申请/专利权人：萨默费尼根有限公司

申请日：2017-01-13

公开（公告）日：2021-01-05

公开（公告）号：CN107064517B

主分类号：G01N33/68(20060101)

分类号：G01N33/68(20060101);G01N30/06(20060101);G01N27/68(20060101)

优先权：["20160114 US 62/278,942"]

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.05#授权;2017.09.12#实质审查的生效;2017.08.18#公开

摘要：本发明揭示离子‑离子反应化学方法的应用，其中使用质子转移反应PTR与较高碰撞能量解离HCD组合以：1简化引入到质谱仪中的样本的复杂混合物分析，以及2通过移除电荷、减小碰撞横截面并且在若干情况中增强所获得的序列覆盖度来改进用于超过50kDa的大蛋白质的分析的分辨率和敏感度。

主权项：1.一种用于识别液体样本内的蛋白质或多肽分析物化合物的存在或不存在的方法，所述液体样本包括化合物的混合物，所述混合物包含多种蛋白质化合物或多种多肽化合物或多种蛋白质和多肽化合物，所述方法包括：a从用户或数据文件接收包括具有zp加合质子的所述蛋白质或多肽分析物化合物的分子的离子的质荷比mzp和电荷态zp的值；b在质谱仪的离子源中通过电喷射电离形成所述液体样本的部分的化合物的所述混合物的带正电离子，所述带正电离子包括多个离子物质；c隔离包括包含所接收的mz值的mz范围的所述离子物质的子集；d通过在离子阱中致使离子物质的隔离的第一子集与反应剂化合物的阴离子反应而从离子物质的所述隔离的第一子集产生多个第一代产物离子物质，所述反应剂化合物的阴离子在反应后从包括蛋白质或多肽化合物的质子化分子物质的一或多个离子物质中的每一者提取质子，所述反应执行持续预定持续时间，在此期间，在与具有第二mz的离子的运动频率匹配的频率下将补充振荡电压波形施加到离子阱的电极，所述第二mz对应于具有zp–n加合质子的所述分析物化合物的分子，其中1≤nzp；e隔离包括包含所述第二mz的另一mz范围的所述第一代产物离子物质的子集；f通过致使所述第一代产物离子物质的所述隔离的子集与所述反应剂化合物的额外阴离子反应持续第二预定持续时间而从离子物质的所述隔离的第一子集产生多个第二代产物离子物质；g通过使用经选择以维持所述第二代产物离子物质中的较低电荷态的至少一部分不分段且所述第二代产物离子物质中的较高电荷态解离的HCD碰撞能将所述多个第二代产物离子物质同时分段来产生多个片段离子物质；i使用所述质谱仪的质量分析器产生所述片段离子物质的质谱；以及ii基于所述质谱中一或多个预定片段mz值的存在或不存在识别所述样本内的所述分析物化合物的存在。

全文数据：用于生物分子的基于质谱的表征的方法技术领域[0001]本发明涉及质谱法，并且更确切地说涉及用于通过从蛋白质、多肽和其它生物相关多电荷物质产生的质子转移反应产物离子的质谱法来纯化和分析蛋白质或多肽的复杂混合物的方法以及将这些方法应用于获得用于生物物质的识别和定量所必需的基于序列的信息。背景技术[0002]在最近二十年，质谱法已经在分析从多种不同样本类型导出的蛋白质样本方面取得了极大进展。结合电喷射电离和各种分离技术，可识别和定量单一样本中的数千蛋白质。当今实验室中使用的最常见的方法涉及某一形式的蛋白质提取，继之以所关注的蛋白质样本的蛋白水解分解。类似于胰蛋白酶的蛋白水解酶的使用产生可容易地由多种不同仪器配置分析的肽。被称为“从下到上”蛋白质组研宄的此方法可用于研究活细胞依据其环境的状态。“从下到上”方法的主要优点之一是所产生的肽具有极其类似的生理化学性质，这有助于复杂样本中数千肽的直截了当的分离。结合串连质谱法的任何分离方法可随后用于产生用以识别给定样本中的蛋白质的氨基酸序列信息。尽管此技术是许多实验室中的例程，但当将完整蛋白质还原到其组成肽时存在关于可获得的信息的量的限制。[0003]与“从下到上”蛋白质组研宄相比，“从上到下”蛋白质组研宄指代其中将蛋白质样本完整地引入到质谱仪而无需酶、化学品或其它分解方式的分析方法。从上到下的分析实现完整蛋白质的研究，从而允许直接在蛋白质层级的识别、主要结构确定以及转译后修饰PTM的局部化。从上到下的蛋白质组分析通常包括将完整蛋白质引入到质谱仪的电离源中，使蛋白质离子断裂，且测量如此产生的各种片段的质荷比和丰度。所得分段比肽分段复杂得多，这在无本文教示的方法存在下可能必须要使用具有极高质量准确性和分辨率能力的质谱仪以便以可接受的确定性解译分段图案。所述解译一般包含将观测的分段图案与包含从已知样本产生的经编译实验分段结果的蛋白质序列数据库进行比较，或替代地与理论上预测分段图案进行比较。举例来说，Liu等人《经由四极飞行时间串连质谱仪中的离子阱碰撞引起的解离和离子离子反应对先验未知蛋白质的从上到下的蛋白质识别表征Top-DownProteinIdentificationCharacterizationofaPrioriUnknownProteinsviaIonTrapCollision-InducedDissociationandIonIonReactionsinaQuadrupoleTime-of-FlightTandemMassSpectrometer》，《分析化学Anal.Chem.》，2009，81，1433-1441已经描述对具有多达28kDa的质量的经改质和未改质的未知蛋白质的从上到下的蛋白质识别和表征。[0004]从上到下的分析优于从下到上的分析的优点在于可直接识别蛋白质，而不是如从下到上的分析中肽的情况那样进行推断。另一优点在于可以识别蛋白质的替代形式，例如转译后修饰和拼接变体。然而，从上到下的分析当与从下到上的分析相比时具有的缺点在于许多蛋白质会难以隔离和纯化。因此，不完全分离混合物中的每一蛋白质可在质谱分析后即刻产生多个离子物质，每一物质对应于不同相应质子化程度和不同相应电荷态，且每一此类离子物质可带来多个同位素变体。[0005]依据质谱法MS的细胞裂解物中完整蛋白质的分析过程与若干困难相关联。首先，来自细胞裂解物的蛋白质混合物的电喷射电离ESI可归因于多个蛋白质的存在而产生极其复杂的质谱，每一蛋白质包括其自身的电荷态包络，其中每一电荷态包络为对应于多个电荷态的质谱线的集合，且其中每一电荷态与加合到其它无电荷分子的带正电质子的数目直接相关。因此，多个电荷态包络可在任何给定质荷比mz范围内重叠。在此实例中，具有不同分子量和电荷的多个蛋白质在相同mz值处重叠。MS中的常用技术常常由于离子化组分的MS线的固有峰值重叠以及固有宽量值范围而不足以简化这些谱，其中此些组分可从不关注的小分子到对于相关蛋白质自身的千扰生物分子变动。此些复杂谱内的蛋白质的指定电荷态的隔离通常并不能缓解多个蛋白质峰值重叠的负担，因为特定蛋白质电荷态的离子的隔离将通常产生一或多个额外离子的共隔离。此共隔离使得不仅基于所产生的片段解离蛋白质以试图识别所述蛋白质而且准确地确定所述蛋白质的完整质量和序列覆盖度，都成为一项挑战。[0006]可实施在将样本引入到质谱仪中之前执行的例如液相层析（LC或离子迁移谱IMS等所谓的“前端”分离技术以减小总体复杂性且提供额外主要益处：电离源处电离竞争的减少。不同于从下到上实验中通常分析的蛋白水解肽的混合物，完整蛋白质混合物含有大范围分子量、等电点、疏水性和其它生理化学性质，这些使得以综合方式经由任何单一分离技术分析这些混合物具有挑战性。以上分离方法两者与其自身的益处和缺陷相关联。液相层析往往会需要每样本显著量的时间来分离个别蛋白质，但通常仍具有两个或更多个蛋白质共溶离。增强的分离可比标准化方法到达更远的“技术”点，且增强的分离可取决于当前技术发展水平下的用户技能。后一技术IMS可快速使特定蛋白质和或电荷态与其它分离，但IMS谱至少部分与质谱相关（g卩，“不正交”）。IMS方法还遭受电离竞争，需要广泛优化且通常涉及观察含有所有电荷态的完全质谱的动态条件。[0007]质子转移反应-己经在用于复杂混合物的快速分离的生物应用中广泛使用的离子-离子反应类型，解决了许多这些上文提及的问题。以实验方式，通过致使来自样本的多带正电的蛋白质离子与所引入的单电荷反应剂阴离子反应以便减少多电荷蛋白质离子的电荷来实现质子转移。当阴离子大量超过蛋白质阳离子群体而存在时，这些反应以伪一级反应动力学继续。反应的速率与蛋白质离子或其它多电荷阳离子的电荷的平方乘以阴离子上的电荷成正比。相同关系也适用于相反极性的反应。这产生一系列伪一级连续反应曲线，如由起始的多电荷蛋白质离子群体界定。尽管所述反应极度发热超过100千卡摩尔），但质子转移是在存在1毫托背景气体（即，氦气）的情况下执行的均匀电子过程，且因此并不对起始的多电荷蛋白质离子群体分段。碰撞气体用以在微秒时间尺度（1〇8碰撞每秒上移除过量能量，因此防止所得产物离子群体的分段。[0008]质子转移反应PTR己经成功地用以识别蛋白质混合物中的个别蛋白质。此混合物简化过程己用于确定高质量蛋白质的电荷态和分子量。PTR也己经用于简化从多电荷前驱体蛋白质离子的碰撞激活导出的产物离子谱。虽然PTR减少了从多电荷蛋白质离子导出的总体信号，但这由所得PTR产物离子的信噪比的显著增益更多地补偿。PTR过程是100%高效的，其产生仅单一系列的反应产物，且不产生需要特殊解译和数据分析的副反应产品。[0009]尽管所述反应极度发热（超过100千卡摩尔），但质子转移是在存在1毫托背景气体（g卩，氦气）的情况下执行的均匀电子过程，且因此并不对起始的多电荷蛋白质离子群体分段。McLuckey等人，《分析化学Anal•Chem.》，1998，70:1198-1202;Stephenson等人，《美国质谱学会期刊（J•Am•Soc•MassSpectrom•》，1998，8:637-644;Stephenson等人，《美国化学学会期刊（J.Am.Chem.Soc.》，1996,118:7390-7397;McLuckey等人，《分析化学Anal.Chem.》，1995，67:2493-2497;Stephenson等人，《分析化学（Anal.Chem.》，1996，68:4026_4032;Stephenson等人，《美国质谱学会期刊J.Am.Soc.MassSpectrom.》，1998，9:585-596;Stephenson等人，《质谱学期刊（J•MassSpectrom.》，1998，33:664-672;Stephenson等人，《分析化学Anal.Chem.》，1998,70:3533-3544;以及Scalf等人，《分析化学Anal.Chem.》，2000，72:52-60。一般离子离子化学方法的各种方面己经在McLuckey和Stephenson的《质谱学回顾（MassSpecReviews》，1998,17,369_407以及在发明人McLuckey等人的名义下的第7,550,5718B2号美国专利中描述。用于执行PTR且用于减少质谱仪中的离子电荷态的设备已经在以下各者中描述：在发明人Chen等人的名义下的第20110114835A1号美国预授权公开案，在发明人Brown等人的名义下的第20110189788A1号美国预授权公开案，在发明人Brown等人的名义下的第8，5283，5626B2号美国专利，以及在发明人Frey等人的名义下的第7,5518,5108B2号美国专利。PTR电荷缩减技术对生物的检测和识别的适配已由McLuckey等人描述《用于生物的检测和识别的电喷射离子阱质谱法（ElectrosprayIonTrapMassSpectrometryfortheDetectionandIdentificationofOrganisms》，生物质谱法的首次联合服务研讨会会刊，巴尔的摩，马里兰州，1997年7月28-30日，127-132。[0010]由PTR过程产生的产物离子可通过使用被称为“离子停车”的技术积聚到一个或若干电荷态中。离子停车在反应周期期间使用补充AC电压在特定mz值下将由任何给定蛋白质分子的原始不同地质子化离子形成的PTR产物离子固结为特定电荷态。此技术可用以将产物离子信号集中到单个或有限数目的电荷态中（且因此集中到单个或几个相应质荷比[mz]值中）以用于较高灵敏度检测或者使用碰撞激活、ETD或其它离子操纵技术的进一步操纵。离子停车的各种方面已经在发明人LeBlanc的名义下的第8,5440,5962B2号美国专利以及以下文献中描述:McLuckey等人，《分析化学Anal.Chem.》，2002，74，336-346;Reid等人，《美国化学学会期刊（J•Am.Chem.Soc•》，2002，124:7353-7362;He等人，《分析化学Anal.Chem.》，2002,74:4653-4661;Xia等人，《美国质谱学会期刊（J.Am.Soc.MassSpectrom.》，2005，16:71-81;Chrisman等人，《分析化学（Anal•Chem.》，2005，77:3411-3414;以及Chrisman等人，《分析化学Anal•Chem.》，2006，78:310-316。与依据MS的细胞裂解物中蛋白质的质谱分析相关联的另一困难是，针对蛋白质的每一电荷态的分段行为在解离事件之前通常未知。确切地说，包括一些电荷态的离子可解离阱，而包括其它电荷态的离子可不充分地解离。特定电荷态的离子的隔离和解离因此并不保证有效解离或解离为一组诊断片段。[0012]与完整蛋白质分析相关联的第三挑战是，针对通常超过50kDa的高分子量蛋白质产生的电荷态的广泛分布。此处，起始信号可划分成超过30+电荷态，从而使任何给定电荷态的串连质谱法产生具有低信噪比的谱。产生用于蛋白质识别的足够序列覆盖度的能力可因此对于单一串连质谱来说较困难。[0013]多种离子激活分段技术可用于产生关于完整蛋白质的结构信息。被称为碰撞诱导解离CID的最常使用的方法涉及多电荷前驱体离子的隔离群体与中性背景气体的碰撞。最常，多电荷前驱体离子使用所界定离子群体的运动的基频加速以便与中性背景气体碰撞从而产生单分子解离事件。此过程导致沿着蛋白质的氨基主链的分段，因此产生氨基酸序列信息。可以被称为HCD或高能量碰撞诱导解离的较高碰撞能量过程获得蛋白质的较广泛分段。很多时候，此涉及碰撞池内部的多个分段事件，因此产生较广泛序列覆盖度。用于经由离子激活产生蛋白质序列覆盖度的另一方法是光致解离PD，其中经界定波长的光子用于激发所关注的离子。所采用的两个常见类型包含超紫UV-PD和红外多光子解离IRMPD。后者是高能量过程，其中离子中能量沉积的速率远超出解离过程的速率。此处，可沿着蛋白质主链中的任一点产生分段，或也可产生氨基酸侧链分段。对于IRMPD，此是能量低得多的过程，其表征为存在氨基键处的裂解，以及来自照射期间产生的完整蛋白质和片段离子的氨和水的损失。IRMPD实验的时间帧也可扩展以产生较广泛分段。使用电子转移反应剂离子的离子-离子反应也可采用作为用于完整蛋白质的分段方法。此处，从多电荷蛋白质到单电荷阴离子的电子转移事件产生蛋白质的主链分段，任何翻译后修饰仍完整。[0014]结合在一起，用于串连质谱法的这些离子激活方法产生可提供蛋白质序列信息的许多不同互补形式的分段。理想地，这些方法可以宽带方式应用以便增加蛋白质的序列覆盖度且提供关于单一氨基酸突变的修改、拼接变型和表达式的额外信息。这些方法以宽带格式（即，覆盖相同完整蛋白质的多个电荷态的应用将提供蛋白质表征和识别的较综合视图。发明内容[0015]本发明教示质谱方法，其采用质子转移反应PTR结合离子停车技术继之以较高碰撞能量解离HCD以便产生宽mz带激活和分段。既定结果提供具有增强的谱信息的简化谱分析。本发明教示组合使用PTR和HCD技术的定向、数据相依和数据独立质谱分析的方法。[0016]本文中所揭示的方法并入有以协同方式来自PTR和HCD两者的益处。在从天然样本产生的复杂质谱的分析期间，可选择隔离窗口，且隔离窗口优选地结合离子停车技术经受PTR，使得前驱体离子电荷缩减到预设的mz范围。可存在于所选择的隔离窗口中的任何共隔离的低电荷态离子将很可能不下降到新电荷态mz范围中。此程序可从污染物或低电荷离子过滤蛋白质，从而有效地纯化所要蛋白质离子。遵循PTR和离子停车，可实施第二PTR事件以从单一经纯化蛋白质电荷态到多个较小较低）电荷态再分布信号。自初始隔离提取的蛋白质的新形成的电荷态包络接着可经受HCD。HCD碰撞能量可经选择使得较高电荷态被解离，同时较低电荷态维持完整（g卩，不分段蛋白质离子mz值的至少一部分，使得分子态离子的完整质量可容易识别，且使得过分分段已经形成的片段的进一步分段得以防止或显著减小。[0017]以实验方式，可通过致使来自样本的多正电荷蛋白质离子（g卩，蛋白质阳离子与单电荷反应剂阴离子反应以便减少个别蛋白质阳离子的电荷态以及蛋白质阳离子的此些电荷态的数目来执行质子转移。当反应剂阴离子大量超过蛋白质阳离子群体而存在时，这些反应以伪一级反应动力学继续。反应的速率与蛋白质离子或其它多电荷阳离子的电荷的平方乘以反应剂阴离子上的电荷成正比。因此，较高电荷蛋白质与较低电荷态相比将以更快速率反应。这些反应的结果为各种多质子蛋白质的电荷态z的缩减，从而导致mz比的增加。此过程可通过将蛋白质离子的先前隔离的子群体的mz范围扩展到经扩展mz范围而导致谱复杂性的减小。较低电荷小分子污染物的mz比较慢地增加或完全不增加，从而导致蛋白质分子的谱签名的分离和纯化。[0018]PTR过程是100%高效的，其产生仅单一系列的反应产物，且不产生需要特殊解译和数据分析的副反应产品。尽管PTR反应极度发热超过100千卡摩尔），但质子转移是在存在1毫托背景气体即，氦气的情况下执行的均匀电子过程，且因此并不对起始的多电荷蛋白质阳离子群体分段。碰撞气体用以在微秒时间尺度（1〇8碰撞每秒上移除过量能量，因此防止所得产物离子群体的分段。此技术可结合数据相依或数据独立方法使用。[0019]在根据本发明教示的复杂谱的质谱分析期间，可通过使来自指定mz窗口的离子经历电荷缩减反应继之以进一步串连质谱事件或质量分析来实施PTR。此事件序列由于使用指定mz窗口的定向方法而可被认为是数据相依方法的一部分。或者，可通过将离子隔禺在设定宽度的邻近和连续mz窗口内，使如此隔离的离子经历PTR且对如此形成的PTR反应产物执行串连质谱事件或质量分析来实施数据独立方法。[0020]上文描述的相同关系对于相反极性PTR反应同样成立，相反极性PTR反应在此处界定为单电荷反应剂阳离子与从蛋白质样本导出的多电荷阴离子的群体之间的反应。PTR对肽、多肽和蛋白质的分析的应用的各种方面已经在以下文献中描述:在发明人Hunt等人的名义下的第7,749,769B2号美国专利、在发明人Hartmer等人的名义下的第20120156707A1号美国专利预授权公开案、在发明人Zabrouskov的名义下的第20120205531A1号美国预授权公开案;McLuckey等人的《离子离子质子转移动力学：用于从蛋白质混合物的电喷射导出的离子的分析的暗示（I〇nIonProton-TransferKinetics:ImplicationsforAnalysisofIonsDerivedfromElectrosprayofProteinMixtures》，《分析化学Anal.Chem.》，1998,70,1198_1202;Stephenson等人的《涉及非共价交互的生物离子的离子-离子质子转移反应：全肌红蛋白（Ion-ionProtonTransferReactionsofBio-ionsInvolvingNoncovalentInteractions:Holomyoglobin》，《美国质谱学会期刊J.Am.Soc.MassSpectrom.》，1998，8,637-644;Stephenson等人的《气相中的离子离子反应:涉及多电荷蛋白质的质子转移反应（IonIonReactionsintheGasPhase:ProtonTransferReactionsInvolvingMultiply-ChargedProteins》，《美国化学学会期刊J.Am.Chem.Soc.》，1996,118,7390-7397;McLuckey等人的《用于电喷射质谱法中改进的有效质量分辨率的离子分子反应（I〇nMoleculeReactionsforImprovedEffectiveMassResolutioninElectrosprayMassSpectrometry》，《分析化学（Anal.Chem.》，1995，67，2493-2497;Stephenson等人的《用于蛋白质混合物分析的离子离子质子转移反应（IonIonProtonTransferReactionsforProteinMixtureAnalysis》，《分析化学Anal.Chem.》，l"6，68，4026_4032;Stephenson等人的《用于寡肽混合物分析的离子离子反应：对由0.5-100kDa组分构成的混合物的应用（IonIonReactionsforOligopeptideMixtureAnalysis:ApplicationtoMixturesComprisedof0.5-100kDaComponents》，《美国质谱学会期刊（J.Am.Soc.MassSpectrom.》，1998,9,585-596;Stephenson等人的《用于通过电喷射质谱法的高质量物质和混合物组分的改进质量确定的电荷操纵（ChargeManipulationforImprovedMassDeterminationofHigh-massSpeciesandMixtureComponentsbyElectrosprayMassSpectrometry》，《质谱学期刊J.MassSpectrom.》，998,33,664-672;Stephenson等人的《经由离子离子化学方法从多电荷母代离子导出的产物_子谱的简化SimplificationofProductIonSpectraDerivedfromMultiplyChargedParentIonsviaIonIonChemistry》，《分析化学Anal.Chem.》，1998，70，3533-3544，以及Scalf等人的《电荷缩减电喷射质谱法（ChargeReductionElectrosprayMassSpectrometry》，《分析化学（Anal.Chem.》，2000,72,52-60。一般离子离子化学方法的各种方面已经在McLuckey等人的《高质量多电荷离子的离子离子化学方法（IonIonChemistryofHigh-MassMultiplyChargedIons》，《质谱学回顾MassSpectrom.Rev.》，1"8,17,369_407以及在发明人McLuckey等人的名义下的第7,550,718B2号美国专利中描述。用于执行PTR且用于减少质谱仪中的离子电荷态的设备已经在以下各者中描述:在发明人Chen等人的名义下的第20110114835A1号美国预授权公开案，在发明人Brown等人的名义下的第20110189788A1号美国预授权公开案，在发明人Brown等人的名义下的第8,283,626B2号美国专利，以及在发明人Frey等人的名义下的第7,518，108B2号美国专利。PTR电荷缩减技术对生物的检测和识别的适配已由McLuckey等人描述《用于生物的检测和识别的电喷射离子讲质谱法ElectrosprayIonTrapMassSpectrometryfortheDetectionandIdentificationofOrganisms》，生物质谱法的首次联合服务研讨会会刊，巴尔的摩，马里兰州，1997年7月28-30日，127-132。[0021]质子转移反应由于其热力学有利程度而快速进行。例如PTR等中和和电荷缩减反应在能量上几乎是完全有利的。因此，给定所述机会，PTR反应过程完成将致使极度带电前驱体离子经由连续电荷缩减反应继续减少其电荷，直至其被中和且借此从质谱丢失）。此现象的不太极端的可能性是，单一初始电荷态的离子子群体将在PTR之后在若干较低电荷态上再分布，借此以略微不合需要的方式有效地衰减所述分子态离子的信号。[0022]为减小或消除此谱衰减，可结合PTR反应过程使用被称为“离子停车”的补充技术来抑制或大大减小进行中和反应特定电荷态的反应速率。离子停车使用施加到围封离子阱设备的电极的补充或辅助振荡AC电压。辅助AC电压通常具有相对低的振幅约1伏），且施加为针对维持离子在阱内的包含的主射频RF截留电压波形的补充。如本文献中参考离子停车期间施加的振荡谐振激励电压所使用，术语“频率”并不指代施加仅单一频率振荡，而是实际上指代共同具有带宽的同时施加的频率的频带（g卩，频带的中央频率。类似地，如本文参考离子停车所使用，“波形”指代同时施加各种频带宽度的此些频带中的两者或两者以上。注意上文的定义，选择振荡辅助电压波形的频率以便选择性地匹配阱内的特定质荷比mz的离子的运动频率其又由主捕获场振幅和mz比确定。辅助波形的施加因此选择性地以谐振方式激发具有特定mz比率的离子的运动。阱内的运动以此方式谐振地激发的离子经受减缓的反应动力或通常被禁止进行PTR反应过程期间的进一步电荷缩减。离子停车程序可因此在反应周期期间在特定质荷比mz值下将由任何给定蛋白质分子的原始不同地质子化离子形成的PTR产物离子固结为特定电荷态。此技术可用以将产物离子信号集中或“停放”）到单个或有限数目的电荷态中且因此集中到单个或几个相应mz值中）以用于较高灵敏度检测或者使用碰撞激活、ETD或其它离子操纵技术的进一步操纵。离子停车的各种方面已经在以下各者中描述:在发明人McLuckey的名义下的第7，064,317B2号美国专利；在发明人McLuckey的名义下的第7，355，169B2号美国专利;在发明人McLuckey的名义下的第8,334,5〇3B2号美国专利;在发明人LeBlanc的名义下的第8,440,962B2号美国专利;且在以下文献中描述:McLuckey等人的《在电动离子阱中的离子离子反应期间的离子停车（IonParkingduringIonIonReactionsinElectrodynamicIonTraps》，《分析化学Anal_Chem.》，2002,74,336-346;Reid等人的《来自复杂混合物的完整蛋白质的气相浓度、纯化和识别（Gas-PhaseConcentration，Purification，andIdentificationofWholeProteinsfromComplexMixtures》，《美国化学学会期刊（J.Am.Chem.Soc.》，2002，124,7353_7362;He等人的《在单个气相纯化和浓度程序之后多个蛋白质离子电荷态的解离（DissociationofMultipleProteinIonChargeStatesFollowingaSingleGas-PhasePurificationandConcentrationProcedure》，《分析化学（Anal_Chem.》，2002,74,4653-4061;Xia等人的《混合线性离子阱中的相互存储模式离子离子反应MutualStorageModeIonIonReactionsinaHybridLinearIonTrap》，《美国质谱学会期刊（J.Am.Soc.MassSpectrom.》，2005，16,71-81;Chrisman等人的《并行离子停车:改善电子转移解尚中的母代到第一代产物的转换ParallelIonParking:ImprovingConversionofParentstoFirst-GenerationProductsinElectronTransferDissociation》，《分析化学（Anal•Chem.》，2005，7710，3411-3414，以及Chrisman等人的《蛋白质混合物的并行尚子停车ParallelIonParkingofProteinMixtures》，《分析化学Anal.Chem.》，2006,78,310-316。[0023]所述文献中还论述的被称为“并行离子停车”的技术是离子停车的扩展。离子停车与并行离子停车之间的差异是，在后者中，宽mz范围（相对于仅涵盖所关注蛋白质的一个电荷态的狭窄界定的范围）内的离子经受谐振激发。因此，PTR反应产物的mz比停放在对应于所述宽范围内的一个以上电荷态的多个值处。尽管文献中存在并行停车的多种所描述的实施方案，所述技术始终涉及期望停放的离子的谐振激发线性离子阱中径向，四极离子阱中轴向）。有可能创建谐振激发波形，其通过定制唯一波形继之以傅里叶逆变换技术或通过简单地同时叠加多个单一频率波形而允许预定mz范围内PTR反应产物离子的停放。在每一情况下，净结果为使前驱体离子经受PTR以便致使大多数离子再分布在三到五个电荷态上。[0024]根据依据本发明教示的各种方法，从PTR反应（如上文所描述产生的离子可经受由较高能量解离HCD技术进行的分段。HCD技术是诊断上强大的程序，其用于有力地激发或激活分段的预备给定mz范围内的所有离子，通常被称作宽带激活。在此方法中，离子可不仅到达用于键断裂的最小阈值，而且具有施加到其的额外能量以到达较高能量解离阈值。此通常在存在电位差的情况下经由离子的轴向加速度实施。施加在每一离子上的力为所述离子的电荷z与轴向离子路径中两个透镜元件之间的电位差的乘积。因为此关系，当涵盖相同分子态离子的电荷态分布的离子经受HCD时，包括较高z的那些离子将比具有较低z的那些离子经受更大的力，使得较高z离子可潜在地经由较高能量路径解离。相反，较低z离子可保持部分完整，从而提供用于离子的分子量的直接信息。[0025]已发现，在类似激活条件下，具有不同电荷态的蛋白质可彼此不同地解离。因此，用于解离的单一电荷态的常规选择归因于未知分段效率而承载较差解离的固有风险。相比之下，根据本发明教示的方法有利地组合PTR和HCD程序使得从单一蛋白质分子导出且包括状态包络的离子被分段。发明人发现，组合PTR和HCD程序的使用能够提供广泛序列信息，借此最小化从单一电荷态的较差解离的风险，同时还潜在地维持关于蛋白质的完整质量的信息，借此增强正确地识别所述蛋白质的概率。本文教示的新颖MS分析方法的益处是，所要蛋白质经由PTR有效地纯化且随后以一方式解离使得所获得的信息内谷比原本将从蛋白质的单一电荷态的解离搜集的信息广泛。最后，可在准确质量分析器例如Orbitrap™质量分析器中的质量分析之后产生高分辨率、高质量准确性质谱。[0026]发明人发现，组合PTR和HCD程序的使用能够提供广泛序列信息，借此最小化从单一电荷态的较差解离的风险，同时还潜在地维持关于蛋白质的完整质量的信息，借此增强正确地识别所述蛋白质的概率。发明人己经发现出人意料的结果，所述结果与上文提到的各种有利因素结合在一起可实现从自然微生物样本导出的极复杂混合物中准确识别多个完整蛋白质或大的肽。此识别可在物质、亚种或甚至菌株层级上实现微生物识别。目标蛋白质或多肽离子单物质或多物质可经选择以便基于先验知识或信息个别地或组合地指示特定微生物或细胞类型或者微生物或细胞类型的特定菌株或变体或者给定毒性因数或毒素在样本中的存在，或者指示微生物或细胞抵抗抗菌剂化合物或抗生素药品的能力。[0027]本发明在一个方面中提供对传统的从下到上蛋白质组研宄方法的替代，即经由方法对从微生物细胞导出的完整蛋白质的从上到下分析，所述方法适用于大体上所有微生物，包含革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、霉浆菌、酵母、原生动物、丝状即，微观真菌。本发明可帮助提供复杂混合物中的蛋白质识别，这又可帮助甚至在含有微生物的混合物和或直接来自纯的和或混合培养基及来自直接样本例如，表面棉签、体液等分析的微生物的样本中在种属、物质、亚种、菌株致病变型和血清变型层级对微生物的识别。另外，本文教示的方法可用于毒性因数、抗生素抗性和易感性标记或其它特性的目标检测。本发明教示的从上到下方法是简单且快速的，因为不需要样本的化学或酶分解且实时地实现数据处理。[0028]根据本发明教示的方法可包括以下步骤中的至少一或多个:微生物细胞中断，蛋白质的溶解，样本净化脱盐、移除不可溶组分和残渣，和或聚集），样本灌注或流动注入，快速部分液体层析分离，标准层析分离，等电点聚焦，溶液中蛋白质的电离，离子的给定mz范围的隔离，致使离子的隔离范围经受PTR以便形成第一代PTR产物离子，第一代PTR产物离子的mz范围的任选隔离，MS或MSMS模式中的任选质谱法，任选地致使第一代PTR产物离子的隔离范围经受第二PTR反应以便形成第二代PTR产物离子，MS或MSMS模式中的质谱法，以及经由分子量和或蛋白质序列分析的蛋白质识别，或使用任何统计分类方法。优选但不一定地，以高分辨率、高准确性质谱仪执行质谱法步骤，例如包括Orbitrap™质量分析器的质谱仪。附图说明[0029]为进一步阐明本发明的以上和其它优点及特征，将参照附图中说明的其特定实施例呈现本发明的更具体描述。应了解，这些图只是描绘了本发明的所说明的实施例，且因此不应当被看作限制了本发明的范围。本发明将以额外特殊性和细节经由使用随附图式进行描述和阐述，附图中：[0030]图1是示意性地说明用于来自至少一个微生物的可溶蛋白质的快速提取和分析以用于识别所述至少一个微生物的系统的框图；[0031]图2是适合于与根据本发明教示的方法结合采用的示范性质谱仪的示意性表示，所述质谱仪包括混合系统，所述混合系统包括四极滤质器、双压力四极离子阱质量分析器和静电阱质量分析器；[0032]图3A为根据本发明教示的第一示范性方法的示意性流程图，所述第一方法针对确定目标蛋白质分析物的存在和或浓度或不存在；[0033]图3B为根据本发明教示的第二示范性方法的示意性流程图，所述第二方法针对样本中一或多个蛋白质的存在和或浓度的数据相依确定；[0034]图3C为根据本发明教示的第三示范性方法的示意性流程图，所述第三方法针对样本中一或多个蛋白质的存在和或浓度的数据独立确定；[0035]图3D为根据本发明教示的第四示范性方法的示意性流程图，所述第四方法针对样本中一或多个蛋白质的存在和或浓度的数据独立确定；[0036]图4A为从含有充足的聚合污染物的泛素的溶液导出的离子的质谱；[0037]图4B为在来自图4A中所描绘的离子群体的mz隔离之后包括电荷态+13的多质子泛素分子的离子的质谱；[0038]图4C为由图4B中所描绘的隔离的群体的反应利用PTR反应剂离子持续50毫秒产生的包括具有电荷态+11或更小的多个多质子泛素分子的离子的质谱；[0039]图4D为通过较高能量碰撞解离技术使用正规化碰撞能量值20从图4C中所描绘的离子群体产生的片段离子的质谱；[0040]图5A为从含有碳酸酐酶与肌红蛋白的混合物的溶液导出的离子的质谱，其还展示样本制备期间产生的血红素单位的离子；[0041]图5B为在2Th宽的隔离窗口（大约808mz内图5A中所描绘的离子群体的mz隔离之后剩余的离子的质谱，所述隔离窗口涵盖具有电荷态+21的多质子肌红蛋白离子；[0042]图5C为利用PTR反应剂离子持续30毫秒的图5B中所描绘的隔离的离子群体的反应产生的离子的说明性质谱，其展现在无离子停车的情况下初始PTR阶段中多个物质的潜在信号增强共隔离的现象；[0043]图5D为在应用离子停车期间利用PTR反应剂离子持续30毫秒继之以大致808Th处的PTR产物离子的隔离的图5B中所描绘的隔离的离子群体的反应产生的具有电荷态+20的主要由经纯化多质子肌红蛋白分子组成的离子的质谱，其展示肌红蛋白质谱签名的有效浓度和隔离；[0044]图5E为如图5D中所描绘的电荷态+2〇的经纯化多质子肌红蛋白分子的更进一步反应产生的离子的群体的质谱，其利用PTR反应剂持续2毫秒以便产生具有一范围的电荷态的多质子肌红蛋白分子；[0045]图5F为通过较高能量碰撞解离技术从图5E中所描绘的离子群体产生的片段离子的质谱；[0046]图6A为从含有添加的肌红蛋白的细菌大肠杆菌的裂解物产生的离子的质谱；[0047]图册为在2Th宽的隔离窗口（大约8〇8mz内图6A中所描绘的离子群体的mz隔离之后剩余的离子的质谱，所述隔离窗口涵盖具有电荷态+21的多质子肌红蛋白离子；[0048]图6C为在不应用离子停车的情况下利用PTR反应剂离子持续30毫秒的图6B中所描绘的隔离的离子群体的反应产生的离子的说明性质谱，其展现在无离子停车的情况下初始PTR阶段中多个物质的潜在信号增强共隔离的现象；[0049]图6D为在应用离子停车期间利用PTR反应剂离子持续30毫秒继之以质量隔离的图6B中所描绘的隔离的离子群体的反应产生的具有电荷态+20的主要由经纯化多质子肌红蛋白分子组成的离子的质谱；[0050]图6E为如图6D中所描绘通过进一步反应从电荷态+20肌红蛋白离子产生的离子的质谱，其在不应用离子停车的情况下利用PTR反应剂持续1毫秒以便产生具有一范围的电荷态的多质子肌红蛋白分子；[0051]图6F为通过较高能量碰撞解离技术使用正规化碰撞能量值20从图6E中所描绘的离子群体产生的片段离子的质谱；以及图6G是为通过较高能量碰撞解离技术从图6D中所描绘的离子群体产生的片段离子的质谱。[0052]图7为质谱线的两个重叠集合的示意性表示，每一集合包括不同相应分析物的电荷态分布。具体实施方式[0053]呈现以下描述以使所属领域的技术人员能够制作并使用本发明，并且在特定应用和其要求的情况下提供以下描述。对于所属领域的技术人员来说，对所描述的实施例的各种修改将易于显而易见的，并且本文中的一般原理可以应用到其它实施例。因此，本发明并不希望限于所示的实施例和实例，而是应被赋予根据权利要求书的最广可能的范围。参照附图1到11结合以下描述，本发明的具体特征和优点将变得更加清楚。[0054]现参看图1，示意性地说明用于从一或多种微生物提取蛋白质、检测所述蛋白质且识别所述一或多种微生物的系统100。系统100包含样本处置装置115、可由样本处置装置115接达的样本110,以及反应剂、缓冲剂及类似物的源120,这些源通过各种管道或其它传输线流体地耦合到样本处置装置115。系统100进一步包含第一以及任选地第二样本纯化装置135例如固相萃取盒），其经配置以用于清洁样本例如，去盐、移除污染物、聚集蛋白质），以及任选的层析柱140,其可经配置以用于通过在质谱分析之前的液相层析而至少部分地纯化样本110。至少一个样本纯化装置135可包括直列式尺寸排阻层析柱，其可用以不仅移除盐而且还移除小分子和脂质。样本11〇、第一和任选的第二样本纯化装置135以及任选的层析柱140与流体处置泵130、各种反应剂、缓冲剂和其它流体120以及质谱仪150成流体连通。[0055]样本处置装置115能够准备含有一或多种微生物的某一范围的样本类型，且将从所述微生物提取的可溶蛋白质部分递送到质谱仪150用于分析。样本110可为疑似含有一或多种微生物的任何类型，包含但不限于来自培养基板的隔离的群落、来自液体生长介质的细胞、血液、血培养基、唾液、尿、粪便、痰液、伤口和身体部位棉签、土壤、食物、饮料、水、空气以及环境表面棉签。[0056]样本处置装置II5可包含细胞中断构件、机器人液体处置构件、离心机、过滤构件、孵育箱、混合构件、真空泵、流体栗以及反应剂120中的一或多者，其可用于微生物的中断以及可溶蛋白质部分的隔离。细菌、真菌、霉浆菌细胞、病毒及类似物的中断可通过机械、化学、酶和其它方式实现，如此项技术中通常已知。机械方法包含打珠、例如French压机及类似物的压力的使用、超声处理或此项技术中已知的其它方法。化学方法包含暴露于例如尿素、硫脲或胍HC1等离液剂以使微生物细胞裂解且溶解其内含物。替代地，有机酸溶剂混合物可用来破坏细胞。酶方法包含使用溶菌酶、溶葡球菌酶或其它裂解酶类以在细菌细胞壁中形成“?L”，其允许内含物渗出到周围溶液中。[0057]如图1中所说明，系统100进一步包含任选的控制单元160,其可通过联动装置170a-170d链接到系统100的各种组件。举例来说，控制单元160可链接到样本110以控制样本施加，链接到反应剂120以控制各种反应剂的施加，链接到泵130以控制流体处置、流动速率等，链接到样本处置装置115以控制样本准备，且链接到质谱仪150以控制质谱法参数。在所说明的实施例中，控制单元160也可充当数据处理单元以例如处理来自质谱仪150的数据，或将数据转发到服务器以用于处理和存储（图1中未图示服务器）。控制单元160也可实时确定PTR产物离子的任何产生的分子量和电荷态以用于MSMS、MSn或分子量确定。控制单元160也可用以将结果自动转发到医疗保健专业人士。[0058]在一些实施例中，系统100经设计以由临床医生或一般实验室技术员使用，其不一定在样本准备、LC-MS操作、LC-MS方法开发及类似等所有方面中都有专业技能。因此，控制单元160可经设计以通过为用户提供简化应用程序接口而囊封数据系统环境，所述应用程序接口可用以起始且监视测定样本110的基本上所有方面而不需要用户与系统100的总体硬件和控制系统交互。控制单元160因此经配置以提供用户与控制着装置、数据文件和用于将数据转换为用户可读形式的算法的底层服务之间的分离程度。即，控制单元160使得用户不需要知道或控制硬件以用于分析临床样本，且提供简化接口以从质谱仪发送和接收信肩、。[0059]控制单元160可经配置以内部地监视每一样本分析请求，且能够通过系统100始终跟踪分析请求。一旦系统100正在获取或已经获取样本110的数据，则控制单元160可经配置以基于由用户选择的测定类型而自动开始后处理数据。最重要的是，控制单元160可经配置以在获取过程期间实时处理数据。此处实时地将结果返回到用户，其包含微生物识别、毒性和抗性表征、菌株匹配信息，以及关于抗生素易感性测试的数据。此外，控制单元160可经配置以基于由用户选择的测定类型而自动选择后处理参数，从而一旦测定已选定且开始用于分析则进一步减少用户与系统交互的需要。控制单元160可被设计为配合于系统100与用户之间的层，以减少设置样本测定以用于获取所需的复杂性。控制系统160还可经配置以仅将最相关数据返回到用户以避免用户接收太多的额外信息。[0060]在一个实施例中，系统100可进一步包含可操作地耦合到样本处置装置115或与其集成的样本检测装置未图示）。所述样本检测装置可与样本处置装置115—起工作或独立于样本处置装置115而执行以下功能中的至少一者：i.识别进入系统的样本；ii.识别用于进入系统的样本的测定类型；iii.基于预期测定类型和或所关注的分析物而选择测定协议；iv.引导样本处置装置和或控制系统以起始对样本中所关注的分析物的分析;v.引导控制系统基于针对测定类型和或所关注的分析物选定的测定协议而选择一或多种反应剂;vi.引导控制系统基于针对测定类型和或所关注的分析物选定的测定协议而选择液相层析移动相条件，且致使液相层析系统执行测定和或纯化所关注的分析物;vii.引导控制系统基于针对测定类型和或所关注的分析物选定的测定协议而选择质谱仪设定，且致使质谱仪产生与选定测定类型和或所关注的分析物相关联的质谱数据；以及viii.引导控制系统分析与选定测定类型和或所关注的分析物相关联的质谱数据以识别所关注的分析物的存在和或浓度。[0061]样本或经处理样本可在质谱法的分析之前经净化和或纯化。此纯化或样本净化可指代从粗细胞提取物移除盐或脂质的程序，或使所关注的一或多种分析物相对于样本的一或多种其它组分变丰富的程序。其也可指代具有用于处置分枝杆菌或丝状真菌的生物安全三级机构的单独实验室中的样本处理和净化。在此实施例中，样本传送到系统且可如先前所描述进行分析。在一个实施例中，此纯化或样本净化可通过固相萃取装置、直列式尺寸排阻层析和或任选的层析柱140实现。[0062]在一个实施例中，第一和或第二样本纯化装置135可包含固相萃取SPE盒。在一些实施例中，SPE盒可直接与高分辨率高质量准确性质谱仪150成直列式。在一个实施例中，SPE盒可为具有具有小体积的二氧化硅或其它吸附剂的聚丙烯尖端，其含有固定于盒中的键合的C4、Cs或Ci8或其它官能团，例如StageTip™盒ThermoFisherScientific。在替代实施例中，可使用聚合吸附剂或螯合剂。床体积可小达WL或更小，但也可以使用较大体积。所述设备和方法良好地适合于从微生物细胞导出的复杂样本，因为每一SPE盒仅使用一次，从而使从一个样本到另一样本的残留问题最小化。[0063]在一个实施例中，样本纯化装置135可为直列式尺寸排阻层析柱，其经设计以从样本110移除盐、小分子和脂质。所述方法还可用以分离媒介与大分子量蛋白质。将相选择为与部分（即，少于100%有机溶液和有机酸相容。相可适应分子量从1〇3到l〇8Da不同的蛋白质尺寸分布。实时经调流动速率以实现完整蛋白质从小分子的分离，其中分离流动速率通常比用以从系统移除小分子、脂质和盐的较高流动速率小得多。在此实施例中，样本纯化装置135也可以经加热以促进完整蛋白质的较快扩散速率，因此显著缩短运行时间。移动相通过样本纯化装置135的流动也可以在净化过程的一部分期间分流，以从流动的流移除某些杂质且防止其进入质谱仪150。[0064]在一个实施例中，任选的层析柱140可包含经配置以用于样本中的蛋白质的至少部分层析分离的柱。层析柱中的固定相可为多孔或非多孔的二氧化硅或琼脂糖颗粒，或所述柱内部聚合或另外形成的单块材料。所述固定相可涂覆有适当材料，例如Cl8、Cs、C4或另一合适的衍生物，或含有阳离子交换剂或其它材料，或以上的组合以促进蛋白质的分离，且此材料可以化学方式键合到颗粒或在所述柱内为单块的。颗粒大小通常在1.5W11到30um的范围内变化。孔径可以在50到300埃的范围内变化。柱的内径通常在50wn到2.1mm的范围内变化，且柱长度在约〇.5cm到25cm的范围内或以其它方式变化。移动相或溶离剂可为纯溶剂或者两种或更多种溶剂的混合物，且可含有添加的盐、酸和或其它化学改质剂。蛋白质基于一或多个生理化学性质在柱上分离，包含大小、净电荷、疏水性、亲和力或其它生理化学性质。层析分离方法包含离子交换、尺寸排阻、HILIC、疏水性交互、亲和力、正常相或反向相层析法中的一或多者。[0065]纯化样本的额外方法可包含不限于液相层析、HPLC、UHPLC、沉淀、固相萃取、液_液提取、透析、亲和力捕获、电泳、过滤、超过滤或此项技术中已知用于纯化的其它合适的方法。[0066]己经描述涉及在质谱法分析之前使用HPLC用于样本净化的各种方法。所属领域的技术人员可选择适合于在本发明中使用的HPLC仪器和柱。层析柱通常包含媒介（g卩，填充材料以在空间和时间上促进化学部分的分离。所述媒介可包含极小颗粒，其可具有与各种化学部分交互以促进所关注的分析物的分离的键合表面。一个合适的键合表面是疏水性键合表面，例如烷基键合表面。烷基键合表面可包含C4、C8或C18键合烷基。另外，也可以使用现有技术水平中已知的单块和其它相。层析柱包含用于接收样本的入口端口以及用于排放包含部分分离样本的流出物的出口端口。举例来说，测试样本可在入口端口处施加于柱，以溶剂或溶剂混合物溶离，且在出口端口处排放。在另一实例中，多于一个柱可循序地使用或作为二维2D层析法系统，其中测试样本可在入口端口处施加于第一柱，以溶剂或溶剂混合物溶离到第二柱上，且以溶剂或溶剂混合物从所述第二柱溶离到出口端口。可选择不同溶剂模式用于溶离分析物。举例来说，可使用梯度模式、等度模式或多型（即混合模式执行液相层析。[0067]图2是可用作图1的质谱仪150的示范性质谱仪150a的示意性绘图。在图2中说明的质谱仪是混合质谱仪，包括多于一个类型的质量分析器。具体地说，质谱仪150a包含离子阱质量分析器216以及Orbitrap™分析器，其为一类静电阱质量分析器。如下文将描述，由于根据本发明教示的各种分析方法采用多次质量分析数据采集，因此混合质谱仪系统可有利地用以通过同时使用两个或更多个分析器而改善工作循环。Orbitrap™质量分析器212采用图像电荷检测，其中通过由质量分析器的电场内离子的运动在一组电极上感应的图像电流的检测间接检测离子。在广泛使用的数据相依实验方案中，初始“调查”扫描用于识别从液体层析仪LC溶离的所关注特征，且随后，执行可包括串连质谱扫描MSn的若干处于10-50的范围内）“相依”质量扫描以询问调查扫描中识别的前驱体物质。如果所述仪器为混合型，具有一个以上类型的质量分析器，那么可通过使用一个分析器用于调查扫描且另一分析器用于相依MSn扫描来增加工作循环。[0068]在质谱仪150a的操作中，电喷射离子源201提供待分析的样本的离子到撇渣器202的孔隙，在此处离子进入第一真空腔室。在进入之后，由堆叠环离子导向器204将离子捕获且聚焦为密集束。第一离子光学传送组件203a将束传送到下游的质谱仪的高真空区。大多数剩余的中性分子和不合意的高速度离子群集例如溶合离子通过弯曲束导向器206从离子束分离。中性分子和离子群集跟随直线路径，而所关注的离子由曳力场引起弯曲约九十度转弯，从而产生分离。[0069]质谱仪150a的四极滤质器208在其常规意义上用作可调谐的滤质器以便仅在选定窄的mz范围内使离子通过。后续离子光学传送组件203b将经过滤离子递送到弯曲四极离子阱（“C阱”）组件210X阱210能够沿着四极滤质器2〇8与离子阱质量分析器2ie之间的路径传送离子。C阱210也具有临时收集且存储离子群体并且然后将离子作为脉冲或包递送到Orbitrap™质量分析器212中的能力。离子包的传送是通过在C讲210与安置于C讲210和Orbitrap™质量分析器212之间的一组注入电极211之间施加电位差来控制。C阱的曲率经设计以使得离子群体在空间上聚焦以便匹配Orbitrap™质量分析器212的入口孔径的接受角。[0070]多极离子导向器214和光学传送组件203b用来在C阱210与离子阱质量分析器216之间导引离子。多极离子导向器214提供临时离子存储能力以使得在分析方法的第一处理步骤中产生的离子可稍后被取得以用于后续步骤中的处理。多极离子导向器214也可充当分段单元。沿着C阱210与离子阱质量分析器216之间的路径的各种栅电极是可控的，以使得离子可在任一方向上传送，这取决于任何特定分析方法中所需的离子处理步骤的序列。[0071]离子阱质量分析器216是双压力线性离子阱（即，二维阱），其包括高压线性阱单元217a和低压线性阱单元217b，所述两个单元定位成邻近于彼此，通过具有小孔隙的板透镜分隔开，所述小孔隙准许所述两个单元之间的离子传送且呈现泵送限制并允许在所述两个阱中维持不同的压力。高压单元217a的环境有利于离子冷却、并且有利于在受控条件下通过碰撞引起的解离或电子转移解离的离子分段，或例如质子转移反应等离子-离子反应。低压单元2l?b的环境有利于以高分辨力和质量准确性进行分析扫描。低压单元包含双倍增极离子检测器215。[0072]^量分析方法内的电子转移解离或质子转移反应的步骤的使用需要在质谱仪内引起受控^子-离子反应的能力。离子-离子反应又需要产生反应剂离子以及致使反应剂离子与样本离子混合的能力。如图2中所描绘的质谱仪150a说明两个替代的反应剂离子来源，第一反应剂离子源299a安置于堆叠环离子导向器204与弯曲束导向器206之间，且第二反应剂离子源29%安置在仪器的相对端，邻近于线性离子阱质量分析器216的低压单元217b。大体上，任何特定系统将至多仅包含一个反应剂离子源。然而，此处为了说明性目的而描绘且论述两个不同反应剂离子源。虽然以下论述是针对用于PTR的反应剂离子源，但类似论述可应用于ETD反应剂离子源。[0073]第一可能的反应剂离子源299a可位于堆叠环离子导向器204与弯曲束导向器206之间。反应剂离子源299a包括辉光放电单元，其包括暴露于反应剂气体导管298a的一对电极阳极和阴极），所述反应剂气体导管从具有使反应剂化合物挥发的加热器的反应剂液体或固体储集器297a递送反应剂气体。当跨电极施加高电压时，起始辉光放电，其使在电极之间流动的反应剂电离。来自辉光放电源的反应剂阴离子被引入到在四极滤质器208前方的离子光学元件路径，在其内它们可进行mz选择。反应剂离子接着可在多极离子导向器214中积聚，且随后传送到双压力线性离子阱216的高压单元217b中，在其内使得它们可用于PTR反应。反应广物可直接传送到低压力单元217a或Orbitrap™质量分析器212用于mz分析。[0074]可能的替代反应剂离子源299a可邻近于低压力线性阱单元217b定位，在此其可包括额外高真空腔室2吧，反应剂离子可以从所述高真空腔室通过腔室292与高压单元之间的孔隙而引导到高压力单元21几中。在操作中，气态反应剂化合物从具有使反应剂化合物挥发的加热器的反应剂液体或固体储集器297b供应，且被引导通过反应剂气体导管298b，所述反应剂气体导管将反应剂气体递送到部分地被限制的离子产生体积296中。在操作中，从电加热长丝294供应的热离子电子通过在长丝294与加速器电极未图示）之间施加电位而以某一预定能量引导到尚子广生体积296中。供应的高能电子造成反应剂气体的电离以便产生反应剂离子。反应剂离子接着可在栅电极未图示）的操作下由离子光学传送组件203a导引到高压单元217b中。[0075]根据本发明教示的示范性方法在图3A到3D中所示的流程图中示意性地说明。图3A示意性地说明用于监视样本中的某些特定目标分析物蛋白质的存在并任选地对其进行量化的第一种此类示范性方法，方法300。初始步骤302a或者，步骤302b为样本制备和提供步骤。倘若样本从（例如细菌集落导出，则步骤302a包含微生物中断（例如，裂解和提取。在例如图3A中概述的目标分析中，预先已知关于分析物的质谱签名（例如一或多个特定诊断离子，质）的特定信息。已知信息将通常包含分析物的分子量。因此，将同样已知从分子产生的离子的各种电荷态的mz值例如，如电喷射电离期间产生的分析物分子的不同多质子版本）。通常，还将已知离子的分段反应期间产生的诊断片段离子的mz值。因此，在步骤3〇3中，关于待搜索的此些特定尚子的一或多个预定质荷比mz和对应电荷态zP输入到控制程序或控制单元，例如控制单元或处理器160图1。假定每一目标离子通过离子源中的分析物分子的质子化形成，那么针对每一此特定离子，加合质子的数目由zp给出，且用以形成离子的化合物的分子量MW由Mff=[zpxmzp]-nxMproton给出，其中n是小整数例如，1彡n5且Mproton为原子单位AU的质子的质量。[0076]方法300的接下来的步骤304和306分别是固相净化或尺寸排阻层析以及层析分离的步骤，如上文所描述。在一些实验情形中，可在后续样本引入步骤308中将所提取样本直接灌注到质谱仪中，因此，步骤304和306由虚线展示为任选的。作为执行步骤304和306的替代方案，样本还可在样本制备步骤302b期间“离线”期间使用包含透析或现有技术水平中已知的其它技术的方法至少部分纯化。[0077]当必须根据时间约束完成分析时，如一些临床应用中，分析所需的时间可通过采用SPE步骤304如发明人Enke的U•S.5，175，430中所描述的时间压缩层析法步骤或如国际PCT专利申请公开案W02013166169A1中所描述的层析法步骤306中的“快速部分层析分离”（FPCS的方法而缩短。大体上，在执行FPCS中，含有各种有机和无机分析物的复杂混合物的微生物细胞的粗提取物小有机分子、蛋白质及其天然产生片段、脂质、核酸、多糖、脂蛋白等）加载于层析柱上且经受层析法。然而，并非允许梯度来单独地溶离每一分析物理想地，每层析峰一种分析物），而是有意加速所述梯度以使得在例如近似八分钟或更短时间内、且优选地五分钟或更短时间内大体上不获得层析峰，而不是获得基线分离原本将需要的长得多的运行时间。在FPCS分离中，许多分析物是根据其性质以及使用的层析法的类型反相、HILIC等而在任何给定时间从柱有意地共溶离。部分或不完全分离也可通过所属领域的技术人员己知的其它方法实现，包含但不限于减少化合物在柱上的保持的移动相溶剂和或改质剂的使用，减少化合物在柱上的保持的固定相媒介的选择包含粒度、微孔尺寸等），层析系统以较高流动速率的操作，层析系统以高温的操作，或不同层析分离模式即，反相、尺寸排阻等）的选择。FPCS技术产生很少或可能不产生跨越整个梯度的解析层析峰。因此，从层析图导出的大体上仅相关信息是从柱的溶离时间。记录的每一质谱表示共溶离分析物的“子集”，其随后经电离、在质量分析器中分离且被检测。[0078]在步骤3〇8图3A中，所述样本引入到质谱仪，且所述样本经离子化。所述样本可提供为从SPE盒、层析法设备或替代地通过溶离液溶液的直接输注而出现的溶离液材料。在提供到质谱仪后，通过质谱仪的电喷射电离源将样本化合物电离步骤308。这些电喷射产生的离子在本文称为“原始”离子。在此时，可任选地执行完整或分段MS1扫描步骤309以便识别mz空间中的富蛋白质区。（应注意在本文档中，可采用术语“扫描”来当用作名词时一般指代质谱，或替代地当用作动词时指代质谱的获取）。调查扫描将通常涵盖质荷比的特定实验范围，Amzsurvey。在目标分析的情况下，如方法3〇〇图M中概述，MS1扫描可能是不必要的，且方法3〇〇的执行可直接继续到步骤310,其中随后隔离离子的子集以用于进一步反应和分析。在步骤310中执行的隔离可以使得某一预定mz范围或可能多个预定mz范围内的离子被保持以用于后续反应和分析，而一或多个预定mz范围外的离子被丢弃。预定mz范围经设定以便对应于目标分析物蛋白质或肽的输入mz比（步骤303，在方法的执行中检测或监视所述目标分析物蛋白质或肽的存在或数量。[0079]大体上，可以已知方式通过将来自离子源的离子引入到离子阱（例如三维离子阱、弓m罔卞书町孙万l呀）、单片段线性离子阱、多分段线性离子阱、多极离子导向器或四极，质器中，^且然后通过跨离子阱的电极对施加补充Ac电压或施加适当即DC电压比以隔禺所关注的尚子群体而共振地喷出mz比在所希望范围之外的离子，来执行步骤31〇的隔离。在一些实施例中，补充电压的频率可扫过各种频率以使得离子根据其mz比按顺序喷出。在一些实施例中，叠加频率的组合可具备遗失频率的多个片段g卩，“缺口”）以使得包括两个或更多个非邻接mz比范围的离子在阱内同时隔离。[00S0]四极滤质器也可或作为替代用以隔离所关注的经界定或目标质量范围。原始离子的特定mz范围是通31单个或一系列固定RFDC电压比率而选择以便选择适当的质量隔离窗口。在此情况下采用的起作用的配置可为混合质谱仪仪器，其包括四极、C阱、Orbitrap™质量分析器以及高能量碰撞池HCD，其中隔离的离子群体可存储在C阱或HCD池中用于PTR实验。原始离子的隔离群体可视为包括“前驱体，，离子，因为在步骤310之后，这些离子经受后续离子-离子反应或分段。[0081]在$选实施例中，前驱体离子群体的隔离可在分段线性离子阱的第一片段中执行。在所需离子群体的隔离之后，多电荷蛋白质离子群体可有利地移动到线性离子阱的另一片段。这些步骤可在PTR过程之前针对前驱体离子的隔离的经界定范围重复多次。[0082]方法300图3A的步骤312为包含离子停车的PTR步骤。在PTR程序中，使用具有化学电离的基于铼的长丝或辉光放电电离源从合适的基于高电子亲和性的气态反应剂产生阴离子。可使用氮气、甲烷、异丁烷或现有技术水平中的其它已知气体执行化学电离。阴离子反应剂可为在室温下的气体，或可为具有足够蒸气压力以产生过量阴离子的液体，所述过量阴离子将在伪一级反应条件下驱动PTR过程。阴离子随后从源区传送到分段线性阱，借此使用如上文所描述的补充AC电压使特定阴离子反应剂质量隔离。阴离子源可与电喷射源成直列式或安装在分段线性离子阱的相对端上。替代地，四极滤质器也可执行阴离子隔离，其中后续PTR过程在仪器的C阱或HCD池中发生。[0083]步骤312的执行包含跨越离子阱的一对电极施加补充AC激励波形，在离子阱内，样本导出的阳离子与PTR反应剂阴离子反应持续预定时间周期。此“离子停车”程序的采用将从任何特定第一代蛋白质或多肽离子导出的离子的分布集中到如所施加波形确定的mz值的特定限制范围中。此程序将通常将从任何特定蛋白质或多肽离子导出的离子限制到特定电荷态，借此简化所得质谱且增加对应于特定蛋白质或多肽的任何质谱峰值的强度。离子被限制到的mz值的特定范围可包括从第一代离子物质导出的不同相应电荷态的离子。通常，离子将停放在比初始目标前驱体离子的电荷态zP少几个单位例如，少不超过五个单位的电荷态中。相应地，用于离子停车的所施加波形将具有与具有质荷比mz2的离子的运动频率匹配的频率，所述质荷比mz2由下式给出[0084]mz2=mp-nxMprotonzp-n等式1[0085]其中n为小整数例如，1彡n彡5，且Mproton为原子单位AU的质子的质量。优选地，（mz2大于先前步骤310中采用的隔离窗口涵盖的所有质荷比以便借此优化污染物离子与对应于潜在蛋白质或多肽分析物的离子的分离。[0086]步骤312期间离子停车的应用致使分析物导出的离子与非分析物或污染物离子谱上分离，非分析物或污染物离子可在较早质量隔离步骤例如，步骤31〇期间连同分析物离子一起共隔离。分析物离子其mz比使得其阱振荡的频率对应于所施加的补充AC激励频率从与PTR反应剂离子的进一步电荷缩减反应有效地移除，而不同mz比的非分析物离子经受进一步电荷缩减乃至抵消。其中n为小整数（例如，l$n彡5，且Mproton为原子单位AU的质子的质量。如果电荷缩减的程度小于分析物的单一电荷单位，那么分析物离子将不“停车”，但非分析物离子可能不合需要地停放;如果分析物离子的电荷缩减的程度太大，那么分析物离子的质荷比可增加到质量分析器的检测范围以外的范围。[0087]因为在步骤312中分析物离子与其它离子谱上分离，所以根据mz比的额外隔离步骤步骤314产生所要电荷态中的目标分析物的基本上纯的离子群体其条件是此些分析物离子存在于所述样本中）。电荷缩减状态相对于步骤310中初始地隔离的分析物离子的电荷态）中的隔离的分析物离子在此处关于论述中的方法称为第一代产物离子。施加到这些经纯化第一代产物离子的第二PTR步骤步骤316随后产生多个相应电荷态中的离子物质的新的分布，其中每一此离子物质从目标分析物导出。所述分布除第二PTR步骤316期间形成的新物质此处被称作第二代产物离子物质外还可包含残余第一代产物离子物质。电荷缩减的程度取决于在此期间允许分析物离子与PTR反应剂离子反应的时间量。实际反应时间可在少至lms到大致100ms的范围内变化。在较短反应时间的情况下，可保持残余量的第一代产物离子物质。步骤316可任选地包含并行停车以便产生具有相应电荷态的多个离子物质。在此些情况下，用于离子停车的所施加的辅助波形将包括求和的多个相应分量波形总共n个此类分量波形），每一分量波形具有与具有质荷比mzj，（ljn的相应缩减电荷态离子物质的运动频率匹配的频率Fj，（1彡jn，所述质荷比mz由下式给出[0088]mzj=mp-jxMprotonzp-j等式2[0089]其中Mpr_n为原子单位AU的质子的质量。每一mzj可大于先前步骤314中采用的隔离窗口涵盖的所有质荷比以便进一步增强污染物离子与对应于潜在蛋白质或多肽分析物的离子的分离。[0090]由PTR步骤316产生的离子物质的整个群体可在步骤318中经受使用较高碰撞能量解离HCD技术的分段。因为步骤316之后保持的每一离子物质理论上从目标分析物导出，所以所有此些片段可提供分析物特定诊断信息。因为具有不同电荷态的离子可彼此不同地解离，所以具有不同电荷态的离子的同时分段可导致与单一电荷态的分段相比较丰富的诊断蛋白质结构信息（肽序列信息）。分段期间，所施加的碰撞能量可经控制以便避免过分分段-换句话说，片段的进一步分段。在后续步骤320中，片段由质量分析器分析以便产生片段的质谱。在步骤322中，可使用片段的质谱数据确认原始样本中目标分析物的存在或其缺乏）。关于片段的观察到的质谱峰值的强度还可与样本中分析物的量有关。[0091]在许多情形中，可在单一样本中搜索一个以上目标分析物。在此些情形中，方法300的执行可返回（虚线标记的“任选重复”）到步骤303,或取决于样本和所采用的仪器，回到步骤304-310中的任一者以便获取数据和作出关于不同分析物的确定。最后，可采用（步骤324关于一个或几个分析物的数据来自动识别从其导出所述样本的微生物。[0092]图3B为根据本发明教示的第二示范性方法方法340的示意性流程图。方法340针对样本中一或多个蛋白质的存在和或浓度的数据相依确定。相对于其中预先己知待搜索的蛋白质分析物的身份的目标实验例如，方法300，数据相依实验并不假定此了解。实际上，在数据相依实验中，在分析本身期间取决于相同实验的较早步骤期间获取的数据确定由质谱仪执行的步骤的特定细节。因此，方法340并不包含对应于方法300的步骤3〇3的数据输入步骤，且与方法300的对应步骤309相比，高分辨率MS调查扫描步骤349不是任选的。此外，隔离的（步骤351和355原始离子的mz范围的选择取决于先前调查扫描步骤349中获得的结果，这与其中预先确定此些mz范围的方法300的质量隔离步骤310形成对比。[0093]在其它方面，方法340图3B的许多步骤类似或等同于方法3〇0图3A的对应步骤。因此，方法340的步骤341、3411、343、345和347分别对应于方法300的步骤302、30213、304、306和308。类似地，方法340的步骤357、359、361、363和365分别对应于方法300的步骤312、314、316、318和320。由于对应步骤之间的类似性，此处不再呈现此些步骤的上文呈现的详细论述。[0094]数据相依方法340在其中所关注的化合物的身份预先未知且其中每一所分析的样本部分具有有限复杂性的情形中有用，使得所获取的调查数据提供足够信息以实现自动确定待探究的mz比范围。样本部分的有限复杂性可与所述样本部分中的化学组分的数目的限制有关，这可能是由于先前极有效样本净化步骤343或极高分辨率层析分离步骤345用于提供所述样本部分。[0095]在方法340图洲）的步骤351中，基于原始离子的先前调查扫描的结果（步骤349选择用于原始离子的隔离的mz范围（即，“隔离窗口”）。与常规数据相依质谱分析方法类似性，所述选择可基于调查扫描中观察到的有限数目的质谱峰值的相对强度而作出。具体地说，如果调查扫描质谱主要由比谱基线强得多的相对较小数目（小于约20良好解析的峰值组成，那么步骤351_367的每一迭代（遵循根据图3B中的虚线标记的“任选重复”的执行流程可对应于挑选涵盖这些最强峰值中的每一者的隔离窗口。[0096]已在Yip等人的名义下且标题为“混合生物分子分析物的数据相依质谱法的方法MethodsforData-DependentMassSpectrometryofMixedBiomolecularAnalytes”的2015年3月12日申请的第62132,124号共同待决且共同转让的美国临时申请案中描述涉及自动化实时质谱解卷积的调查扫描分析的较复杂方法，所述申请案的揭示内容在此全文以引用的方式并入本文中。前述临时申请案描述解卷积程序，借此质谱峰值的各种集合其中峰值的每一集合对应于单一分析物可辨识为电荷态分布。示意性实例如图7中所说明）说明并入到步骤351时解卷积程序如何可导致分别由包络905和包络906描绘的线的两个重叠集合的辨识。利用由此初始调查程序提供的信息，单一代表性质谱线可在确定隔离窗口时从线的每一集合中选出以用于进一步分析步骤351。此方法避免使用常规相对线强度准则挑选产生冗余信息的隔离窗口的可能性。[0097]在方法340图3B的步骤353中，确定经选择用于后续隔离（步骤355的质谱线的电荷态，使得后续离子停车程序例如，步骤357可采用对应于正确地计算的缩减的电荷态的激发波形。如果调查扫描包含同位素变型的解析线，那么可依据同位素变型的线的间距确定所选择的线的电荷态。或者，可通过应用前述第62132,124号美国临时申请案中所描述的方法确定电荷态。[0098]方法340图3B的步骤367代替方法300图3A的步骤322,因为不存在关于对于其己知存在质谱线的化合物的“存在”的问题。实际上，可在步骤367中作出尝试以基于所选择的线的mz步骤351和所确定的电荷态z步骤353以及片段的观察到的mz值步骤365识别对应于对于其在步骤351中选择隔离范围的线的化合物。化合物确定可有利地利用第一代离子和片段的质谱线的标注数据库。最后，在步骤351和367之间界定的步骤的环路的所有迭代已经完成之后，可适当时作出从其导出样本的微生物的自动识别（如果已经识别足够数目的诊断蛋白质化合物）。[00"]图3C为根据本发明教示的第三示范性方法的示意流程图。图3C中说明的方法370针对样本中一或多个蛋白质的存在和或浓度的数据独立确定。图3C中说明的数据独立方法37〇以及图3D中说明的替代的数据独立方法400可在不存在目标分析物时以及谱太复杂例如许多重叠或未解析的线，很少或没有线具有主导强度而不能采用数据相依分析时采用。方法37〇图3〇的步骤371、371匕373、375、377和379类似于方法300图3六的相应的对应步骤302a、302b、304、306、308和309，且因此此处不作详细描述。[0100]在执行高分辨率MS调查扫描步骤379之后，方法370继续以重复循环穿过所述组步骤381到393。在所述组步骤3S1到邪3的每一执行期间，通过执行以下步骤询问相应mz范围：在相应所询问mz范围内隔离原始离子的相应子群体步骤381、在应用离子停车的情况下使隔离的子离子群体与PTR反应剂反应持续指定反应时间（步骤383、PTR程序之后剩余的离子的任选质量分析步骤384、由HCD对PTR程序之后剩余的离子的分段步骤385、由质量分析器对分段步骤之后剩余的离子的质量分析，借此产生片段的质谱步骤387、确定是否已经询问所有mz范围（步骤391，以及如果更多mz范围待询问，那么改变或递增接下来待询问的mz范围。任选地，可作出尝试步骤洲％以识别对应于步骤381到393的环路的每一迭代期间相应所询问mz范围内发生的线的化合物，但这些尝试可任选地在环路外部执行（步骤389b。化合物识别步骤步骤389a或38%可利用片段离子的质量分析或分析）（步骤387期间确定的线的观察到的质谱位置，和可能如可在步骤384中观察到的由HCD自其形成片段的离子的质谱位置。[0101]因为方法37〇关于数据独立分析，所以各种所询问mz范围的位置大体来说不由高分辨率MS调查扫描步骤379的结果确定，而是实际全部或大部分预先确定，在最低mz范围到最高mz范围（或反之亦然的递增步骤中以预定增量进行。相继mz范围之间的递增间距可恒定，或者可在分析过程期间变化。邻近所询问mz范围mz窗口）可为连续的且可彼此重叠。不太优选地，一些所询问mz范围之间存在间隙。其中可在所询问mz范围之间有利地发生间隙的一个情形是，基于来自高分辨率MS调查扫描步骤379的信息此些跳过区中不存在峰值跳过特定mz范围时。[0102]在步骤381到洲3的环路的对应于相应所询问mz范围的每一迭代期间执行质量隔离步骤381。因为样本中化合物的身份通常预先未知，所以隔离窗口的宽度将通常选择为足够大使得具有潜在诊断兴趣的化合物的至少一个质谱线很可能存在于隔离窗口内。因此，步骤381中使用的隔离窗口宽度将通常大于已知如数据相依实验中）或预期如目标实验中）线的位置时通常采用的窗口宽度大致2Th最佳隔离窗口宽度可基于类似或相同样本的常规实验预先选择。最佳窗口宽度可在方法370的执行开始时在额外输入步骤期间作为参数输入。如果无最佳窗口宽度可用，那么可米用例如范围4-6Th包含4-6Th内的窗口宽度等默认窗口宽度。[0103]类似地，在步骤381到393的环路的每一迭代期间执行PTR步骤步骤383。在将补充离子停车AC波形施加到其内发生PTR反应的离子阱的电极的情况下执行PTR步骤。波形的频率对应于特定mz值，（mzpark。反应过程期间形成的且碰巧包括极接近地等于mzpa]：k的mz值的任何PTR产物离子将被禁止参与与PTR反应剂离子的任何进一步电荷缩减反应D因此，此些离子物质将聚积在mzpark处，而所有其它离子的电荷将继续缩减或抵消。如果mzbound为隔离窗口的最低边界，那么步骤383期间对于其将停放质谱线的唯一化合物将为对于其满足以下条件的那些化合物：（包括化合物的多质子版本的离子的邻近电荷态之间的间距Amz使得Amz彡[mzpark-mzbound]。因为样本中化合物的身份通常预先未知，所以通常不知道多少化合物的谱签名将“停放”在mZpark处。大体来说，仅几个化合物至多将预期满足以上条件。然而，对于其满足此条件的化合物的数目（如果存在的话将随着mzPark与mzbmmd之间的间距的增加而增加。在某一程度上，可基于具有潜在诊断兴趣的化合物的所估计或已知分子量范围估计邻近电荷态之间的所要间距Amzdesired。在此些情形中，可选择补充波形使得量[mzpark-mzbound]仅稍微大于Amzdesired〇[0104]图3D为根据本发明教示的第四示范性方法的示意流程图。图3D中说明的方法400为用于确定样本中一或多个蛋白质的存在和或浓度的替代的数据独立方法。方法400图3D的许多步骤类似于方法370图3C中的对应步骤。因此，这些对应步骤在图3C-3D中类似地编号。具体地说，方法400的步骤371a或371b到步骤393类似于且组织为类似于方法370的对应步骤，只是PTR产物离子步骤384的质量分析不再是任选的且为方法400中的高分辨率质量分析。[0105]类似于已经描述的方法300,方法400包含重复执行的一组步骤（具体地说，步骤381-393，其中所述组步骤的每一执行对应于不同相应mz范围的询问。方法370与方法400之间的主要差异在已询问最终mz范围之后执行的步骤中发生。在方法400中，一旦已询问最后mZ范围（步骤391中确定），步骤391的“Y”（是分支就将执行转向新步骤417,在新步骤417处，执行每一获得的高分辨率PTRMS扫描来自步骤384的自动数学解卷积以便针对每一此扫描辨识：（1每一PTR谱中的蛋白质线、mz和电荷态z;以及2每一初始隔离窗口中的蛋白质线、mz和电荷态z。发明人Yip等人的名义下的且标题为“用于混合生物分子分析物的数据相依质谱法的方法（MethodsforData-DependentMassSpectrometryofMixedBiomolecularAnalytes”的2015年3月12日申请的第62132,124号前述共同待决且共同转让的美国临时申请案中已描述合适的自动化实时质谱解卷积技术。在后续步骤419中，如数学解卷积确定的所辨识的蛋白质线和电荷态设定为用于一或多个目标实验例如，方法300的执行的输入，且随后执行（步骤431各种目标实验。使用后续目标实验中获得的数据可能由方法400的步骤384和387中获得的数据补充），可作出尝试以识别样本中的化合物步骤432。使用足够数目的识别的化合物，可在适当时作出（步骤433从其导出样本的微生物的识别。[0106]实例[0107]实例1.泛素混合物的质谱分析。图4A、4B、4C和4D说明应用PTR和HCD的组合技术来分析含有充足的聚合污染物的泛素的溶液。图4A为样本的调查扫描MS1扫描的图形描绘。可辨识为关于泛素化合物的峰值以其电荷态和mz位置标记。可辨识为关于泛素化合物的峰值以其电荷态和mz位置标记。大多数或所有剩余峰值其中几个选定者以其mz位置标记对应于聚合污染物。为了简化谱，泛素+13-电荷态峰值的预期位置附近宽度2Th的隔离窗口内的子离子群体被隔离（图4B中展示的隔离的质谱），且隔离的原始离子暴露于PTR反应剂而无离子停车持续5〇ms。通过此PTR步骤产生的第一代产物离子的质谱在图4C中说明。在PTR步骤之后，观察到由其电荷态和mz位置指示的若干良好解析的泛素线。正如期望，先前存在的泛素离子的最高电荷态+12和更大通过与PTR反应剂的反应完全消除；因此，总体分布移位到较低电荷态。尽管图4C中的泛素线完全暴露，但弱背景线指示在原始隔离步骤中小比例的污染物离子连同泛素+13离子共隔离。[0108]图4C中说明的第一代产物离子的群体经受根据较高碰撞能量解离HCD技术的分段步骤。获得所得片段和残余未分段离子的质谱，如图4D中所展示。众所周知，HCD程序期间施加到离子的动能取决于离子的初始电荷态。当例如图4C中展示的不同电荷态的一组离子同时加速到碰撞气体中时，碰撞能量可经调整使得导致仅具有大于特定值的电荷态的离子分段。在当前例项中，施加根据正规化碰撞能量NCE值20的碰撞电压。图4D与图4C的比较展示，具有+10和+11电荷态的泛素离子完全分段，但具有电荷态+9、+8和+7的离子保持与预分段谱中基本上相同的相对比例，从而指示这些离子的极少分段或无分段。因此，结果指示，所施加的正规化碰撞能量不充分在此情况下而不能致使具有小于大致+8的电荷态的离子的分段。以此方式对正规化碰撞能量的控制提供对照过分分段的检查。[0109]实例2.两个蛋白混合物的质谱分析。图5A、5B、5C、5D、5E和5F说明应用PTR和HCD的组合技术来分析碳酸酐酶和肌红蛋白的混合物。图5A为碳酸酐酶和肌红蛋白成溶液的混合物的MS1调查谱。616Th处的高峰值为以其它方式非共价附接到肌红蛋白的血红素部分的签名。样本制备导致血红素的分离全肌红蛋白变成脱辅基肌红蛋白）。通常观察血红素峰值。为了简化谱，肌红蛋白+21-电荷态峰值的预期位置附近宽度2Th的隔离窗口内的子离子群体被隔离（图5B中展示的隔离的质谱），且隔离的原始离子暴露于PTR反应剂无离子停车）持续30ms。通过此PTR步骤产生的第一代产物离子的质谱在图5C中说明。图5C中说明的质谱的一般形式指示三个不同蛋白质电荷态分布肌红蛋白、碳酸酐酶和一个其它）的存在，其中仅肌红蛋白峰值被标记。[0110]图5D为由PTR产生的离子的质谱以及来自图5B中展示的离子群体的肌红蛋白的+21电荷态的离子停车，其中利用PTR反应剂离子持续30毫秒，且使用经选择以防止848.55ThPTR步骤期间从808•10Th处的+21峰值形成处肌红蛋白的+20峰值的mz位置处的PTR电荷缩减的波形，继之以+20离子的隔离。产生于这些步骤的离子基本上由+20电荷态中的肌红蛋白的纯离子物质组成。此隔离的离子物质随后经受第二PTR步骤以便产生电荷态分布，其质谱在图5E中展示。肌红蛋白电荷态分布（图5E的离子经受HCD分段步骤。获得所得片段和残余未分段离子的质谱，如图5F所示。图5F的质谱展示大量的片段由+17到+20电荷态的离子的接近完整分段形成，且+16电荷态的离子的相当大部分若非电荷态+15及更低的肌红蛋白离子）保持大体上未分段。图5F中所描绘的所述组片段由购自Northwestern大学的ProSight软件分析以重建肌红蛋白序列。发现上文描述的程序多个PTR步骤继之以HCD分段产生总共31个可辨识离子30y-离子和lb-离子），其足以明确地重建肌红蛋白序列。这些结果比采用仅单一PTR步骤继之以分段时获得的结果优良。在此后一情况中，辨识总共仅23个离子。应用HCD自身无先前PTR纯化步骤产生更坏的结果，仅辨识总共五个片段离子。[0112]实例3.细菌裂解物中的肌红蛋白的质谱分析。图6人、68、6：、60、6£和6?说明应用PTR和HCD的组合技术来分析细菌裂解物内的肌红蛋白。通过将少量肌红蛋白添加到细菌大肠杆菌的裂解物中来制备样本。图6A展示所述样本的MS1调查扫描。可归于图6A的质谱中的肌红蛋白（非标记的峰值在可归于细菌导出的化合物的许多峰值的中间几乎不可见。此样本的质谱分析期间，原始离子的子群体在8〇8Th的mz值处居中的宽度2Th的隔离窗口内隔离，所述808Th的mz值为包括电荷态+21的多质子肌红蛋白分子的离子物质的预期位置。图6B展不隔罔的尚子的质谱。[0113]图6C说明在无离子停车的情况下图册中描绘的隔离的离子的一部分与PTR反应剂反应持续30ms之后获得的测试质谱。在这些反应条件下，电荷态+21的肌红蛋白物质的仅小部分反应以便产生具有电荷态+20、+19、+18、+17、+16、+15、+14、+13和可能其它的缩减电荷态肌红蛋白物质（由图6C中的星号指示）。图6C的质谱中的额外线的存在指示其它化合物的离子在原始隔离步骤期间连同肌红蛋白一起共隔离。因此，为了消除污染物物质，图6B中所描绘的离子群体在应用离子停车波形的情况下与PTR反应剂反应持续50ms以便在+20电荷态848.55Th处终止肌红蛋白离子的缩减。此mz值处的离子物质随后隔呙，因此产生如图6D中所描绘的基本上纯的肌红蛋白物质。[0114]在其隔离之后，+20电荷态（图6D的经纯化肌红蛋白离子物质在无离子停车的情况下进一步与PTR反应剂反应持续lms以便创建如图6E中所描绘的电荷态的分布。此带电肌红蛋白离子物质的集合随后由HCD使用正规化碰撞能量值2〇分段以便产生图册中所描绘的片段谱。除片段之外，图6F的质谱还展现可归于未分段的完整肌红蛋白离子的峰值。

权利要求：1.一种用于识别液体样本内的蛋白质或多肽分析物化合物的存在或不存在的方法，所述液体样本包括化合物的混合物，所述混合物包含多种蛋白质化合物或多种多肽化合物或多种蛋白质和多肽化合物，所述方法包括：a从用户或数据文件接收包括具有zp加合质子的所述蛋白质或多肽分析物化合物的分子的离子的质荷比mzp和电荷态zp的值；〇3在质谱仪的离子源中通过电喷射电离形成所述液体样本的所述部分的化合物的所述混合物的带正电离子，所述带正电离子包括多个离子物质；c隔离包括包含所述所接收的mz值的mz范围的所述离子物质的子集；⑹通过在离子阱中致使离子物质的所述隔离的第一子集与反应剂化合物的阴离子反应而从离子物质的所述隔离的第一子集产生多个第一代产物离子物质，所述反应剂化合物的阴离子在反应后从包括蛋白质或多肽化合物的质子化分子物质的一或多个离子物质中的每一者提取质子，所述反应执行持续预定持续时间，在此期间，在与具有第二mz的离子的运动频率匹配的频率下将补充振荡电压波形施加到离子阱的电极，所述第二tnz对应于具有zp-n加合质子的所述分析物化合物的分子，其中Knzp;e隔离包括包含所述第二mz的另一mz范围的所述第一代产物离子物质的子集；⑴通过致使所述第一代产物离子物质的所述隔离的子集与所述反应剂化合物的额外阴离子反应持续第二预定持续时间而从离子物质的所述隔离的第一子集产生多个第二代产物离子物质；g通过将所述第二代产物离子物质中的两者或两者以上分段来产生多个片段离子物质；i使用所述质谱仪的质量分析器产生所述片段离子物质的质谱；以及g基于所述质谱中一或多个预定片段mz值的所确定的存在或不存在识别所述样本内的所述分析物化合物的存在。2.—种用于识别液体样本内的蛋白质或多肽化合物的方法，所述液体样本包括化合物的混合物，所述混合物包含多种蛋白质化合物或多种多肽化合物或多种蛋白质和多肽化合物，所述方法包括：a在质谱仪的离子源中通过电喷射电离形成所述液体样本的所述部分的化合物的所述混合物的带正电离子，所述带正电离子包括多个离子物质；Od使用所述质谱仪的质量分析器产生所述离子的质谱；c基于所述质谱中的可观测的特征挑选多个质荷比raz范围；以及d针对所述所挑选的mz范围中的每一者：i确定对应于所述相应所挑选的mz范围中的质荷比mzP处观察到的质谱线的电荷态zP，以及将质量值mP计算为mP=mzPxzP以及分子量MW=[zPxmztJ-ZpxMprcn。!!，其中Mproton为AU中的质子的质量；ii隔离具有所述相应所挑选的mZ范围内的mz值的所述离子物质的子集；iii通过在离子阱中致使离子物质的所述相应隔离的第一子集与反应剂化合物的阴离子反应而从离子物质的所述相应隔离的第一子集产生多个第一代产物离子物质，所述反应剂化合物的阴离子在反应后从包括蛋白质或多肽化合物的质子化分子物质的一或多个离子物质中的每一者提取质子，所述反应执行持续预定持续时间，在此期间，在与具有产物离子质荷比mz2的的离子的运动频率匹配的频率下将补充振荡电压波形施加到所述离子阱的电极，所述产物离子质荷比mz2由mz2=mP_nMProtonzp_n给定，其中整数使得1nzp且Mproton为AU中的质子的质量；iv隔离包括包含所述产品离子质荷比mz2的另一mz范围的所述相应第一代产物离子物质的子集；v通过致使所述第一代产物离子物质的所述隔离的子集与所述反应剂化合物的额外阴离子反应持续第二预定持续时间而从离子物质的所述相应隔离的第一子集产生多个第二代产物离子物质；vi通过将所述相应第二代产物离子物质中的两者或两者以上分段来产生多个片段离子物质；vii产生所述相应片段离子的质谱；以及viii基于所述相应片段的所述质谱中观察到的所述相应分子量和质荷比值搜索蛋白质或多肽识别。3.—种用于识别液体样本内的蛋白质或多肽化合物的方法，所述液体样本包括化合物的混合物，所述混合物包含多种蛋白质化合物或多种多肽化合物或多种蛋白质和多肽化合物，所述方法包括：a在质谱仪的离子源中通过电喷射电离形成所述液体样本的所述部分的化合物的所述混合物的带正电离子，所述带正电离子包括多个离子物质b使用所述质谱仪的质量分析器产生调查扫描质荷比范围△mzsurvey内的所述离子的质谱；C将所述范围amzsurvey划分为多个质荷比mz子范围，以及d针对所述mz子范围中的每一者：i隔离具有所述相应mz子范围内的mz值的所述离子物质的子集；ii通过在离子阱中致使离子物质的所述相应隔离的第一子集与反应剂化合物的阴离子反应而从离子物质的所述相应隔离的第一子集产生多个第一代产物离子物质，所述反应剂化合物的阴离子在反应后从包括蛋白质或多肽化合物的质子化分子物质的一或多个离子物质中的每一者提取质子，所述反应执行持续预定持续时间，在此期间，在与具有产物离子质荷比mz2的离子的运动频率匹配的频率下将补充振荡电压波形施加到所述离子阱的电极，所述产物离子质荷比mz2大于所述相应子范围内涵盖的所有mz值；iii通过将所述第一代产物离子物质分段来产生多个片段离子物质；iv产生所述相应片段离子的质谱；以及v基于所述相应片段的所述质谱中观察到的所述值mz2和质荷比值搜索蛋白质或多肽识别。4.一种用于识别液体样本内的蛋白质或多肽化合物的方法，所述液体样本包括化合物的混合物，所述混合物包含多种蛋白质化合物或多种多肽化合物或多种蛋白质和多肽化合物，所述方法包括：a在质谱仪的离子源中通过电喷射电离形成所述液体样本的所述部分的化合物的所述混合物的带正电离子，所述带正电离子包括多个离子物质；b使用所述质谱仪的质量分析器产生调查扫描质荷比范围△mzsurvey内的所述离子的质谱；C将所述范围Mmzsurvey划分为多个质荷比mz子范围，以及d针对所述mz子范围中的每一者：i隔离具有所述相应mz子范围内的mz值的所述离子物质的子集；ii通过在离子阱中致使离子物质的所述相应隔离的第一子集与反应剂化合物的阴离子反应而从离子物质的所述相应隔离的第一子集产生多个第一代产物离子物质，所述反应剂化合物的阴离子在反应后从包括蛋白质或多肽化合物的质子化分子物质的一或多个离子物质中的每一者提取质子，所述反应执行持续预定持续时间，在此期间，在与具有产物离子质荷比mzj，（Kj彡n的离子的相应运动频率匹配的相应频率Fj，（Kj彡n下将多个n个补充振荡电压波形施加到所述离子阱的电极，所述产物离子质荷比mzj大于所述相应子范围内涵盖的所有mz值；iii通过将所述相应多个第一代产物离子物质分段来产生多个片段离子物质；iv产生所述相应片段离子的质谱；以及v基于所述相应片段的所述质谱中观察到的所述值mzj和质荷比值搜索蛋白质或多肽识别。

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