申请/专利权人：广东海洋大学

申请日：2017-09-30

公开（公告）日：2021-01-05

公开（公告）号：CN107646764B

主分类号：A01K61/56(20170101)

分类号：A01K61/56(20170101);G01N30/02(20060101);G01N30/06(20060101)

优先权：

专利状态码：有效-授权

法律状态：2021.01.05#授权;2018.03.02#实质审查的生效;2018.02.02#公开

摘要：本发明涉及一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法及企鹅珍珠贝母贝色泽检测方法，所述育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法包括如下步骤：S1：将企鹅珍珠贝母贝从养殖海域取出，放于人工养殖池中暂养，投喂食物；S2：暂停投喂使其将食物消化完全；S3：向人工养殖池投放曲酸培养；S4：将企鹅珍珠贝母贝置于海水中静养后即可用于植核育珠。本发明提供的育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法可明显降低企鹅珍珠贝母贝的黑色素含量，存活率高，企鹅珍珠贝母贝外套膜中黑色素含量最高降低至0.08ugmg，降低了89.5%，可应用于大规模培育色泽奇异优质珍珠，具有广泛的应用前景。同时本发明提供的企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法可准确测定企鹅珍珠贝母贝的色素的含量，从而实现对企鹅珍珠贝母贝色泽的检测和监控。

主权项：1.一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1：将企鹅珍珠贝母贝从养殖海域取出，放于人工养殖池中暂养，投喂食物；S2：暂停投喂使其将食物消化完全；S3：向人工养殖池投放曲酸，培养；所述人工养殖池中曲酸浓度为1～10gL，培养时间为18h，或所述人工养殖池中曲酸浓度为10gL，培养时间为6～18h，或所述人工养殖池中曲酸浓度为10～100gL，培养6h；S4：将企鹅珍珠贝母贝置于海水中静养后即可用于植核育珠。

全文数据：一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法及企鹅珍珠贝母贝色泽检测方法技术领域[0001]本发明涉及企鹅珍珠贝培育领域，更具体地，涉及一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法及企鹅珍珠贝母贝色泽检测方法。背景技术[0002]珍珠的色泽是评判其价值的重要指标，珍珠的色泽主要由珍珠母贝分泌的珍珠质决定，而珍珠质主要由母贝的外套膜分泌，其色泽也主要取决于母贝所含色素的种类和含量。企鹳珍珠贝Pieriapenguin是培育大型优质海水珍珠的理想母贝，所产珍珠珠层厚、直径大，被产业界认为是我国“振兴南珠”最有潜力的品种。目前，企鹅珍珠贝种苗生产、成贝养殖到附壳珠的人工培育技术已基本成熟，专业化程度高、产业链完整。企鹅珍珠贝所产珍珠以黑色和古铜色的深色系列为主，高价值的金色、巧克力色、孔雀绿色及其他稀有色泽的珍珠比例较小。利用企鹅珍珠贝培育高品质稀有色泽珍珠成为珠宝界翘首以盼的事情。[0003]黑色素是生物色素中分布范围最广的色素之一，既不溶于水又不溶于大部分有机溶剂的。黑色素分为两种:真黑色素eumelanin和脱黑色素phemelanin，真黑色素使生物体呈现棕色一黑色，脱黑色素使生物体呈现黄色一红棕色。企鹅珍珠贝群体外壳为均一的黑色，其主要色素成分为真黑色素。采用添加外源化合物的方式，在植核前期抑制或增强企鹅珍珠贝母贝黑色素的表达水平，从而调控母贝及其所产珍珠的色泽，是获得壳色特异高品质珍珠的有效途径，能够在生产上缩短传统杂交育种的漫长周期，为良种选育和优质珍珠培育提供物质储备。目前，关于调控企鹅珍珠贝色泽的方法鲜有报道。[0004]因此，开发一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法具有重要的研究意义和应用价值。发明内容[0005]本发明的目的在于克服现有技术中企鹅珍珠贝稀有色泽较少的缺陷，提供一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法。本发明提供的方法可明显降低企鹅珍珠贝母贝的黑色素含量，可应用于大规模培育色泽奇异优质珍珠，具有广泛的应用前景。[0006]本发明的另一目的在于提供上述企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法。[0007]为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：SI:将企鹅珍珠贝母贝从养殖海域取出，放于人工养殖池中暂养，投喂食物；S2:暂停投喂使其将食物消化完全；S3:向人工养殖池投放曲酸，培养;所述人工养殖池中曲酸浓度为l~10gL，培养时间为18h，或所述人工养殖池中曲酸浓度为10gL，培养时间为6~18h，或所述人工养殖池中曲酸浓度为l〇~l〇〇gL，培养6h;S4:将企鹅珍珠贝母贝置于海水中静养后即可用于植核育珠。[0008]本发明的发明人发现曲酸是一种有效的企鹅珍珠贝母贝黑色素抑制剂，将其投放于企鹅珍珠贝母贝的人工养殖池中可有效的降低企鹅珍珠贝母贝的黑色素含量。本发明通过控制曲酸浓度和培养时间不仅可保证有效的降低企鹅珍珠贝母贝的色素含量，还可以避免曲酸对企鹅珍珠贝母贝存活的影响。[0009]优选地，Sl中投喂的食物为小球藻，暂养时间为1周以上。[0010]将企鹅珍珠贝母贝暂养一周以上可使得企鹅珍珠贝母贝完全适应人工养殖的环境。[0011]优选地，S2中暂停投喂的时间的2天。[0012]企鹅珍珠贝母贝内的食物大多是含有色素的，暂停投放食物可使得企鹅珍珠贝母贝内的食物被消化完全，体内色素不受食物的干扰。[0013]优选地，所述人工养殖池中曲酸浓度为IOgL，培养时间为18h。[0014]曲酸浓度为10gL、培养时间为18h时，既可确保企鹅珍珠贝黑色素含量显著下降，又不影响其存活率。[0015]—种企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法，所述方法包括如下步骤：SI:取企鹅珍珠贝母贝黑色素样品用甲醇水溶液溶解，过滤后得测试样品；S2:将测试样品注入LC-MS进行分析检测，其中，流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为为体积分数为0.1%的甲酸甲醇溶液;洗脱程序为0~6min，流动相A和B的比例为90%:10%;6〜8min，流动相B的比例为100%;8〜12min，流动相A和B的比例为90%:10%。[0016]本发明通过对流动相和洗脱程序的探索发现，在上述流动相组成和洗脱程序下可准确测定企鹅珍珠贝母贝的色素的含量，从而实现对企鹅珍珠贝母贝色泽的检测和监控。[0017]优选地，Sl中甲醇水溶液的体积分数为50%。[0018]优选地，S2中设置MRM调谐参数为:PDCA:母离子为155.98，产物离子为138.01，保留时间为2.9min;PTCA:母离子为199.99，产物离子为182.09，保留时间为4.〇11^11。[0019]通过对MRM调谐参数进行优选，特别是保留时间的优选，可使得检测结果更为精确。[0020]优选地，S2中流动相流速为0.2mlmin，进样体积为ΐομΐ。[0021]优选地，S2中色谱柱为WatersACQUITYUPLCHSSΤ3,柱温40°C。[0022]优选地，MS条件为:Xev〇TQD系统；电离模式：电喷雾离子源正离子模式;MRM多反应监测模式;毛细管电压：3.OkV;锥孔电压:30.0V;源温度：150°C;脱溶剂气温度:550°：;脱溶剂气：11001^11—1;锥孔气流速：501^11—1。[0023]优选地，Sl中企鹅珍珠贝黑色素样品通过如下制备方法得到：Sl:企鹅珍珠贝色素粗品的提炼:将企鹅珍珠贝外套膜套膜区组织处理成匀浆后，加入含木瓜蛋白酶的磷酸盐缓冲液，调节pH为7.0~7.5，搅拌，酶解，离心过滤弃上清液，溶剂提取、过滤、真空干燥得色素粗品；S2:企鹅珍珠贝母贝色素的氧化处理:取色素粗品，加入碱性溶液剂和双氧水于100±5°C下进行氧化处理，冷却后终止反应，调节pH至0.8〜1.2，离心取上清液;萃取得有机层，真空干燥得企鹅珍珠贝母贝黑色素样品。[0024]通过酶解反应可有效地将企鹅珍珠贝母贝外套膜套膜区组织中的色素提取出来。[0025]优选地，Sl中磷酸盐缓冲液与套膜区组织的用量比为15mLlg组织，木瓜蛋白酶的质量分数为2%以上，酶解温度为50~60°C，酶解时间为18〜24h。[0026]优选地，S2中碱性溶液为KKO3，所述KKO3的浓度为ImolL;所述双氧水的质量分数为3%;加入质量分数为10%的Na2SO3终止反应，所述K2C03、双氧水和Na2SO3与套膜区组织的用量比分别为8.6111]^1〇11^、0.8111]^1〇11^和0.4111]^1〇11^。[0027]与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明提供的育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法可明显降低企鹅珍珠贝母贝的黑色素含量，存活率高，企鹅珍珠贝母贝外套膜中黑色素含量最高降低至〇.〇8ugmg，降低了89.5%，可应用于大规模培育色泽奇异优质珍珠，具有广泛的应用前景。同时本发明提供的企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法可准确测定企鹅珍珠贝母贝的色素的含量，从而实现对企鹅珍珠贝母贝色泽的检测和监控。附图说明[0028]图1为不同浓度曲酸处理不同时间对企鹅珍珠贝母贝存活率的影响；图2为企鹅珍珠贝母贝外套膜色素粗品；图3为本发明提供的企鹅珍珠贝母贝色素HCA的MS图谱；图4为本发明提供的企鹅珍珠贝母贝色素PTCA的MS图谱；图5为黑色素含量标准曲线；图6为企鹅珍珠贝母贝色素LC-MS图谱，其中A为标准品;B为对照组;C为曲酸处理组实施例4。具体实施方式[0029]下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件;所使用的原料，试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。[0030]实施例1〜5和对比例1〜5育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法本实施例1〜5和对比例1〜5提供的育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法如下:将企鹅珍珠贝母贝从养殖海域取出，分为4个组于人工养殖池中暂养一周，期间投喂小球藻。处理前两天停止投喂，使其消化完全。分别向4个养殖池中投放曲酸，各组浸泡培养一定时间后，置于海水中继续培养3天。实施例1〜5和对比例1〜5中曲酸浓度及曲酸培养时间如下：表1实施例1〜5和对比例1〜5中曲酸浓度及曲酸培养时间企鹅珍珠贝母贝的色泽与存活率测定企鹅珍珠贝母贝经实施例1〜5和对比例1〜5中提供的方法处理后，进行色素含量测定，其结果如表2所示：lgL曲酸处理18h如实施例1即可对企鹅珍珠贝母贝色素合成产生了明显的抑制作用，外套膜中黑色素含量从〇.78ygmg将至0.67ygmg;当曲酸浓度为10gL和100gL时，作用6h、12h和18h时都可显著抑制黑色素含量，其抑制效果随曲酸浓度和作用时间增加而增加。其中，l〇gL曲酸处理18h和100gL曲酸处理18h的抑制效果最好，分别为0.08ygmg和0.02ygmg。这说明曲酸是一种有效的企鹳珍珠贝母贝黑色素抑制剂。[0031]为了确定曲酸处理在企鹅珍珠贝母贝育珠过程中的可行性，我们分析了曲酸对企鹅珍珠贝母贝存活率的影响。结果如表2和图1显示，在l~10gL的曲酸处理6h、12h和18h后，企鹅珍珠贝母贝的存活率都没有受到显著影响；当曲酸浓度为l〇〇gL时，处理6h未检测到对存活率有明显影响，但处理12h和18h后企鹅珍珠贝的存活率显著下降。这暗示着，l~10gL的曲酸对企鹅珍珠贝母贝是一种安全有效的色素抑制剂，曲酸浓度为100gL时对企鹅珍珠贝存在一定的毒性。因此确定曲酸使用的最佳浓度和时间为I〇gL处理18h。[0032]经以上处理的企鹅珍珠贝母贝实验室静养1天后，放回海域静养3天左右，可进行植核和育珠。这种在植核前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法，可应用于大规模培育色泽奇异优质珍珠，具有广泛的应用前景。[0033]表2实施例1〜5和对比例1〜4的企鹅珍珠贝母贝色素含量和存活率测定结果实施例6企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法对实施例1〜5和对比例1〜5提供的方法得到的企鹅珍珠贝母贝的色泽进行检测，具体操作如下：一、企鹅珍珠贝母贝色素粗品的提炼：1分别随机抽取5个个体，剪取外套膜的套膜区，称取适量处理前后的企鹅珍珠贝母贝外套膜套膜区组织，使用多功能均质器匀浆。[0034]2加入15mLlg组织ρΗ7·0-pH7.5的磷酸盐缓冲液，其中含2%木瓜蛋白酶质量分数），在磁力搅拌器上50~60°C搅拌酶解18〜24h。[0035]3酶解后，IOOOOrpm离心IOmin，弃上清液。[0036]4加入石油醚2mllg组织悬浮沉淀，IOOOOrpm离心IOmin，弃上清，重复3次。[0037]5加入无水乙醇（2mllg组织）悬浮沉淀，IOOOOrpm离心IOmin，弃上清，重复3次。[0038]6加入蒸馏水2mllg组织悬浮沉淀，IOOOOrpm离心IOmin，弃上清，重复3次，7将洗涤过后的沉淀物质真空干燥即可得到色素粗品（见图2。[0039]二、企鹅珍珠贝母贝色素的氧化处理1精密称取适量黑色素粗品，每10mg黑色素粗品按照加入以下体积各种试剂。加入8.6mLlmolLK2CO3和0.8mL3%H2O2进行氧化处理，100°C水浴孵育20~30min。[0040]2流水冷却至常温，加入0.4mL10%Na2SO3终止反应。[0041]3加入511^6111〇11!1：1调节口!1至0.8-1.2。[0042]49500离心IOmin,取上清液。[0043]5向上清液中加入70mL无水乙醚萃取，收集上层有机层，重复2次。[0044]6合并所有有机相，抽真空干燥后用50%甲醇水溶液VV复溶，0.45μπι有机膜过滤，准备注入LC-MS分析。[0045]三、将测试样品注入LC-MS进行分析检测IUPLC条件氧化后的样品用LC-MS检测，液相色谱条件是:色谱柱：WatersACQUITYUPLCHSSΤ32.1X50mm，1.7μπι，柱温40°C。流动相A为0.1%甲酸水溶液VV，流动相B为0.1%甲酸甲醇溶液VV。洗脱程序为0~5.9min，流动相A和B的比例为90%:10%;6.0~8min，流动相B的比例为100%;8.1〜12min，流动相A和B的比例恢复为90%:10%见表3。流速为0.2mlmin，进样体积为1〇μ1。[0046]表3色谱柱梯度洗脱程序⑵MS条件XevoTQD系统；电离模式：ESI+电喷雾离子源正离子模式）；MRM多反应监测模式；毛细管电压:3.OkV;锥孔电压：30.0V;源温度：150°C;脱溶剂气温度:550°C;脱溶剂气：1100Lh;锥孔气流速：50Lh。[0047]3LC-MSMS选择并优化了分析物的MRM离子对，如表4。[0048]表4分析物的MRM调谐参数和保留时间四、企鹅珍珠贝母贝色素含量测定1企鹅珍珠贝母贝色素的定性分析经对比例1提供的方法处理后的企鹅珍珠贝母贝的质谱检测结果如图3所示:mz:[M-ΗΓ准分子离子峰为155.97，与已知的HCAC6H5O4N1相对分子质量155相符，可判断该峰组分为HCA;如图4所示，mz:[M-Η]—准分子离子峰为199.92,与已知的PTCAC7H5O6N1相对分子质量197相符，可判断该峰组分为PTCA。[0049]2企鹅珍珠贝母贝色素的定量分析设置黑色素标准品浓度梯度，制备黑色素含量与LC-MS峰面积的标准曲线见图5和图6，计算各实施例和对比例测定的色素含量黑色素质量yg外套膜质量mg。[0050]表2中经各实施例和对比例中的方法处理后色素含量即通过本检测方法得到。

权利要求：1.一种育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：SI:将企鹅珍珠贝母贝从养殖海域取出，放于人工养殖池中暂养，投喂食物；S2:暂停投喂使其将食物消化完全；S3:向人工养殖池投放曲酸，培养;所述人工养殖池中曲酸浓度为1〜10gL，培养时间为18h，或所述人工养殖池中曲酸浓度为10gL，培养时间为6〜18h，或所述人工养殖池中曲酸浓度为10〜l〇〇gL，培养6h;S4:将企鹅珍珠贝母贝置于海水中静养后即可用于植核育珠。2.根据权利要求1所述育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法，其特征在于，Sl中投喂的食物为小球藻，暂养时间为1周以上。3.根据权利要求1所述育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法，其特征在于，S2中暂停投喂的时间的2天。4.根据权利要求1所述育珠前改变企鹅珍珠贝母贝色泽的方法，其特征在于，所述人工养殖池中曲酸浓度为I〇gL，培养时间为18h。5.—种权利要求1〜4任一所述企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：Sl:取企鹅珍珠贝母贝黑色素样品用甲醇水溶液溶解，过滤后得测试样品；S2:将测试样品注入LC-MS进行分析检测;其中，流动相A为体积分数为0.1%的甲酸水溶液，流动相B为为体积分数为0.1%的甲酸甲醇溶液;洗脱程序为0〜6min，流动相A和B的比例为90%:10%;6〜8min，流动相B的比例为100%;8〜12min，流动相A和B的比例为90%:10%。6.根据权利要求5所述企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法，其特征在于，S2中设置MRM调谐参数为:PDCA:母离子为155.98,产物离子为138.01，保留时间为2.9min;PTCA:母离子为199.99，产物离子为182.09，保留时间为4.Omin。7.根据权利要求5所述企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法，其特征在于，S2中流动相流速为0.2mlmin，进样体积为10μ1。8.根据权利要求5所述企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法，其特征在于，S2中色谱柱为WatersACQUITYUPLCHSSΤ3,柱温4TC。9.根据权利要求5所述企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法，其特征在于，S2中MS条件为：XevoTQD系统；电呙模式：电喷雾呙子源正呙子模式;MRM多反应监测模式；毛细管电压：3.OkV;锥孔电压：30.0V;源温度：150°C;脱溶剂气温度:550°C;脱溶剂气：1100L·h—S锥孔气流速：50L·h—1。10.根据权利要求5所述企鹅珍珠贝母贝色泽的检测方法，其特征在于，SI中企鹅珍珠贝母贝黑色素样品通过如下制备方法得到：SI:企鹅珍珠贝母贝色素粗品的提炼:将企鹅珍珠贝母贝外套膜套膜区组织处理成匀浆后，加入含木瓜蛋白酶的磷酸盐缓冲液，调节pH为7.0〜7.5，搅拌，酶解，离心过滤弃上清液，溶剂提取、过滤、真空干燥得色素粗品；S2:企鹅珍珠贝母贝色素的氧化处理:取色素粗品，加入碱性溶液和双氧水于100±5°C下进行氧化处理，冷却后终止反应，调节pH至0.8〜1.2，离心取上清液;萃取得有机层，真空干燥得企鹅珍珠贝母贝黑色素样品。

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