申请/专利权人：北京农业质量标准与检测技术研究中心

申请日：2017-09-30

公开（公告）日：2021-01-05

公开（公告）号：CN107727781B

主分类号：G01N30/60(20060101)

分类号：G01N30/60(20060101);G01N30/14(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.05#授权;2018.03.20#实质审查的生效;2018.02.23#公开

摘要：本发明提供了一种同时净化多种真菌毒素的固相萃取柱及其应用。该固相萃取柱包括多壁碳纳米管和反相色谱填料。本发明使用多壁碳纳米管与反相色谱填料复配，可有效地实现多种真菌毒素的一次性同时净化，尤其适用于多种镰刀菌毒素的同时净化，节省了成本及分析时间，可适用于各种水果、蔬菜、粮食、饲料和食品样品中。

主权项：1.一种净化真菌毒素的固相萃取柱，其特征在于，所述固相萃取柱包括混合均匀的多壁碳纳米管和反相色谱填料，所述多壁碳纳米管和反相色谱填料的重量比为1:20；所述多壁碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管，内径为3~5nm，外径为8~15nm，长度为50μm；所述反相色谱填料为C18，其主要成分为十八烷基键合硅胶，其粒径为40~60μm；所述真菌毒素包括DON、NIV、NEO、Fus-X、3-AcDON、15-AcDON、DAS、HT-2、T-2、ZEN、ZAN、α-ZOL、β-ZOL、α-ZAL和β-ZAL。

全文数据：一种同时净化多种真菌毒素的固相萃取柱及其应用技术领域[0001]本发明涉及农产品安全检测技术领域，具体地说涉及一种同时净化多种真菌毒素的固相萃取柱及其应用。背景技术[0002]真菌毒素Mycotoxin是由产毒真菌在适宜的环境条件下产生的有毒代谢产物，可广泛污染农作物、食品及饲料等植物源性产品。目前在自然界中已发现有400多种真菌毒素，其中最为关注的有黄曲霉毒素（Aflatoxin，AFT、脱氧雪腐镰刀菌烯醇Deoxynivalenol，DON、T_2毒素、玉米赤霉稀酬（Zearalenone，ZEN、伏马毒素Fumonisin，FB、赫曲霉毒素0chratoxin，0TA、细交链格抱酮酸Tenuazonicacid，TeA等。真菌毒素污染食品不仅在经济上造成了巨大的损失，而且还能引起人中毒，轻者恶心、呕吐、腹胀、腹痛，严重引起昏迷、甚至死亡，对人类的健康造成极大的威胁。另外，真菌及其毒素与癌症的发生有密切的关系。癌症的高发地区与食物中真菌毒素污染有关。[0003]据联合国粮农组织FAO统计，每年全球农产品污染率高达25%，损失达10亿吨；据我国国家粮食局统计，每年有3100万吨粮食在生产、储存、运输的过程中受到真菌毒素污染，约占粮食年总产量的6.2%。粮食及其制品作为人类不可或缺的主要食物和动物饲料的主要来源，真菌毒素的污染越来越受到关注。许多国家已陆续制定并颁布了诸多相关的法律法规和毒素限量标准，以确保人类的食物安全。[0004]由于对真菌毒素的强制限量规定和各项监控措施的实施，强力促进了真菌毒素检测方法的发展。目前，食用农产品中真菌毒素的检测方法可以分为两类:基于抗体的快速检测法和色谱分析法。尽管快检方法可以在较短的时间内完成大批量样品的分析，具有操作简便、快速、检测成本较低等优点，但缺点是检出结果有假阳性、假阴性的存在，且不能准确定量，每次只能对一种或少数几种毒素进行检测。[0005]液相色谱-质谱联用法LC-MSMS可以通过保留时间和破碎离子共同完成定性定量分析，具有准确、稳定、可靠等特点，其中最显著的技术优势是多组分、多类别真菌毒素的同时分析检测，是一种灵敏度和选择性极高的真菌毒素检测方法。但由于农产品基质复杂多样，理化性质各不相同，在特定条件下可能会发生相互作用，容易造成基质干扰，所以前处理的富集净化对于农产品中真菌毒素的检测分析至关重要。目前样品前处理通常采用免疫亲和柱、多功能净化柱、固相萃取柱等净化方法，其中免疫亲和柱多针对一类真菌毒素，如黄曲霉毒素，且检测成本高、操作繁琐、工序复杂，不利于大量样品中多种毒素的同时分析检测。[0006]而有关固相萃取柱、多功能净化柱的描述：[0007]在CN201410001661.6公开号为CN104931627B，黄曲霉毒素）和CN201410835645.7公开号为CN104502481A，呕吐霉素和玉米赤霉烯酮提到了mycosep™228固相萃取柱（多功能净化柱）。但MyC〇sep™228主要应用于农产品中黄曲霉毒素、展青霉素的固相萃取柱，目前未见针对同时净化多种真菌毒素开发的固相萃取柱。[0008]另外，在CN201510253906.9公开号为CN103954714A，4种A型单端孢霉烯族类毒素和CN201610719869.0公开号为CN106093254A，6种玉米赤霉烯酮类毒素）提到了多壁碳纳米管。但上述专利中仅利用多壁碳纳米管的强大吸附能力，将毒素吸附在多壁碳纳米管上，需要经淋洗、洗脱过程，耗费溶剂较多且耗时较长。[0009]目前，尚缺乏一种价格低廉、操作简便、快速的富集净化多种真菌毒素涵盖六大类主要真菌毒素）的方法，因此，有必要建立高效且可靠的分析方法来监控真菌毒素的发生及污染情况。发明内容[0010]本发明的旨在解决现有固相萃取柱技术对农产品中多种真菌毒素检测富集净化效果差，回收率低，并且试剂较为复杂，不能对各种水果、蔬菜、粮食和食品样品进行准确的检测的问题，进而提出一种用于多种真菌毒素同时净化的固相萃取柱及其应用。[0011]本发明提供了一种可实现同时净化多种真菌毒素的固相萃取柱，该固相萃取柱包括多壁碳纳米管和反相色谱填料。[0012]本发明使用多壁碳纳米管和反相色谱填料，可有效地实现多种真菌毒素的同时净化，尤其适用于多种镰刀菌毒素的同时净化，其回收率均在90%以上，可被同时净化的真菌毒素包括DON、NIV、NEO、Fus-X、3-AcDON、15-AcDON、DAS、HT-2、T-2、ZEN、ZAN、a-ZOL、0-ZOL、a_ZAL和β-ZAL。[0013]在一个优选实施方式中，多壁碳纳米管优选为羟基化多壁碳纳米管。也可优选为羧基化多壁碳纳米管。[0014]当使用羟基化多壁纳米管与反相色谱填料复配时，可有效实现多种真菌毒素的同时净化，可被同时净化的真菌毒素包括TeA、TEN、ALT、0TA、0TB、D0N、NIV、NE0、Fus-X、3-AcDON、15-AcD0N、DAS、HT-2、T-2、AFGi、AFG2、FBi、FB2、FB3、ZEN、ZAN、a-ZOL、β-ZOL、a-ZAL和β-ZAL0[0015]本发明使用羧基化多壁碳纳米管与反相色谱填料复配，可有效地实现多种真菌毒素的同时净化，可被同时净化的真菌毒素包括TeA、TEN、ALT、0TA、0TB、D0N、NIV、NE0、Fus_X、3-AcD0N、15-AcD0N、DAS、HT-2、T-2、AFBi、AFB2、AFGi、AFG2、FBi、FB2、FB3、ZEN、ZAN、a-ZOL、β-Z0L、a-ZAL和β-ZAL。本发明的固相萃取柱优选可同时实现上述27种真菌毒素同时净化，且回收率能满足欧盟法规要求。[0016]在本发明一个优选实施方式中，多壁碳纳米管和反相色谱填料的重量比为1:5〜1:40，进一步优选为1:10〜1:20。[0017]本发明的多壁碳纳米管可以市售购买，在本发明一个优选实施方式中，多壁碳纳米管的内径为3〜5nm，外径为8〜15nm，长度为10〜ΙΟΟμπι，优选为50μηι。[0018]在本发明一个优选实施方式中，本发明的反相色谱填料可以优选为：18,其主要成分为十八烷基键合硅胶，其粒径优选为40〜60μπι。[0019]当选用上述反相色谱填料与多壁碳纳米管复配时，可以实现上述15种真菌毒素同时净化。其中，多壁碳纳米管与反相色谱填料C18的重量比优选为1:10〜1:20,进而能满足涵盖六大类主要真菌毒素的检测需求。当选用上述反相色谱填料与羧基化多壁碳纳米管复配时，可以实现上述27种真菌毒素同时净化。[0020]在本发明一个优选实施方式中，本发明的反相色谱填料为HLB，其主要成分为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，其粒径优选为40-60μπι。[0021]在本发明一个优选实施方式中，为了提高净化效果，固相萃取柱包括混合均匀的羧基化多壁碳纳米管和反相色谱填料。[0022]在本发明的固相萃取柱中，还含有筛板，分别位于包含有混合均匀的羧基化多壁碳纳米管和反相色谱填料的复配填料的两边。[0023]其中，筛板优选为10〜30微米孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板。[0024]本发明还提供了上述固相萃取柱的制备方法，该方法包括:在筛板上加入包含有多壁碳纳米管和反相色谱填料的复配填料，在所述复配填料上加入一层筛板，压紧，即得上述固相萃取柱。具体可以为:先将多壁碳纳米管和反相色谱填料按照配比混合均匀得到复配填料，在筛板上加入混合好的复配填料，再加入一层筛板，压紧，即得上述固相萃取柱。[0025]本发明还提供了上述固相萃取柱在净化真菌毒素方面的应用。优选地是，在净化粮食真菌毒素方面的应用。[0026]在一个优选实施方式中，净化为真菌毒素穿漏法:将含真菌毒素的提取液直接加入该固相萃取柱，收集过柱后的流出液即可获得含有多种真菌毒素的样品溶液，提取液中的杂质被该固相萃取柱保留。其中，真菌毒素的提取液通常是将样品使用乙腈水提取后得到的提取液。[0027]其中，固相萃取柱与样本溶液的体积比优选为1:8〜1:50。[0028]所述检测是利用液相色谱串联质谱仪进行分析，通过多反应监测MRM方式进行准确定量。[0029]在上述应用中，可被同时净化的真菌毒素包括0^、见¥、呢0、？1^-乂、34〇0^、15-AcD0N、DAS、HT-2、T-2、ZEN、ZAN、α-Z0L、β-Z0L、α-ZAL和β-ZAL。进一步优选包括TeA、TEN、ALT、OTA、OTB、DON、NIV、NEO、Fus-X、3-AcD0N、15-AcD0N、DAS、ΗΤ-2、Τ-2、AFGi、AFG2、FBi、FB2、FB3、ZEN、ZAN、a-ZOL、β-ZOL、a-ZAL和β-ZAL。更进一步优选包括TeA、TEN、ALT、OTA、OTB、DON、NIV、ΝΕΟ、Fus-X、3-AcD0N、15-AcD0N、DAS、ΗΤ-2、Τ-2、AFBi、AFB2、AFGi、AFG2、FBi、FB2、FB3、ZEN、ZAN、a-ZOL、β-ZOL、a-ZAL和β-ZAL。且回收率均能满足欧盟法规要求。优选为食品和果蔬中的真菌毒素。[0030]本发明提供的固相萃取柱具有以下有益效果：[0031]1本发明提供的真菌毒素检测的固相萃取柱，适用于各种水果、蔬菜、粮食、饲料和食品样品，样品乙腈水提取后，可直接过柱，净化。与通用的固相萃取方法相比，此方法更加简便快捷、节省了样品处理的时间及成本、减少了有机溶剂的消耗量，使毒素检测的前处理更为方便、高效、标准。并且本发明的固相萃取柱可一次性对多种真菌毒素进行净化，而同类的Romer的固相萃取柱需分别对每一大类真菌毒素进行净化和分析，极大的节省了成本及分析时间。[0032]2本发明的基于一步净化原理的固相萃取柱制备步骤简单，不依赖特殊仪器，常规实验室内均可制备；实验流程较快，可批量对样品进行前处理，每批可同时处理30个，整个过柱过程不超过1小时。[0033]3本发明的多壁碳纳米管、C18和HLB填料都可以商品化得到，与现有的商品化固相柱相比，在保证净化效果的同时，大大节省了成本。[0034]4本发明提供的多种真菌毒素检测的固相萃取柱，首次采用具有大比表面积的纳米材料作为一步净化固相萃取柱的填充材料，用于对真菌毒素的净化。多壁碳纳米管对杂质具有很好的吸附性能，能够显著除去干扰杂质;C18和HLB为反相吸附剂，可有效去除粮食作物中的脂肪等非极性杂质。因此，两种填料复配可有效去除样本中的杂质，经处理后的样本十分干净，基质效应几乎全部去除;连续进样后灵敏度不会有明显变化，三重四级杆质谱仪的离子源仍保持干净。附图说明[0035]图1为根据本发明实施例1中净化真菌毒素的固相萃取柱的示意图，其中，1为柱管，2为筛板，3为弱阴离子色谱填料，4为反相色谱填料，5为筛板。具体实施方式[0036]下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。[0037]若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规技术手段。若未特别指明，实施例中所用的试剂为市售。[0038]其中，聚乙烯或聚四氟乙烯筛板的孔径在市场上购买时只能是范围值的孔径，如10〜30μπι，其平均孔径为22μπι，生产厂家为北京茨维特科技有限公司。[0039]羧基化多壁碳纳米管填料的内径为3〜5nm，外径为8〜15nm，长度为50μηι，生产厂家为北京茨维特科技有限公司。[0040]同样，反相色谱填料的粒径为40〜60μπι，其平均粒径为50μπι，生产厂家为北京茨维特科技有限公司。[0041]实施例1:固相萃取柱的原料及制备[0042]1、原料：[0043]1柱管:6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12·7mm;[0044]2筛板:10〜30μπι孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；[0045]⑶羧基化多壁碳纳米管填料:IOmg长度为50μπι羧基化多壁碳纳米管填料；[0046]⑷反相色谱填料:200mg粒径为40〜60μηι反相色谱填料Cis;[0047]2、组装方法具体见附图1[0048]先将羧基化多壁碳纳米管（附图1中的4和反相色谱填料附图1中的3按照一定比例混合均匀得到复配填料后，向聚丙烯或玻璃柱管（附图1中的1中先填入一片筛板附图1中的5，加入混合好的复配填料附图1中的3和4，再填入第二块筛板附图1中的2，压紧。[0049]实施例2:固相萃取柱的原料及制备[0050]1、原料[0051]1柱管:6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12·7mm;[0052]2筛板:10〜30μπι孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；[0053]⑶羧基化多壁碳纳米管填料:20mg长度为50μπι羧基化多壁碳纳米管填料；[0054]⑷反相色谱填料:200mg粒径为40〜60μηι反相色谱填料Cis;[0055]2、组装方法[0056]先将羧基化多壁碳纳米管和反相色谱填料按照一定比例混合均匀得到复配填料后，向聚丙烯或玻璃柱管中先填入一片筛板，加入混合好的复配填料，再填入第二块筛板，压紧。[0057]实施例3:固相萃取柱的原料及制备[0058]1、原料[0059]1柱管:6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12·7mm;[0060]2筛板:10〜30μπι孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；[0061]3羧基化多壁碳纳米管填料:20mg长度为50μπι羧基化多壁碳纳米管填料；[0062]⑷反相色谱填料:200mg粒径为40〜60μηι反相色谱填料HLB;[0063]2、组装方法[0064]先将羧基化多壁碳纳米管和反相色谱填料按照一定比例混合均匀得到复配填料后，向聚丙烯或玻璃柱管中先填入一片筛板，加入混合好的复配填料，再填入第二块筛板，压紧。[0065]实施例4:固相萃取柱的原料及制备[0066]1、原料[0067]1柱管:6mL的聚丙烯或玻璃柱管，内径12·7mm;[0068]2筛板:10〜30μπι孔径的聚乙烯或聚四氟乙烯筛板；[0069]⑶羟基化多壁碳纳米管填料:20mg长度为50μπι轻基化多壁碳纳米管填料；[0070]⑷反相色谱填料:200mg粒径为40〜60μηι反相色谱填料HLB;[0071]2、组装方法[0072]先将羟基化多壁碳纳米管和反相色谱填料按照一定比例混合均匀得到复配填料后，向聚丙烯或玻璃柱管中先填入一片筛板，加入混合好的复配填料，再填入第二块筛板，压紧。[0073]实施例5:真菌毒素的穿漏法[0074]1准确称取5.Og精确至0.Olg均质好的玉米样品在带盖的离心管中，加入25mL酸化乙腈溶液（乙腈含量84%，含1%甲酸），涡旋振荡2min后，150rmin常温振荡提取30min。然后在10000Xg下离心5min，收集上清液待净化。[0075]2取5mL上清液，自然通过固相萃取柱，收集过柱后的上清液，60°C下氮吹近干。[0076]3残渣用乙腈ImM的醋酸铵水溶液4060，vv溶解，过0.22μπι的滤膜后，过滤液即净化液待进样分析。[0077]实施例6:对实施例5的样品进行检测分析[0078]1、检测分析条件如下：[0079]1液相分离的条件为：色谱柱为WatersUPLCCORTECSC18柱（100mmX2.1mm,1.6μπι或与其性质类似的反相色谱柱，流动相为AImM醋酸铵水溶液和B甲醇。流速为0.3mLmin进行梯度洗脱，梯度洗脱条件如下表1所示：[0080]表1流动相梯度洗脱程序体积）[0083]2质谱条件：离子源模式:正负离子模式ESI+和ESI—;喷雾电压:2.5kvESI+和-0.8kvESD;气化温度:500°C;干燥气流速：12mLmin;进样体积为5yL;27种真菌毒素的质谱参数见表2。[0084]表2真菌毒素的质谱参数[0086]3真菌毒素固相萃取柱的重复性和变异系数：[0087]称取经测定空白试样5.Og，加入10L0Q的上述27种真菌毒素混合标准溶液，充分混匀，并于室温下静置2h，按照实施例5的方法进行前处理并测定含量，每个处理方法平行测定6份。[0088]2、所有真菌毒素的添加回收率和变异系数见表3。[0089]表3:27种真菌毒素的回收率及精密度[0091]注：“_”回收率低于10%[0092]由表3可以看出，本发明实施例1-4的固相萃取柱均可实现27种真菌毒素同时净化，且回收率能满足欧盟法规要求，经净化后的样品较干净，其中，本发明实施例1〜4中净化真菌毒素的固相萃取柱分别与mycosep™226固相萃取柱净化效果比较，实施例1〜4中固相相萃取柱的净化效果远优于进样小瓶中的液体为mycosep™226固相萃取柱净化效果。而只用多壁碳纳米管作为净化填料时，黄曲霉毒素BjPB2的回收率仅为57.4%〜57.6%，不能满足检测需求。同时α-ZOL的回收率也低于实施案例IAomer净化柱主要针对黄曲霉毒素的，由表3可以看出，4种黄曲霉毒素的回收率都较高，但与本发明的固相萃取柱相比，有8种真菌毒素的回收率低于10%，且NIV的回收率仅为62%，也不能满足欧盟法规要求。对于能满足法规要求的其他毒素，回收率也没有本发明的固相萃取柱效果好。[0093]最后，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

权利要求：1.一种净化真菌毒素的固相萃取柱，其特征在于，所述固相萃取柱包括多壁碳纳米管和反相色谱填料。2.根据权利要求1所述的固相萃取柱，其特征在于，所述多壁碳纳米管为羟基化多壁碳纳米管。3.根据权利要求1所述的固相萃取柱，其特征在于，所述多壁碳纳米管为羧基化多壁碳纳米管。4.根据权利要求1-3中任一项所述的固相萃取柱，其特征在于，所述多壁碳纳米管的内径为3〜5nm，外径为8〜15nm，长度为10〜ΙΟΟμπι，优选为50μηι〇5.根据权利要求1〜4中任一项所述的固相萃取柱，其特征在于，所述多壁碳纳米管和反相色谱填料的重量比为1:5〜1:40,优选为1:10〜1:20。6.根据权利要求1〜5中任一项所述的固相萃取柱，其特征在于，所述反相色谱填料为C18，其主要成分为十八烷基键合硅胶，其粒径优选为40〜60μπι。7.根据权利要求1〜5中任一项所述的固相萃取柱，其特征在于，所述反相色谱填料为HLB，其主要成分为N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，其粒径优选为40〜60μπι。8.根据权利要求1〜5中任一项所述的固相萃取柱，其特征在于，所述固相萃取柱包括混合均匀的多壁碳纳米管和反相色谱填料。9.一种制备权利要求1〜8中任一项所述的固相萃取柱的方法，其特征在于，包括以下步骤：在筛板上加入包含有多壁碳纳米管和反相色谱填料的复配填料，在所述复配填料上加入一层筛板，压紧，即得所述固相萃取柱。10.权利要求1〜8中任一项所述的固相萃取柱在净化真菌毒素方面的应用，其特征在于，所述固相萃取柱与样本溶液的体积比为1:8〜1:30。

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