申请/专利权人：上海诗丹德标准技术服务有限公司

申请日：2017-09-21

公开（公告）日：2020-12-01

公开（公告）号：CN107522759B

主分类号：C07H15/256(20060101)

分类号：C07H15/256(20060101);C07H1/08(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2020.12.01#授权;2018.01.26#实质审查的生效;2017.12.29#公开

摘要：本发明提供了一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法，还涉及由该制备方法制得的一种羧基苍术苷三钾盐对照品。该制备方法主要包括以下步骤：制得羧基苍术苷三钾盐水提物；使用纯水溶解羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱，并使用凝胶柱洗脱剂进行洗脱，分离得到羧基苍术苷三钾盐粗品；使用纯水溶解羧基苍术苷三钾盐粗品，过高压柱，使用高压柱洗脱剂进行洗脱，分离得到目标组分，合并；将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品。因此，本发明所述的羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法操作简单、分离效率高、工艺稳定、成本低廉、产品纯度高，适于工业化生产。

主权项：1.一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：首先，将苍耳子药材和水混合，在常温下冷浸提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液；然后，将体积为第一浓缩液体积的3～4倍的甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩以制得第二浓缩液；接着，将体积为第二浓缩液体积的1～2倍的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体；最后，使用MCI柱分离盐析后的固体，其中采用甲醇-水作为洗脱剂，梯度洗脱，收集洗脱液后，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物；S2：使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱，并使用凝胶柱洗脱剂进行洗脱，分离得到羧基苍术苷三钾盐粗品；S3：使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐粗品，然后过高压柱，并使用高压柱洗脱剂进行洗脱，分离得到目标组分，合并，备用；S4：将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品；其中，步骤S1中，所述MCI柱为常压玻璃柱，其填料为聚苯乙烯合成树脂，并且填料粒径为75～150μm。

全文数据：一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法及其产品技术领域[0001]本发明涉及化学对照品制备技术领域，具体涉及一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法，还涉及由该制备方法制得的一种羧基苍术苷三钾盐对照品。背景技术[0002]苍耳子为菊科植物苍耳XanthiumsibiricumPatr·的干燥成熟带总荀的果实。味辛、苦、温，有毒，归肺经。苍耳子有散风寒、通鼻窍、祛风湿的功效，主要用于风寒头痛，鼻渊流涕，鼻渊，风瘆瘙痒，湿痹拘挛等症的治疗，为历代治疗鼻渊头痛的要药。苍耳子属传统记载的确有疗效的有毒中药，临床有因长期、过量、反复使用或者炮制不当或者未经炮制使用而导致中毒，甚至死亡的报道。苍耳子中毒病理特征表现为:动物和人在误食一定量后出现血糖下降，昏迷，严重者出现肾衰竭甚至死亡;慢性中毒多因初服时未出现明显的不良反应而长期服用，结果导致蓄积中毒，引起心肌及肝功能损害。现代化学和毒理研究表明，苍耳子的毒性成分主要为水溶性苷类成分：苍术苷（atractyloside与羧基苍术苷carboxyatractyloside以及其它苷类衍生物等。其中，苍术苷及羧基苍术苷可抑制体内ADPATP对蛋白的转运，并带来严重的血糖下降，从而导致体内代谢紊乱，与苍耳子中毒的表现一致，因此被认为是苍耳子的主要毒性成分。[0003]羧基苍术苷三钾盐是在2015版《中国药典》一部中收载的指标成分，羧基苍术苷三钾盐carboxyatractyloside，分子式为C31H43K3O18S2,结构式如下：[0004][0005]目前，国内关于羧基苍术苷三钾盐对照品的分离纯化文献报道很少，另外，羧基苍术苷三钾盐已在2015版药典中被列为标准，对其需求量越来越大，然而国内市场上目前基本处于空白状态，究其原因主要是因为羧基苍术苷三钾盐不稳定，容易变质，从药材中分离出单体非常困难，因此，如何从苍耳子中分离纯化得到羧基苍术苷三钾盐对照品是本领域研发人员当前的研究热点与难点之一。发明内容[0006]针对现有技术中存在的种种技术缺陷，发明人旨在提供一种从苍耳子药材中分离出羧基苍术苷三钾盐的方法，该方法操作简单、分离效率高、工艺稳定、成本低廉、产品纯度高，适于工业化生产。[0007]具体地，本发明第一方面提供了一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法，包括以下步骤：[0008]SI:首先，将苍耳子药材和水混合，在常温下冷浸提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液;然后，将体积为第一浓缩液体积的3〜4倍的甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩以制得第二浓缩液;接着，将体积为第二浓缩液体积的1〜2倍的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体;最后，使用MCI柱分离盐析后的固体，其中采用甲醇-水作为洗脱剂，梯度洗脱，收集洗脱液后，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物；[0009]S2:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱，并使用凝胶柱洗脱剂进行洗脱，分离得到羧基苍术苷三钾盐粗品；其中，所述羧基苍术苷三钾盐粗品的纯度^90%；[0010]S3:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐粗品，然后过高压柱，并使用高压柱洗脱剂进行洗脱，分离得到目标组分，合并，备用；[0011]S4:将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品。[0012]优选地，在上述制备方法的步骤Sl中，所述MCI柱为常压玻璃柱，其填料为聚苯乙烯合成树脂，并且填料粒径为75〜150μπι。[0013]优选地，在上述制备方法的步骤SI中，作为所述洗脱剂的甲醇-水的体积比为0:1〜1:1，并且，所述洗脱剂的流速为50〜70mlmin。[0014]优选地，在上述制备方法的步骤SI中，所述水与所述苍耳子药材的体积质量比为5〜8Lkg〇[0015]优选地，在上述制备方法的步骤S2中，所述凝胶柱的填料为羟丙基葡聚糖凝胶。[0016]优选地，在上述制备方法的步骤S2中，所述凝胶柱洗脱剂为纯水。[0017]进一步优选地，在上述制备方法中，所述纯水的电导率[0018]优选地，在上述制备方法的步骤S3中，所述高压柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，并且填料粒径为IOym。[0019]优选地，在上述制备方法的步骤S3中，所述高压柱洗脱剂为4%的乙腈水溶液，并且，所述高压柱洗脱剂的流速为7〇mlmin。[0020]同时，本发明的第二方面提供了一种羧基苍术苷三钾盐对照品，所述羧基苍术苷三钾盐对照品由本发明第一方面所述的制备方法制得，并且所述羧基苍术苷三钾盐对照品的纯度彡99.4%。[0021]优选地，所述羧基苍术苷三钾盐对照品的纯度多99.6%;进一步优选地，所述羧基苍术苷三钾盐对照品的纯度[0022]综上所述，本发明所提供的羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法巧妙地利用了水提醇沉法，并结合盐析工艺富集目标产物，总体耗时短，操作简单;溶剂消耗少，制备方法过程中的溶剂均可回收再利用;并且，所用的溶剂为甲醇、乙腈、纯水等，环境污染极小;此外，本发明所述的羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法具有较高的学术价值，实现了国内首次分离高纯度对照品级别的羧基苍术苷三钾盐。具体地，按照该制备方法制得的羧基苍术苷三钾盐的纯度达到99.4%以上，可为中国食品药品检定研究院收录，供做对照品使用。附图说明[0023]图1为本发明实施例1中制得的羧基苍术苷三钾盐对照品的HPLC图谱。具体实施方式[0024]下面结合具体实施方式对本发明作进一步阐述，但本发明并不限于以下实施方式。[0025]发明人经过深入地研究，研发出一种高纯度羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法，该制备方法先后利用了水提醇沉法，并结合盐析工艺与分子筛作用原理实现了目标产物的快速富集，显著提高了羧基苍术苷三钾盐的纯度。[0026]根据第一方面的一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法，包括以下步骤：[0027]SI:首先，将苍耳子药材和水混合，在常温下冷浸提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液;然后，将体积为第一浓缩液体积的3〜4倍的甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩以制得第二浓缩液;接着，将体积为第二浓缩液体积的1〜2倍的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体;最后，使用MCI柱分离盐析后的固体，其中采用甲醇-水作为洗脱剂，梯度洗脱，收集洗脱液后，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物；S2:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱，并使用凝胶柱洗脱剂进行洗脱，分离得到羧基苍术苷三钾盐粗品；S3:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐粗品，然后过高压柱，并使用高压柱洗脱剂进行洗脱，分离得到目标组分，合并，备用;S4:将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品。[0028]在一个优选实施例中，步骤Sl中，所述MCI柱为常压玻璃柱，其填料为聚苯乙烯合成树脂，并且填料粒径为75〜150μπι。[0029]在一个优选实施例中，步骤SI中，作为所述洗脱剂的甲醇-水的体积比为0:1〜1:1，并且，所述洗脱剂的流速为50〜70mlmin。[0030]在一个优选实施例中，步骤SI中，所述水与所述苍耳子药材的体积质量比为5〜8Lkg〇[0031]在一个优选实施例中，步骤S2中，所述凝胶柱的填料为羟丙基葡聚糖凝胶。[0032]在一个优选实施例中，步骤S2中，所述凝胶柱洗脱剂为纯水。[0033]在一个进一步优选的实施例中，所述纯水的电导率[0034]在一个优选实施例中，步骤S3中，所述高压柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，并且填料粒径为1〇μπι。[0035]在一个优选实施例中，步骤S3中，所述高压柱洗脱剂为4%的乙腈水溶液，并且，所述高压柱洗脱剂的流速为70mlmin。[0036]根据第二方面的一种羧基苍术苷三钾盐对照品，其由第一方面所述的制备方法制得，并且所述羧基苍术苷三钾盐对照品的纯度[0037]下述各实施例中的操作步骤如无特别说明均为常规操作，其中的试剂、原料如无特别说明均能从公开商业途径获得;除非另有说明，否则本文中的百分比和份数均按重量计算。[0038]在一个优选实施例中，所述羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法包括以下步骤：1原料提取:将苍耳子药材粉碎，按照水与苍耳子药材的体积质量比5〜8Lkg添加水，在常温下冷浸提取至少2次，每次大约2天，抽滤，合并滤液，浓缩至小体积，获得第一浓缩液；2甲醇沉淀除杂:将体积为第一浓缩液体积的3〜4倍的甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩至原体积的110以制得第二浓缩液；（3盐析:将体积为第二浓缩液体积的1〜2倍的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体；（4MCI纯化:将盐析后的固体用纯水溶解后上MCI柱，采用甲醇-水作为洗脱剂，并按0:1〜1:1的体积比由低到高梯度洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物；（5凝胶纯化:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱，并使用纯水进行洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，得到羧基苍术苷三钾盐粗品，纯度多90%;⑹高压柱制备:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐粗品，然后过高压柱，并使用4%的乙腈水溶液进行洗脱，收集目标组分，合并，备用；（7产品回收:将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品，纯度[0039]实施例1[0040]按照以下步骤制备羧基苍术苷三钾盐对照品：[0041]1原料提取:将IOkg苍耳子药材粉碎，添加80L水，在常温下冷浸提取2次，每次2天，抽滤，合并滤液，浓缩至小体积，获得第一浓缩液4000ml;2甲醇沉淀除杂:将12L甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩至1600ml，即制得第二浓缩液；⑶盐析:将1600ml的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体；⑷MCI纯化:将盐析后的固体用200ml纯水溶解后上MCI柱纯水湿法装柱，填料为聚苯乙烯合成树月旨，填料粒径为75〜150μπι，填料总质量400g;上样后，采用甲醇-水作为洗脱剂，并按0:1〜1:1的体积比由低到高梯度洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物13g;5凝胶纯化:使用50ml纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱纯水湿法装柱，填料为羟丙基葡聚糖凝胶，填料总质量500g;上样后，使用纯水进行洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，得到羧基苍术苷三钾盐粗品8g，纯度彡90%;6高压柱制备:使用20ml纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐粗品，滤膜过滤后，过高压柱，使用4%的乙腈水溶液进行洗脱，收集目标组分，合并，备用；（7产品回收:将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品6g，纯度=99.8%，具体HPLC分析结果参见附图1，其中，HPLC检测条件包括:Pheny1-C18，4·6X250mm，5um，203nm，lmlmin;柱温30°C;流动相：乙腈⑻-0·Olmol1磷酸二氢钾缓冲盐㈧，0〜25min。[0042]实施例2[0043]按照以下步骤制备羧基苍术苷三钾盐对照品：[0044]1原料提取:将50kg苍耳子药材粉碎，添加300L水，在常温下冷浸提取2次，每次2天，抽滤，合并滤液，浓缩至小体积，获得第一浓缩液20L;2甲醇沉淀除杂:将60L甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩至8000ml，即制得第二浓缩液；（3盐析:将8000ml的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体；⑷MCI纯化：将盐析后的固体用1000ml纯水溶解后上MCI柱纯水湿法装柱，填料为聚苯乙烯合成树脂，填料粒径为75〜150μπι，填料总质量2000g;上样后，采用甲醇-水作为洗脱剂，并按0:1〜1:1的体积比由低到高梯度洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物65g;5凝胶纯化:使用250ml纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱纯水湿法装柱，填料为羟丙基葡聚糖凝胶，填料总质量2500g;上样后，使用纯水进行洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，得到羧基苍术苷三钾盐粗品40g，纯度彡90%;6高压柱制备:使用IOOml纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐粗品，滤膜过滤后，过高压柱，使用4%的乙腈水溶液进行洗脱，收集目标组分，合并，备用；（7产品回收:将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品30g，纯度=99.9%。[0045]对比例[0046]按照以下步骤制备羧基苍术苷三钾盐：[0047]1原料提取:将20kg苍耳子药材粉碎，添加160L水，在常温下冷浸提取2次，每次2天，抽滤，合并滤液，浓缩至小体积，获得第一浓缩液SOOOmL;2甲醇沉淀除杂:将24L甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩至3200ml，即制得第二浓缩液；⑶盐析:将3200ml的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体；⑷MCI纯化:将盐析后的固体用400ml纯水溶解后上MCI柱纯水湿法装柱，填料为聚苯乙烯合成树月旨，填料粒径为75〜150μπι，填料总质量800g;上样后，采用甲醇-水作为洗脱剂，并按0:1〜1:1的体积比由低到高梯度洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物26g;5中压凝胶纯化:使用IOOml纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过中压凝胶柱填料为十八烷基硅烷键合硅胶，填料粒径为40〜60μπι;上样后，使用甲醇-水作为洗脱剂，并按〇:1〜1:9的体积比由低到高梯度洗脱，HPLC跟踪检测，收集洗脱液，浓缩后冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐Sg，经HPLC分析，其纯度80%。由此可见，采用传统的中压制备工艺时，即在没有结合凝胶纯化与高压柱制备的时候，难以制得高纯度的羧基苍术苷三钾盐对照品。[0048]以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

权利要求：1.一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：Si:首先，将苍耳子药材和水混合，在常温下冷浸提取，固液分离后浓缩液体部分，从而获得第一浓缩液;然后，将体积为第一浓缩液体积的3〜4倍的甲醇加入到第一浓缩液中，进行沉淀，过滤，收集滤液，接着浓缩以制得第二浓缩液;接着，将体积为第二浓缩液体积的1〜2倍的饱和KCl溶液加入到第二浓缩液中，进行盐析，抽滤，收集固体;最后，使用MCI柱分离盐析后的固体，其中采用甲醇-水作为洗脱剂，梯度洗脱，收集洗脱液后，浓缩以制得羧基苍术苷三钾盐水提物；S2:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐水提物，然后过凝胶柱，并使用凝胶柱洗脱剂进行洗脱，分离得到羧基苍术苷三钾盐粗品；S3:使用纯水溶解所述羧基苍术苷三钾盐粗品，然后过高压柱，并使用高压柱洗脱剂进行洗脱，分离得到目标组分，合并，备用；S4:将合并后的目标组分冷冻干燥，即制得羧基苍术苷三钾盐对照品。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤Sl中，所述MCI柱为常压玻璃柱，其填料为聚苯乙烯合成树脂，并且填料粒径为75〜150μπι。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤SI中，作为所述洗脱剂的甲醇-水的体积比为0:1〜1:1，并且，所述洗脱剂的流速为50〜70mlmin。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤SI中，所述水与所述苍耳子药材的体积质量比为5〜8Lkg。5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述凝胶柱的填料为羟丙基葡聚糖凝胶。6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述凝胶柱洗脱剂为纯水。7.根据权利要求1或6所述的制备方法，其特征在于，所述纯水的电导率18.2yScm。8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述高压柱的填料为十八烷基硅烷键合硅胶，并且填料粒径为IOym。9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述高压柱洗脱剂为4%的乙腈水溶液，并且，所述高压柱洗脱剂的流速为70mlmin。10.—种羧基苍术苷三钾盐对照品，其特征在于，所述羧基苍术苷三钾盐对照品由根据权利要求1〜9中任一项所述的制备方法制得，并且所述羧基苍术苷三钾盐对照品的纯度多99.4%〇

百度查询： 上海诗丹德标准技术服务有限公司 一种羧基苍术苷三钾盐对照品的制备方法及其产品

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