申请/专利权人：河北大学

申请日：2018-08-21

公开（公告）日：2021-01-05

公开（公告）号：CN109627264B

主分类号：C07F9/6561(20060101)

分类号：C07F9/6561(20060101);C09K11/06(20060101);G01N21/64(20060101)

优先权：

专利状态码：失效-未缴年费专利权终止

法律状态：2022.07.29#未缴年费专利权终止;2019.05.10#实质审查的生效;2019.04.16#公开

摘要：本发明公开了一种靶向线粒体苝酐荧光探针，所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C112H151O34N7P1S1，摩尔质量为2201.26gmol。本发明提供的靶向线粒体苝酐荧光探针易于进入细胞内，细胞上载率很高，细胞通透性很好，并没有产生细胞毒性，且具有高光稳定性；本发明还公开了靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，为靶向线粒体苝酐荧光探针的顺利合成提供理论及实践依据；本发明还公开了靶向线粒体苝酐荧光探针在监测活细胞中线粒体形态和数量的试剂中的应用。

主权项：1.一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其特征在于，其结构式为： 所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C112H151BrN7O34PS，摩尔质量为2279.89gmol。

全文数据：靶向线粒体苝酐荧光探针及其合成方法和应用技术领域本发明涉及功能高分子技术、分析化学和生物分析化学技术领域，特别涉及一种靶向线粒体苝酐荧光探针及其合成方法和应用。背景技术线粒体作为真核细胞中的能量转化细胞器，是细胞进行有氧呼吸的主要场所，参与众多的新陈代谢过程，并且具有独立的遗传体系，被称为细胞的“动力工厂”。线粒体在真核细胞中发挥着重要作用，例如，线粒体利用糖酵解，谷氨酰胺和脂肪酸来产生ATP以满足细胞的能量需求，此外，通过线粒体基质中的Ca2+浓度的调节和活性氧ROS的释放，线粒体被视为信号细胞器。线粒体功能异常与许多疾病密切相关，其功能缺失会导致糖尿病、衰老等疾病。因此，开发线粒体相关荧光探针以用于监测线粒体形态和数量对相关疾病的生物学研究和诊断是非常重要的。自线粒体被发现以来，就得到了科研人员的广泛关注，时至今日，线粒体依然是生命医学等领域的研究热点。对于活细胞器的成像，荧光分析与成像技术具有灵敏度高、分辨率高、选择性好、可实时监测、对生命体损伤小等优势在生物化学、医疗诊断等方面得到了广泛的研究和应用，可用来观察其他技术无法观察到的组织形态细节。且荧光探针具有标记简便、响应时间快等优点，因此，它已经成为探究线粒体形态微观结构和线粒体生命活动等领域的重要手段。近年来，已经开发了相当多的荧光染料来选择性地对线粒体基质进行染色，如罗丹明123、JC-1，这些荧光染料准确定位于线粒体并特异性识别活性小分子，为细胞的可视化和线粒体功能研究提供了可能。然而，就目前的线粒体荧光探针来看，多数探针都存在定位能力弱，光稳定性差，细胞毒性大，渗透性差等缺点。因此，开发性能良好的荧光探针仍然是一项艰巨的任务。发明内容本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其具有良好水溶性，并具有良好的线粒体靶向功能；本发明还有一个目的是提供一种靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，为靶向线粒体苝酐荧光探针的顺利合成提供理论及实践依据；本发明还有一个目的是提供一种靶向线粒体苝酐荧光探针在监测活细胞中线粒体形态和数量的试剂中的应用。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其特征在于，其结构式为：所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C112H151O34N7P1S1，摩尔质量为2201.26gmol。一种所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，所述靶向线粒体苝酐荧光探针的合成路线为：优选的是，化合物Ⅰ的合成方法为：将30.59mmol苝酐与98mL质量分数为98％的浓硫酸混合并室温搅拌反应12h获得反应液A；将1.15mmolI2加入反应液A中获得反应液B；将反应液B升温至85℃，并在2小时内向反应液B中连续匀速滴加液溴30.3mmol，，滴加完后，85℃下反应10h获得反应液C，将其浓缩并真空干燥以获得化合物Ⅰ。优选的是，化合物Ⅲ的合成方法为：将2.11mmol化合物Ⅰ与4.4mmol化合物Ⅱ混合获得反应液D；将8.65mmol醋酸溶于10mLN-甲基-2-吡咯烷酮中获得反应液E；在氮气保护条件下，将反应液E加入反应液D中回流反应1h，85℃油浴；停止反应，减压蒸出溶剂，真空干燥并分离提纯获得化合物Ⅲ。优选的是，化合物Ⅳ的合成方法为：将0.016mmol化合物Ⅲ和K2CO30.02mmol混合均匀获得反应液F；将0.043mmol醚脂苯硫酚加入反应液F中获得反应液G，之后用N-甲基-2-吡咯烷酮洗去反应液G中残留的醚脂苯硫酚；在氮气保护条件下，将反应液G在80℃油浴中反应5h反应液H；停止反应后，将反应液H在90℃减压抽出N-甲基-2-吡咯烷酮，之后90℃高温烘干反应液H获得化合物Ⅳ。优选的是，化合物V的合成方法为：将0.2538mmol的化合物Ⅳ溶解于0.5ml的二氯甲烷中获得反应液I；将反应液I与0.5ml三氟乙酸室温混合并搅拌均匀获得反应液J，将所述反应液J浓缩制备化合物V。优选的是，化合物Ⅵ的合成方法为：将0.0052mmol化合物V与2ml三氯甲烷混合后，冰浴20min获得反应液K；向反应液K中加入0.0104mmol的碳化二亚胺，冰浴30min后获得反应液L；撤去冰浴之后，向所述反应液L中依次加入0.0157mmol的2-氨基乙基三苯基溴化膦、0.0104mmol1-羟基苯并三唑和1ml三氯甲烷CHCl3后，在室温下搅拌混合均匀获得反应液M；将所述反应液M点板得化合物Ⅵ。一种所述的靶向线粒体苝酐荧光探针在监测活细胞中线粒体形态和数量的试剂中的应用。本发明至少包括以下有益效果：本发明提供的靶向线粒体苝酐荧光探针，利用苝酐具有优异光稳定性的特点，设计合成高光稳定性的靶向线粒体荧光探针，解决现有线粒体探针光稳定性差、背景复杂的问题；本发明提供的靶向线粒体苝酐荧光探针，选用生物友好的亲水性树状多肽PEO链作为水溶性致溶基团，在实现靶向线粒体苝酐荧光探针良好水溶性的同时，改善探针细胞相容性，同时，利用树状多肽PEO链容易通过细胞膜的性质，使靶向线粒体苝酐荧光探针能容易进入活细胞内；本发明提供的靶向线粒体苝酐荧光探针，选用三苯基膦阳离子作为细胞线粒体定位基团，利用膦正离子容易克服线粒体膜电势的特点，使靶向线粒体苝酐荧光探针容易进入线粒体内，并在线粒体内积累，解决普通荧光探针靶向性较差的问题。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。附图说明图1为本发明所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的紫外吸收图谱；图2为本发明所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的荧光图谱；图3为不同时间和浓度下所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的细胞相容性：Hela细胞；图4为不同时间和浓度下所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的细胞相容性：A549细胞；图5为所述的靶向线粒体苝酐荧光探针与MTG在Hela细胞线粒体内的共定位：a明场，bMTGλex＝488nm，λem＝500-600nm，c合成探针λex＝568nm，λem＝590-700nm，dMTG与合成探针合图；图6为不同浓度下探针在活细胞内的共聚焦荧光成像λex＝568nm，λem＝590-700nm；图7为本发明所述的靶向线粒体苝酐荧光探针在细胞内的共聚焦荧光成像照片，其中，以示出随着时间的延长各细胞中的荧光稳定性；图8为本发明所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的光稳定性曲线；图9为不同浓度下靶向线粒体苝酐荧光探针的荧光强度重叠图：a靶向线粒体苝酐荧光探针荧光强度分析；b靶向线粒体苝酐荧光探针灵敏度分析；图10为不同浓度的靶向线粒体苝酐荧光探针的细胞周期图像：a0μM，b5μM，c10μM，d20μM，e50μM，f100μM。具体实施方式下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。实施例1一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其特征在于，其结构式为：所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C112H151O34N7P1S1，摩尔质量为2201.26gmol。靶向线粒体苝酐荧光探针的光谱性质：为了研究探针的紫外可见吸收和荧光性质，将其溶于PBS，浓度为1×10-5molL，结果如图1和图2所示，靶向线粒体苝酐荧光探针的紫外最大吸收波长分别为532nm和534nm，荧光激发和发射波长为559nm和621nm，并测得荧光量子产率为43％。实施例2一种所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，所述靶向线粒体苝酐荧光探针的合成路线为：仪器和试剂合成中使用的所有化学品均为分析级试剂，并按原样使用。使用津岛RF-5301PC荧光分光光度计测定荧光光谱，使用津岛UV-3600型紫外可见分光光度计测定UV-Vis光谱。使用物镜×63Oil在LSM880共聚焦激光扫描显微镜上获取细胞的荧光图像。使用BDFACSCalibur流式细胞仪进行荧光分析和细胞周期分析。按照方案1中所示的合成方法有效合成化合物。化合物Ⅰ的合成称取苝酐12.00g,30.59mmol，量取98％浓硫酸98mL，加入到1000mL的双口瓶中，室温搅拌反应12h，称量I2293mg,1.15mmol加入反应体系，反应温度升至85℃，向反应体系滴加液溴2h滴加完，85℃反应10h。停止反应，降至室温，吹溴，将反应液缓慢滴入冰水中，F型砂芯抽滤，反复水洗至中性，真空干燥。化合物Ⅲ的合成称取化合物Ⅰ1.00g,2.11mmol和化合物Ⅱ3.02g,4.4mmol，加入100mL的双口瓶管中，将醋酸520mg,8.65mmol溶于10mLN-甲基-2-吡咯烷酮中加入反应体系，N2保护条件下，85℃油浴，回流反应1h。停止反应，减压蒸出溶剂，真空干燥。二氯甲烷乙醇＝12:1作淋洗剂，硅胶柱进行分离提纯。化合物Ⅳ的合成称取化合物Ⅲ30mg,0.016mmol和K2CO32.81mg,0.02mmol加入25mL的反应瓶中搅拌5min，将醚脂苯硫酚10.34mg,0.043mmol加入反应体系，并用N-甲基-2-吡咯烷酮洗去残留的醚脂苯硫酚，N2保护条件下，80℃中油浴反应5h。停止反应，90℃减压抽出NMP，90℃高温烘干4h。化合物V的合成将0.5mlDCM溶解的化合物Ⅳ500mg，02538mmol和0.5mlTFA在10ml锥形瓶中室温搅拌，回收核磁鉴定。化合物Ⅵ的合成将化合物V10mg，0.0052mmol，CHCl32ml加入10mL锥形瓶中，冰浴20min，加入EDCI1.99mg，0.0104mmol，冰浴30min，撤去冰浴加入2-氨基乙基三苯基溴化膦10mg，0.0157mmol和HOBT1.59mg，0.0104mmol，补加CHCl31ml，室温搅拌。点板，得反应产物。实施例3一种所述的靶向线粒体苝酐荧光探针在监测活细胞中线粒体形态和数量的试剂中的应用。细胞培养实验所用细胞为Hela细胞和A549细胞，采购于北京协和细胞资源中心，培养条件为含10％胎牛血清和1％双抗青霉素和链霉素的高糖DMEM培养液，培养环境为37℃，5％CO2的细胞培养箱。培养期间2天换一次培养液，当细胞密度达到80％时，用胰酶消化传代。细胞毒性将HeLa细胞、A549细胞以2×104个mL的密度接种于96孔板中，并在37℃，5％CO2气氛的培养箱中培养。待细胞贴壁且生长良好后，更换含有所述的靶向线粒体苝酐荧光探针0.2,1,5,25,100μM的新鲜培养液，180μl孔，设三个平行孔，并将加等体积培养液的空白孔作为对照，在37℃下培养24小时、48小时和72小时。之后每孔加入新鲜制备的MTT20μL，5mgmL溶液。在培养箱中孵育4小时后，移除培养液，每孔加入150μLDMSO，并用振荡器微震5min。通过酶标仪读取该板在540nm处的吸光度，并计算细胞存活率，如图3、图4所示，Hela细胞存活率均大于95％，A548细胞存活率均大于92％，可以证明该探针无细胞毒性。探针活细胞内成像研究共定位荧光成像：为评估探针的靶向线粒体能力，本申请人用商用染料MTG进行了细胞线粒体共定位实验，合成探针20μM和MTG1μM共同孵育细胞30min，用PBS缓冲液洗涤3次后共聚焦成像。测试条件为：合成探针：568nm激发，信号收集590nm-700nm。MTG：488nm激发，信号收集500-600nm。结果如图5所示，对合成与MTG的皮尔逊系数进行了分析，皮尔逊系数为0.88±0.01，证明该探针具有良好的靶向线粒体功能。之后，对探针的共定位评价，选择ROI区域进行分析，使用U检验进行统计学比较，可得三个检测成像的系数平均值，P＜0.05。探针活细胞内成像为了研究探针浓度与荧光强度的关系，利用激光扫描共聚焦显微镜进行成像。细胞用浓度为0,1,5,10,20,50,100μM的探针培养液孵育30min后，用PBS缓冲液洗涤3次后共聚焦成像，测试条件为：合成探针：568nm激发，信号收集590nm-700nm。结果如图6所示，由图可知，探针在细胞内发出较为强烈的荧光，且随着探针浓度增大，荧光强度逐渐增强。细胞内荧光稳定性实验为研究探针在细胞内的荧光稳定性，将合成探针10μM、MTG1μM孵育细胞30min后PBS洗三次，共聚焦显微镜成像，成像方式为持续扫描15min，如图7所示，由图可知，探针荧光强度衰减较弱，依然具有较为强烈的荧光，图8为细胞内荧光衰减曲线，荧光强度在15min内从86.28降至72.312，证明合成探针在细胞内具有良好的荧光稳定性。流式荧光分析为了进一步研究探针的荧光性质，用流式细胞仪对探针进行了荧光分析，实验中采用了两种不同的孵育方法处理细胞：共培育法：细胞消化后以4×105个ml的密度接种于六孔板上培养12h，次日更换浓度为0,0.1μM,0.2μM,0.5μM,1μM,5μM,10μM,20μM,50μM,100μM浓度探针的新鲜培养液，于培养箱中培养2h后，PBS洗涤、消化，1000r3min离心，PBS洗涤三次后重悬，流式细胞仪检测；孵育法：将细胞消化后，以1×106个ml分装于15ml离心管，分别更换0,0.1,0.2,0.5,1,5,10,20,50,100μM浓度的探针，室温避光孵育20min后，1000r3min离心，PBS洗涤三次后重悬，流式细胞仪检测。可得探针荧光强度与细胞数量关系如图S1、S2所示，共培育法荧光强度叠加后得图9其中，从左至右探针的浓度依次为0,0.1μM,0.2μM,0.5μM,1μM,5μM,10μM,20μM,50μM,100μM，并利用CellQuestPro软件分析图像，所得数据如下表1。由数据可知荧光强度随探针浓度的增大而增加，且探针灵敏度高，当探针浓度为0.1μM时，发光细胞数已经达到98.14％。说明该荧光探针极易进入细胞。表1荧光探针流式分析结果细胞周期分析为了进一步探究该探针对细胞周期的影响，用流式细胞仪进行细胞周期分析，采用共培育法处理细胞后，使用DNA检测试剂盒，在细胞中加入A液125μl，轻轻混匀，室温静置10min；加入B液100μl，轻轻混匀，室温静置10min；加入C液100μl，轻轻混匀，低温2-8℃避光静置10min，过膜，流式细胞仪检测。分析结果如图10所示，各时期细胞数量百分比如表S4所示，对数据进行统计学分析，计算显著性差异。得P0.05，没有显著性差异。说明不同浓度探针处理过的细胞，各个时期细胞内DNA倍体数量所占比例没有明显变化。由此表明，探针所述的靶向线粒体苝酐荧光探针对细胞周期没有影响。荧光探针对静止的小鼠脾细胞增殖能力的影响与对照组比较，不同浓度的合成探针对静止的小鼠脾淋巴细胞的作用与对照组相比均无显著性差异P0.05，该探针对正常小鼠的免疫功能没有影响表2。说明经过树状多肽修饰的苝酐探针对生物活体都没有影响，可以作为生物体内探针使用。表2不同浓度探针对脾淋巴细胞作用结论总之，我们将PEG链和三苯基膦结合到苝酰亚胺染料中，得到了靶向线粒体的荧光探针。PEG链使探针具有亲水性和优异的膜渗透性，亲脂性三苯基膦阳离子可实现在线粒体中的特异性定位。通过荧光成像研究表明该探针可以定位到线粒体上共定位系数为0.88±0.01，具有良好的细胞内荧光稳定性。并通过流式细胞仪证明所述的靶向线粒体苝酐荧光探针易于进入细胞、具有高灵敏度、对细胞周期没有影响。此外，该探针良好的生物相容性进一步表明合成探针在生物医学领域具有良好的应用前景。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。

权利要求：1.一种靶向线粒体苝酐荧光探针，其特征在于，其结构式为：所述靶向线粒体苝酐荧光探针的分子式为C112H151O34N7P1S1，摩尔质量为2201.26gmol。2.一种如权利要求1所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，其特征在于，所述靶向线粒体苝酐荧光探针的合成路线为：3.如权利要求2所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，其特征在于，化合物Ⅰ的合成方法为：将30.59mmol苝酐与98mL质量分数为98％的浓硫酸混合并室温搅拌反应12h获得反应液A；将1.15mmolI2加入反应液A中获得反应液B；将反应液B升温至85℃，并在2小时内向反应液B中连续匀速滴加液溴30.3mmol，滴加完后，85℃下反应10h获得反应液C，将其浓缩并真空干燥以获得化合物Ⅰ。4.如权利要求2所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，其特征在于，化合物Ⅲ的合成方法为：将2.11mmol化合物Ⅰ与4.4mmol化合物Ⅱ混合获得反应液D；将8.65mmol醋酸溶于10mLN-甲基-2-吡咯烷酮中获得反应液E；在氮气保护条件下，将反应液E加入反应液D中回流反应1h，85℃油浴；停止反应，减压蒸出溶剂，真空干燥并分离提纯获得化合物Ⅲ。5.如权利要求2所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，其特征在于，化合物Ⅳ的合成方法为：将0.016mmol化合物Ⅲ和K2CO30.02mmol混合均匀获得反应液F；将0.043mmol醚脂苯硫酚加入反应液F中获得反应液G，之后用N-甲基-2-吡咯烷酮洗去反应液G中残留的醚脂苯硫酚；在氮气保护条件下，将反应液G在80℃油浴中反应5h反应液H；停止反应后，将反应液H在90℃减压抽出N-甲基-2-吡咯烷酮，之后90℃高温烘干反应液H获得化合物Ⅳ。6.如权利要求2所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，其特征在于，化合物V的合成方法为：将0.2538mmol的化合物Ⅳ溶解于0.5ml的二氯甲烷中获得反应液I；将反应液I与0.5ml三氟乙酸室温混合并搅拌均匀获得反应液J，将所述反应液J浓缩制备化合物V。7.如权利要求2所述的靶向线粒体苝酐荧光探针的合成方法，其特征在于，化合物Ⅵ的合成方法为：将0.0052mmol化合物V与2ml三氯甲烷混合后，冰浴20min获得反应液K；向反应液K中加入0.0104mmol的碳化二亚胺，冰浴30min后获得反应液L；撤去冰浴之后，向所述反应液L中依次加入0.0157mmol的2-氨基乙基三苯基溴化膦、0.0104mmol1-羟基苯并三唑和1ml三氯甲烷CHCl3后，在室温下搅拌混合均匀获得反应液M；将所述反应液M点板得化合物Ⅵ。8.一种如权利要求1所述的靶向线粒体苝酐荧光探针在监测活细胞中线粒体形态和数量的试剂中的应用。

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