；将上清加入14体积的PEGNaCl后，于冰上孵育60min再次沉淀；取出离心管，4℃12,000rpm离心20min，去掉上清；用200μlTBS重悬沉淀，4℃10,000rpm离心1min。上清转入另一离心管中。4℃短期保存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。单克隆噬菌体的扩增，包括⑴按1:100比例，将过夜培养的ER2738宿主菌液加入至2mLLB液体培养基中，37℃，250rpm剧烈振荡培养2h；用灭菌牙签，从第四轮滴度平板中选取少于100个噬菌斑的平板，挑取分隔良好的蓝色噬菌斑，加入到培养管中，37℃250rmin剧烈震荡培养4.5h；然后将培养物转入到新鲜离心管中，4℃10,000rpm离心30sec。上清转入以新鲜管中，再同样离心一次；将上清的80％转入新鲜离心管中，4℃贮存，也可以用50％的甘油于-20℃长期保存。⑤琼脂糖凝胶电泳鉴定M13噬菌体ssDNA：将凝胶成形模具水平放置，将选好的梳子放好，梳子底部与模具之间留1mm空间；称取DNA电泳用琼脂糖1g放入250ml的三角烧瓶中，加入100ml1×TAE缓冲液，混匀后，将烧瓶置于微波炉中，加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解；关闭电磁炉，取出三角烧瓶，将其置室温下冷却至室温手握烧瓶可以耐受，再加入溴化乙锭5μl，混匀后，即将凝胶溶液倒入胶板铺板。本实验所用制胶板约需胶液100ml；室温下待凝胶完全凝固，需时约30分钟，拔出梳齿，将胶板放入电泳槽中；在电泳槽加入1×TAE缓冲液，以高出凝胶表面2mm为宜；将样品用Loadingbuffer稀释以后加入胶板中，注意加样器吸头应恰好置于凝胶点样孔中，不可刺穿凝胶，也要防止将样品溢出孔外；接通电源，调节电压至50伏，电泳90min后，将凝胶板取出，在紫外灯下观察结果。⑥ssDNA测序及序列分析：将提取的M13噬菌体ssDNA送到上海英潍捷基生物技术有限公司进行DNA测序。测序以后用Bioedit软件进行序列分析。通过分析结果可知，样品序列为Ser-DIle-Leu-Pro-Val-Thr-Arg，其中第二位异亮氨酸为D构型，以LRH7-G6表示，最后短肽由上海强耀生物公司合成。图1高效液相色谱法HPLC及图2质谱MS检测LRH7-G6多肽的纯度为99.85％，并且分子量大小与预测值一致。图3的疏水性轮廓分析，证明LRH7-G6多肽与chemerin有一定的相似性，相似度达到0.0061350PAM250。实施例2GPR1拮抗多肽LRH7-G6可以有效的缓解chemerin对cAMP信号通路的抑制作用。1环磷酸腺苷cAMP酶联免疫吸附实验：①细胞铺板：将野生型293T细胞和高表达GPR1的293T细胞293TGPR1++，分别以5ⅹ105个孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为1mL，放置于培养箱中培养24h后，饥饿过夜，加入不同浓度梯度3μM，0.3μM，0.03μM的LRH7-G6多肽，Fosklin25μM以及chemerin30nM作用6h；②样品制备：每孔加入300μL的细胞裂解液，4℃放置20分钟，用细胞刮刀刮取收集细胞，上下颠倒混匀后，12,000rpm离心10分钟，收集上清；③样品浓度测定：样品浓度通过BCA法测定；④环磷酸腺苷cAMP酶联免疫吸附测试：a,准备所需试剂，每个样品准备3个复孔；b,将50μL的样品或标准品加入包被有抗体的96孔板中；再在每孔中加入25μLcAMP过氧化物酶示踪剂缀合物；c,每孔加入50μLAnti-cAMP抗体，室温，摇床上缓慢孵育30分钟；d,使用洗脱液清洗5次，每孔加入100μL化学反光剂，室温孵育5分钟；e,酶标仪读板，记录发光值。图4显示，chemerin在浓度为30nM的时候可以降低细胞cAMP浓度，但是在高表达GPR1的293T细胞293TGPR1++中加入不同浓度的LRH7-G63μM，0.3μM，0.03μM作用后，可以使cAMP浓度显著增高。而在野生型293T细胞中，不表达GPR1受体，因此LRH7-G6对chemerin降低cAMP浓度的作用无明显抑制作用。同样的，在LRH7-G6短肽单独作用组中，LRH7-G6也不能使cAMP浓度增高。综上所述，可以推断出，LRH7-G6可以特异性的通过与GPR1作用来进一步抑制chemerin对cAMP浓度的降低作用。*P深圳先进技术研究院一种GPR1拮抗多肽及其衍生物与应用CP11701262C6PatentInversion3.317PRT人工序列1SerIleLeuProValThrArg1527PRT人工序列MISC_FEATURE5..5异亮氨酸2SerIleLeuProXaaThrArg1537PRT真菌、细菌、甲虫3SerIleLeuProValThrArg1547PRT真菌、细菌或甲虫4SerIleLeuProValThrArg15520DNA人工序列5aatgccatcgtcatttggtt20620DNA人工序列6caactgggcagtgaaggaat20

权利要求：1.一种GPR1拮抗多肽，其特征在于，其氨基酸残基序列为Ser-DIle-Leu-Pro-Val-Thr-Arg-NH2SEQIDNo.1。2.一种GPR1拮抗多肽的生物活性片段或类似物，其如SEQIDNo.2-4所示：SILPX1TRSEQIDNo.2,其中：⑴X1为异亮氨酸；SILPVTRSEQIDNo.3SILPVTR-NH2SEQIDNo.4。3.权利要求1所述的GPR1拮抗多肽或权利要求2所述的GPR1拮抗多肽的生物活性片段或类似物的衍生物，其特征在于：所述的衍生物为GPR1拮抗多肽或者其生物活性片段活类似物的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行常规修饰得到的产物，或者为连接用于多肽或蛋白检测或纯化的标签所得到的产物；优选地，所述的常规修饰为氨基化、酰胺化、羟基化、羧基化、羰基化、烷基化、乙酰化、磷酸化、酯化、糖基化、环化、生物素化、荧光基团修饰、聚乙二醇PEG修饰或固定化修饰；所述的标签为His6、GST、EGFP、MBP、Nus、HA、IgG、FLAG、c-Myc或ProfinityeXact。4.一种多聚核苷酸，其可以编码SEQIDNo.1-4任一项所述多肽。5.一种载体，其包含了权利要求4中所述的任一条多聚核苷酸，并通过基因技术手段与启动子序列链接。6.一种宿主细胞，其转染了权利要求5中所述的载体。7.权利要求1所述的GPR1受体拮抗多肽、权利要求2所述的生物活性片段或类似物以及权利要求3所述的衍生物在治疗chemerin-GPR1介导疾病中的用途；优选地，所述chemerin-GPR1介导疾病选自乳腺癌、脂肪肝、糖尿病、炎症反应、多囊卵巢综合症。8.权利要求1所述的GPR1受体拮抗多肽、权利要求2所述的生物活性片段或类似物以及权利要求3所述的衍生物在制备抑制chemerin造成的cAMP浓度的降低的药物中的用途。9.权利要求1所述的GPR1受体拮抗多肽、权利要求2所述的生物活性片段或类似物以及权利要求3所述的衍生物在制备抑制chemerin引起的钙Ca2+内流作用的药物中的用途。10.权利要求1所述的GPR1受体拮抗多肽、权利要求2所述的生物活性片段或类似物以及权利要求3所述的衍生物在制备抑制chemerin引起的细胞趋化作用的药物中的用途。11.一种药物组合物，其中包含权利要求1所述的GPR1受体拮抗多肽、权利要求2所述的生物活性片段或类似物以及权利要求3所述的衍生物中的一种或多种，作为活性成分；优选地，所述的药物组合物可以含有一种或者是多种药学上可以接受的载体；所述药学上可以接受的载体优选为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂等；所述的药物组合物可以进一步制成片剂、粒剂、胶囊、口服液或注射剂等多种形式，各种剂型的药物可以按照药学领域的常规方法制备。

百度查询： 深圳先进技术研究院 一种GPR1拮抗多肽及其衍生物与应用

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